एपोप्टोसिस को प्रारंभिक और देर से एपोप्टोटिक बायोमार्कर के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा चिह्नित किया जा सकता है। सर्वाइकल कैंसर सेल लाइन, सिहा, का विश्लेषण बेंचटॉप फ्लो साइटोमीटर का उपयोग करके एक्टिनोमाइसिन डी के साथ उपचार के बाद एपोप्टोसिस बायोमार्कर के लिए किया गया था।
एपोप्टोसिस बायोमाकर्स की जांच एक बेंचटॉप फ्लो साइटोमीटर का उपयोग करके एक्टिनोमाइसिन डी-उपचारित सिहा गर्भाशय ग्रीवा कैंसर कोशिकाओं में की गई थी। एपोप्टोसिस के प्रारंभिक बायोमाकर्स (एनेक्सिन वी और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता) और देर से बायोमाकर्स (कैसपेस 3 और 7, और डीएनए क्षति) को प्रयोगात्मक और नियंत्रण संस्कृतियों में मापा गया था। संस्कृतियों को 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था। कोशिकाओं को तब ट्रिप्सिन का उपयोग करके अलग किया गया था और प्रवाह साइटोमेट्रिक सेल काउंट परख का उपयोग करके गणना की गई थी। कोशिकाओं को एनेक्सिन वी परख, एक माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रोकेमिकल ट्रांसमेम्ब्रेन संभावित परख, एक कैसपेस 3/7 परख और एक डीएनए क्षति परख का उपयोग करके एपोप्टोसिस के लिए विश्लेषण किया गया था। यह लेख एपोप्टोसिस और पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री का अवलोकन प्रदान करता है, और एसआईएचए कोशिकाओं के प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए प्रवाह साइटोमेट्रिक प्रोटोकॉल को विस्तृत करता है। परिणाम सकारात्मक, नकारात्मक और उप-इष्टतम प्रयोगात्मक डेटा का वर्णन करते हैं। इस विश्लेषणात्मक मंच का उपयोग करके एपोप्टोसिस के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण करने में व्याख्या और चेतावनी पर भी चर्चा की गई है। फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण एपोप्टोसिस के लिए प्रारंभिक और देर से बायोमार्कर का सटीक माप प्रदान करता है।
एपोप्टोसिस, टाइप 1 प्रोग्राम्ड सेल डेथ1 के रूप में वर्गीकृत, सेल प्रसार और सेल डेथ2 के बीच संतुलन सुनिश्चित करता है। एपोप्टोसिस मानव विकास के दौरान, चोट के बाद,और कैंसर जैसी बीमारियों की रोकथाम के लिए आवश्यक है। आंतरिक और बाह्य एपोप्टोटिक सेल डेथ सिग्नलिंग मार्ग4 अनुक्रमिक जैव रासायनिक और रूपात्मक इंट्रासेल्युलर परिवर्तन 2,5,6 का कारण बनता है। रूपात्मक एपोप्टोटिक विशेषताओं को माइक्रोस्कोपी द्वारा पहचाना जा सकता है, और जैव रासायनिक गड़बड़ी का विश्लेषण जैव रासायनिक परख द्वारा किया जा सकता है, जिसमें फ्लो साइटोमेट्री (एफसी)7 शामिल है।
एपोप्टोसिस की पहचान करने और संबंधित इंट्रासेल्युलर तंत्र को समझने के लिए फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण पिछलेदो दशकों में बढ़ गया है। एफसी एक वैज्ञानिक पद्धति है जो एक तरल पदार्थ में कोशिकाओं का विश्लेषण करती है जो एकल या बहु-चैनल लेजर (चित्रा 1)9,10,11 से गुजरती है। द्रव में कोशिकाओं को हाइड्रोडायनामिक फोकसिंग का उपयोग करके फ्लो साइटोमीटर की फ्लुइडिक्स प्रणाली द्वारा एक एकल फ़ाइल में केंद्रित किया जाता है। जैसे ही कोशिकाएं लेजर से गुजरती हैं, प्रकाश कोशिकाओं से बिखर जाता है या उत्सर्जित होता है। बिखरा हुआ प्रकाश आगे की दिशा (आगे स्कैटर) या साइड (साइड स्कैटर) की ओर हो सकता है और क्रमशः सेल के आकार, और सेल ग्रैन्यूलैरिटी या आंतरिक संरचनाओं के बारे में जानकारी प्रदान करता है।
इसके अलावा, फ्लोरोसेंट अभिकर्मक, जैसे फ्लोरोसेंट रंजक या फ्लोरोफोर के साथ लेबल किए गए एंटीबॉडी, विशिष्ट सतह या इंट्रासेल्युलर संरचनाओं या अणुओं का पता लगाते हैं। जब लेजर फ्लोरोफोरेस को उत्तेजित करता है, तो प्रकाश एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य पर उत्सर्जित होता है। डिटेक्टर – आमतौर पर फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब – सेल नमूनों से बिखरे और उत्सर्जित प्रकाश की मात्रा निर्धारित करते हैं। डिटेक्टर एक मात्रात्मक धारा का उत्पादन करते हैं जो प्रकाश स्कैटर और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के आनुपातिक है। इलेक्ट्रॉनिक आउटपुट को सेल आकार, सेल ग्रैन्यूलैरिटी और फ्लोरोफोरे-लेबल अणुओं के सापेक्ष सेल फ्लोरेसेंस 9,12,13 के आधार पर सेल आबादी की पहचान करने के लिए कंप्यूटिंग सॉफ्टवेयर द्वारा डिजिटल सिग्नल में परिवर्तित किया जाता है।
चित्रा 1: पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री के तकनीकी संचालन और वर्कफ़्लो का वर्णन करने वाला योजनाबद्ध। कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट अभिकर्मकों से दाग दिया जाता है और लेजर द्वारा जांच की जाती है। उत्पन्न प्रतिदीप्ति संकेतों का पता लगाया जाता है और उन्हें इलेक्ट्रॉनिक आउटपुट में परिवर्तित किया जाता है, जिसे कंप्यूटर सॉफ्टवेयर और सांख्यिकीय कार्यक्रमों द्वारा आगे डिजिटाइज़ और विश्लेषण किया जाता है। संक्षेप: एफएससी = फॉरवर्ड स्कैटर; एसएससी = साइड स्कैटर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
एफसी का उपयोग अनुसंधान और स्वास्थ्य निदान दोनों में किया जाता है। नेक्रोबायोलॉजी में एफसी के दो लक्ष्य कोशिका मृत्यु के आणविक और कार्यात्मक गुणों की व्याख्या और कोशिका मृत्युके विभिन्न तरीकों के भेदभाव 14,15,16,17,18 हैं। एफसी अनुप्रयोगों में सेल गणना, सेल आबादी की छंटाई, इम्यूनोफेनोटाइपिंग, बायोमार्कर डिटेक्शन (जैसे, एपोप्टोसिस बायोमार्कर), विषाक्तता अध्ययन और प्रोटीन इंजीनियरिंग12 शामिल हैं। इसके अलावा, एफसी को आमतौर पर स्वास्थ्य निदान के लिए लागू किया जाता है ताकि हेमेटोलॉजिकल विकृतियों वाले रोगियों के निदान और निगरानी में सहायता मिल सके। इंस्ट्रूमेंटेशन, फ्लोरोफोरे डिटेक्शन और डिटेक्टर सिस्टम में प्रगति व्यापक अनुसंधान अनुप्रयोगों के साथ इमेजिंग साइटोमेट्री, मास साइटोमेट्री और स्पेक्ट्रल साइटोमेट्री को शामिल करने के लिएएफसी अनुप्रयोगों का विस्तार कर रही है।
एपोप्टोसिस का प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण सेल स्वास्थ्य का आकलन करने में उपयोग की जाने वाली पारंपरिक तकनीकों पर लाभ प्रदान करता है। एफसी एपोप्टोसिस 3,5 का अनुमान लगाने के लिए एक हेटरोजेनस नमूने में कई एकल कोशिकाओं का तेजी से और पुन: विश्लेषण कर सकता है। व्यक्तिगत सेल आधार पर सेल फेनोटाइप्स पर मात्रात्मक जानकारी प्रदान करने और थोक विश्लेषण से बचने के लिए एफसी की क्षमता, पश्चिमी सोख्ता, एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट एसेस (ईएलआईएसए), फ्लोरोमेट्री और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री तकनीकों के लिए बेहतर संवेदनशीलता प्रदान करती है जो एपोप्टोसिस 8,19 के विश्लेषण में उपयोग की जाती हैं। इसके अलावा, पश्चिमी ब्लॉट्स और ईएलआईएसए के बोझिल और खराब प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मैनुअल चरणों के विपरीत एफसी विश्लेषण की सापेक्ष आसानी फायदेमंद है। एफसी का प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, सटीक और उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण इसलिए कैंसर अनुसंधानमें फायदेमंद है।
एफसी स्वस्थ और असामान्य एपोप्टोटिकसेल आबादी के लिए सेल चक्र मापदंडों के एक साथ विश्लेषण की भी अनुमति देता है। चूंकि एपोप्टोसिस एक गतिशील प्रक्रिया है, विभिन्न विधियां परिवर्तनीय परिणाम उत्पन्न कर सकती हैं और उस समय-बिंदु पर निर्भर होती हैं जिस पर कोशिकाओं कोकाटा जाता है। सेल फेनोटाइप के कई मापदंडों का एक साथ मात्रात्मक मूल्यांकन उच्च सटीकता के साथ मामूली उप-आबादी का पता लगाने की अनुमति देता है, उदाहरण के लिए, 0.01% की कम आवृत्ति वाले दुर्लभ सेल उपसमुच्चयका पता लगाया जा सकता है। मल्टी-पैरामीट्रिक एफसी विश्लेषण विशेष रूप से उपयोगी है क्योंकि एपोप्टोटिक मृत्यु एपोप्टोटिक निरंतरता के साथ विभिन्न बिंदुओं पर कोशिकाओं के साथ प्रारंभिक और देर से जैव रासायनिक परिवर्तनों के स्पेक्ट्रम के साथ होती है। उदाहरण के लिए, एपोप्टोटिक कोशिकाओं के एफसी विश्लेषण में एनेक्सिन वी और प्रोपिडियम आयोडाइड का उपयोग करके दोहरे धुंधलापन का उपयोग प्रारंभिक एपोप्टोटिक कोशिकाओं, देर से एपोप्टोटिक कोशिकाओं और मृत कोशिकाओंके वर्गीकरण को सक्षम बनाता है। कई चरणों में एपोप्टोसिस का सटीक पता लगाने से गलत वर्गीकरण और गलत-नकारात्मक परिणामों से बचा जा सकता है। इस प्रकार, एफसी द्वारा मल्टीपैरामीट्रिक विश्लेषण सेल फेनोटाइप का पता लगाने की समग्र विशिष्टता में सुधार करता है और मामूली आबादी के गलत वर्गीकरण से बचता है। इसके अलावा, एफसी द्वारा सेल सॉर्टिंग बाद के विश्लेषण के लिए उच्च शुद्धता के साथ सेल आबादी के अलगाव की अनुमति देताहै।
एफसी के नुकसान में निलंबन में कोशिकाओं का उपयोग शामिल है, जो ऊतक विश्लेषण में चुनौतीपूर्ण हो सकता है, क्योंकि कोशिकाओं में ऊतक के विघटन से सेलुलर फ़ंक्शन19 बदल सकता है। इसके अलावा, एफसी उपकरण सेटअप, डेटा विश्लेषण और परख रिपोर्ट के मानकीकरण की कमी से परिणाम19 में भिन्नता हो सकती है, जिससे एफसी ऑपरेटरों को प्रदर्शन करने और डेटा का विश्लेषण और रिपोर्ट करने के लिए बेहतर प्रशिक्षण की आवश्यकता पर जोर दिया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एपोप्टोटिक नाभिक से सच्चे एपोप्टोटिक मलबे को अलग करने के लिए एफसी की क्षमता की आवश्यकता होती है i) उचित अधिग्रहण सेटिंग्स, ii) एक द्विगुणित डीएनए शिखर की पहचान करने के लिए अंशांकन मोतियों का उपयोग, और iii) नकारात्मक और सकारात्मक सेल नियंत्रण जो सेल-विशिष्टहैं 3। इसके अलावा, मल्टीपैरामीट्रिक विश्लेषण डिटेक्टरों की संख्या से सीमित है, और कई फ्लोरोसेंट अभिकर्मकों25 का उपयोग करते समय गैर-विशिष्ट परिणामों और फ्लोरोसेंट उत्सर्जन के स्पिलओवर से बचने के लिए इष्टतम मुआवजा करने की आवश्यकता है। उपकरण और फ्लोरोफोरे प्रौद्योगिकी में प्रगति ने पैरामीटर का पता लगाने में 30 मापदंडों तक सुधार कियाहै।
एपोप्टोटिक सेल मृत्यु की पहचानहमेशा सरल नहीं होती है, और संवेदनशील और विशिष्ट बायोमार्कर पर विचार किया जाना चाहिए। कोशिका मृत्यु पर नामकरण समिति (एनसीसीडी) ने सिफारिश की है कि एपोप्टोसिस26 की प्रक्रिया का अध्ययन और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक से अधिक परख का उपयोग किया जाए। शास्त्रीय एपोप्टोटिक विशेषताओं26 के लिए माइक्रोस्कोपी विश्लेषण भी एपोप्टोसिस की पुष्टि करने और झूठे-सकारात्मकपरिणामों से बचने के लिए अनुशंसित है। चार कार्डिनल जैव रासायनिक विशेषताएं जो शुरुआती और देर से एपोप्टोटिक घटनाओं का विस्तार करती हैं, (1) कोशिका झिल्ली विषमता का नुकसान; (2) अपव्यय माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (त्रिभुज); (3) कैसपेस सक्रियण; और (4) डीएनए क्षति26.
प्रारंभिक एपोप्टोसिस के दौरान, फॉस्फेटिडिलसेरिन को बाहरी कोशिका झिल्ली 27 में बाहरी रूप दिया जाता है और एनेक्सीन वी फ्लोरोसेंटली द्वारा फाइकोएरिथ्रिन27,28,29 के साथ लेबल किया जा सकता है। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट डीएनए-बाइंडिंग डाई, 7-एमिनोएक्टिनोमाइसिन डी (7-एएडी) के साथ दोहरी धुंधलापन, जीवित, देर से एपोप्टोटिक और मृत कोशिकाओं को अलग करता है। इसलिए, शुरुआती-एपोप्टोटिक कोशिकाएं एनेक्सीन वी के लिए सकारात्मक और 7-एएडी के लिए नकारात्मक दाग लगाती हैं, देर से एपोप्टोटिक कोशिकाओं के विपरीत, जो दोनों रंगों के लिए सकारात्मक दागलगाती हैं।
आंतरिक एपोप्टोटिक संकेत माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता के अपव्यय को प्रेरित करते हैं ।. बाधित त्रिभुज माइटोकॉन्ड्रियल इंटरमेम्ब्रेन स्पेस से साइटोसोल 27,29,30 में प्रारंभिक प्रो-एपोप्टोटिक प्रोटीन की रिहाई का कारण बनता है। सकारात्मक रूप से चार्ज, लिपोफिलिक डाई, टेट्रामेथिलरोडामाइन एथिल एस्टर, टीएमआरई, और 7-एएडी के साथ दोहरे धुंधलापन द्वारा त्रिभुज में परिवर्तन का आकलन किया जा सकता है। टीएमआरई डाई बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया की आंतरिक झिल्ली के भीतर जमा होती है जब झिल्ली क्षमता अधिक होती है। विध्रुवीकृत माइटोकॉन्ड्रिया प्रतिदीप्ति में कमी का प्रदर्शन करते हैं। ध्रुवीकृत माइटोकॉन्ड्रिया (बरकरार माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली) के साथ जीवित कोशिकाएं टीएमआरई के लिए सकारात्मक और 7-एएडी के लिए नकारात्मक दाग देती हैं। विध्रुवीकृत माइटोकॉन्ड्रिया के साथ मृत कोशिकाएं टीएमआरई के लिए नकारात्मक और 7-एएडी31 के लिए सकारात्मक हैं।
कैसपेस इंट्रासेल्युलर प्रोटीज का एक परिवार है, जो सक्रिय होने पर, एपोप्टोसिस26,27 को संकेत और निष्पादित करता है। टर्मिनल निष्पादक कैसपेस (3,6,7) देर से एपोप्टोसिस 29,32,33 को प्रभावित करता है। कैसपेस -3 और -7 गतिविधियों को फ्लोरोसेंटली लेबल सब्सट्रेट द्वारा मापा जा सकता है, जो जब क्लीवर किया जाता है, तो डीएनए को बांधता है और एक फ्लोरोसेंट सिग्नल उत्सर्जित करता है। इसके अलावा, कोशिका झिल्ली अखंडता के लिए किसी भी समझौते का मूल्यांकन 7-एएडी के साथ धुंधला करके किया जा सकता है। एपोप्टोटिक कोशिकाएं डीएनए-बाइंडिंग डाई के लिए सकारात्मक दाग देती हैं लेकिन 7-एएडी के लिए नकारात्मक होती हैं। लेट-एपोप्टोटिक और मृत कोशिकाएं दोनों रंगों के लिए सकारात्मक दागलगाती हैं।
देर से एपोप्टोसिस को डीएनए क्षति27,29,35 की विशेषता है, जिसका मूल्यांकन फॉस्फोराइलेटेड एटैक्सिएटेलेंजिक्टेसिया उत्परिवर्तित किनेज (एटीएम) और हिस्टोन एच 2 ए.एक्स द्वारा किया जा सकता है। एक्स डीएनए क्षति निर्धारित कर सकता है। एटीएम और एच 2 ए दोनों का नकारात्मक पता लगाना। एक्स कोई डीएनए क्षति का संकेत नहीं देता है, जबकि दोनों रंगों का पता लगाने से डीएनए36 में डबल-स्ट्रैंड ब्रेक की उपस्थिति का संकेत मिलता है।
एक्टिनोमाइसिन डी एपोप्टोसिस का एक शक्तिशाली प्रेरक है और प्रतिलेखन औरअनुवाद घटनाओं को अवरुद्ध करने के लिए डीएनए से बंधकर कार्य करता है। इस अध्ययन का उद्देश्य एपोप्टोसिस के शुरुआती और अंतिम चरण के बायोमार्कर का विश्लेषण करके सिहा सेल लाइन में एक्टिनोमाइसिन डी द्वारा प्रेरित जैव रासायनिक एपोप्टोसिस का आकलन करना था। एपोप्टोसिस के चार जैव रासायनिक बायोमाकर्स ने एपोप्टोटिक कैस्केड में अनुक्रमिक चरणों का आकलन किया जिसमें कोशिका झिल्ली विषमता का नुकसान, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता में परिवर्तन, टर्मिनल कैसपेस की सक्रियता और डीएनए क्षति शामिल थी।
इस अध्ययन में, एफसी द्वारा विश्लेषण किए गए एक्टिनोमाइसिन डी-उपचारित सिहा कोशिकाओं ने एपोप्टोसिस के लिए महत्वपूर्ण प्रारंभिक और देर से बायोमार्कर का खुलासा किया। सेल की तैयारी, गणना और धुंधला करने के लिए उप-इष्टतम स्थितियों ने गलत परिणामों की पहचान की, एफसी प्रदर्शन करते समय निर्माता के निर्देशों के निकट पालन की आवश्यकता पर जोर दिया।
प्रारंभिक और देर से बायोमार्कर पहचान द्वारा एपोप्टोसिस का यह अध्ययन एपोप्टोसिस की जांच के लिए एनसीसीडी दिशानिर्देशों1 के अनुरूप है। एक्टिनोमाइसिन डी-उपचारित सिहा संस्कृतियों ने शुरुआती और देर से एपोप्टोटिक चरणों के लिए सकारात्मक बायोमार्कर का प्रदर्शन किया। पीआई परख और माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता परख से पता चला है कि एक्टिनोमाइसिन डी ने क्रमशः पीएस-फ्लिप पैटर्न और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संक्रमण के अपव्यय को प्रेरित किया। एक बार जब एपोप्टोटिक कोशिकाएं माइटोकॉन्ड्रियल गड़बड़ी से प्रेरित कोई वापसी के बिंदु तक पहुंच जाती हैं, तो टर्मिनल कैसपेस 3,7 सक्रिय होते हैं। इस अध्ययन में देखे गए टर्मिनल कैसपेस 3 और 7 की सक्रियता देर से चरण एपोप्टोसिस को इंगित करती है। इसके अलावा, टर्मिनल कैसपेस सक्रियण इंटरन्यूक्लियोसोमल डीएनए दरार और व्यापक डीएनए विखंडन का कारण बनता है, जिसे शास्त्रीय रूप से जेल वैद्युतकणसंचलन28,38 द्वारा देखे गए चरण-सीढ़ी पैटर्न के रूप में रिपोर्ट किया गया है।
एटीएम और एच 2 ए के साथ परमाणु क्षति। एक्स एफसी डीएनए क्षति परख ने डीएनए और कुल डीएनए क्षति में डबल-स्ट्रैंड ब्रेक दिखाया। इन परिणामों ने प्रयोगात्मक संस्कृतियों में शास्त्रीय डाउनस्ट्रीम कैसपेज़-प्रेरित एपोप्टोटिक परमाणु क्षति (कैरियोरहेक्सिस और कैरियोरिलिसिस) की पुष्टि की। इस प्रकार कई प्रवाह साइटोमेट्रिक बायोमाकर्स के उपयोग ने एपोप्टोसिस में अनुक्रमिक मल्टीस्टेज घटनाओं का पता लगाया और प्रारंभिक और देर से एपोप्टोटिक चरणों में सटीक और पुन: पहचान की गई सेल आबादी की पहचान की। ये निष्कर्ष मनुष्यों में कैंसर के उपचार में एक्टिनोमाइसिन डी की ज्ञात प्रो-एपोप्टोटिक विशेषताओं के अनुरूप हैं 37,39,40,41 और एपोप्टोसिस की जांच करने वाले एफसी सेल कल्चर प्रयोगों में सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक्टिनोमाइसिन डी के उपयोग का समर्थन करते हैं।
इस अध्ययन में सेल आबादी की गेटिंग को नकारात्मक माध्यम और विलायक नियंत्रणों द्वारा सूचित किया गया था, जिसने स्वस्थ कोशिकाओं से एपोप्टोटिक को अलग किया था। वैकल्पिक रूप से, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों की आबादी के मिश्रण का उपयोग सेल जनसंख्या गेट 7,9 सेट करने के लिए जीवित और एपोप्टोटिक सेल आबादी को परिभाषित करने के लिए भी किया जा सकता है। एक बार रोगग्रस्त और स्वस्थ सेलुलर राज्यों को परिभाषित और गेट किया जाता है, तो टेम्पलेट सेटिंग्स को बाद के सभी प्रयोगात्मक और नियंत्रण संस्कृतियों पर लागू किया जा सकता है।
झूठे परिणामों से बचने के लिए एफसी प्रोटोकॉल का सख्ती से पालन आवश्यक है। प्रोटोकॉल के अनुकूलन के दौरान, निम्नलिखित समस्याएं देखी गईं: (1) कम सेल एकाग्रता, (2) उच्च सेल एकाग्रता, (3) सेल क्लंपिंग, (4) लंबे समय तक धुंधलापन, और (5) खराब नमूना हैंडलिंग। अनुकूलित प्रोटोकॉल आवश्यकताओं के सख्त पालन से इन समस्याओं को रोका जा सकता है। यह सटीक डेटा प्राप्त करने के लिए एफसी के लिए पूर्व-विश्लेषणात्मक और विश्लेषणात्मक चरणों की महत्वपूर्ण प्रकृति पर जोर देता है। सेल की तैयारी के दौरान, ट्रिप्सिनाइजेशन, पाइपटिंग, सेंट्रीफ्यूजेशन और कमजोर पड़ने को देखभाल के साथ आयोजित किया जाना चाहिए। ओवर-ट्रिप्सिनाइजेशन और जोरदार पाइपिंग के परिणामस्वरूप क्रमशः कोशिकाओं के रासायनिक और यांत्रिक कतरनी हो सकते हैं। लंबे समय तक और उच्च गति सेंट्रीफ्यूजेशन के परिणामस्वरूप सेल टूटने और उच्च सेलुलर मलबे की गिनती हो सकती है। सेल घटनाओं के गलत अधिग्रहण को कम करने के लिए इष्टतम सेल एकाग्रता की आवश्यकता होती है। इसलिए, इष्टतम सेल एकाग्रता प्राप्त करने के लिए प्राथमिक सेल निलंबन को पतला किया जाना चाहिए।
इसके अलावा, नमूनों को संभालते समय, सेल क्लंपिंग और सेल विखंडन को रोकने के लिए देखभाल की जानी चाहिए और यह सुनिश्चित करना चाहिए कि विश्लेषण के दौरान कोशिकाएं निलंबन में रहें। सेल क्लंपिंग को रोकने के लिए नमूना हैंडलिंग एकल लामिनर सेल प्रवाह की अनुमति देता है, उपकरण के केशिका ट्यूबिंग के यांत्रिक अवरोध को रोकता है, और नकली बड़े सेल आकार इंडेक्स को रोकता है। एक और चेतावनी प्रकाश के खिलाफ संस्कृतियों की रक्षा कर रही है ताकि फोटो-ऑक्सीकरण से बचा जा सके और गलत-नकारात्मक परिणामों को रोकने के लिए परख में फ्लोरोफोर े के शमन को रोका जा सके। कोशिकाओं के धुंधला चरण और बाद के प्रसंस्करण चरणों में न्यूनतम प्रकाश जोखिम सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। इसके अलावा, लंबे समय तक इम्यूनोस्टेनिंग समय के परिणामस्वरूप गलत-सकारात्मक परिणाम हो सकते हैं क्योंकि प्रोटीन गैर-विशेष रूप से दागदार होते हैं। इसलिए, निर्माता-निर्धारित इनक्यूबेशन धुंधला अवधि का पालन महत्वपूर्ण है।
सारांश में, एफसी एपोप्टोसिस का सटीक रूप से पता लगा सकता है और सेल संस्कृति में शुरुआती और देर से एपोप्टोसिस बायोमार्कर के बीच भेदभाव कर सकता है। इसके अलावा, प्रौद्योगिकी में प्रगति ने सेल स्वास्थ्य और जटिल इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग मार्गों का अध्ययन करने के लिए गैर-विशेषज्ञ वैज्ञानिकों के लिए बेंचटॉप फ्लो साइटोमीटर के निर्माण को जन्म दिया है।
The authors have nothing to disclose.
अध्ययन को राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (एनआरएफ) और दक्षिण अफ्रीकी चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एसएएमआरसी) द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था। हम अमरूद म्यूज़ सेल विश्लेषक की खरीद के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य प्रयोगशाला सेवा (एनएचएलएस) को स्वीकार करना चाहते हैं। इस प्रकाशन के सभी आंकड़े Biorender.com के साथ बनाए गए थे।
6-well plates | Lasec | P1PLA044C-000006 | |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
DMEM | ThermoFisher | 41966052 | |
Glutamine | Sigma-Aldrich | P10-040500 | |
Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | |
Microcentrifuge tubes/Eppendorf | Merck | EP0030122208-200EA | |
Muse Annexin V kit | Merck | MCH100105 | |
Muse Caspase-3/7 kit | Merck | MCH100108 | |
Muse Count and Viability kit | Merck | MCH600103 | |
Muse DNA Damage kit | Merck | MCH200107 | |
Muse MitoPotential kit | Merck | MCH100110 | |
PBS Buffer | ThermoFisher | 70013065 | |
Pen-strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
SiHa cells | ATCC | CRL-1550 | |
T25 culture flasks | Sigma-Aldrich | C6231 | |
Trypsin | Pan Biotech | P10-040500 |