यह गर्भाशय लिम्फोइड कोशिकाओं को गर्भवती और गैर-गर्भवती चूहों दोनों से अलग करने की एक विधि है। इस विधि का उपयोग कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों जैसे कि FACS phenotyping, सेल सॉर्टिंग, कार्यात्मक assays, RNA-seq, और proteomics के लिए किया जा सकता है। यहां प्रोटोकॉल दर्शाता है कि प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा समूह 1 गर्भाशय जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं को फेनोटाइप कैसे किया जाए।
यहां वर्णित एक सरल विधि है और फेनोटाइप माउस समूह 1 गर्भाशय जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं (जी 1 यूआईएलसी) को प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा व्यक्तिगत गर्भवती गर्भाशय से अलग और फेनोटाइप किया गया है। प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि कई तुल्यकालिक बांधों को प्राप्त करने के लिए समय संभोग कैसे स्थापित किया जाए, गर्भवती गर्भाशय के यांत्रिक और एंजाइमेटिक पाचन, एकल-सेल निलंबन के दाग, और जी 1 यूआईएलसी को फेनोटाइप और भेदभाव करने के लिए एक एफएसीएस रणनीति। यद्यपि यह विधि अनिवार्य रूप से ऊतक के भीतर सेलुलर वितरण की स्थानिक जानकारी खो देती है, प्रोटोकॉल को यूआईएलसी विषमता, गर्भावस्था को प्रभावित करने वाले मातृ और भ्रूण कारकों, उनके जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल और उनके कार्यों को प्रभावित करने के लिए उनकी प्रतिक्रिया को निर्धारित करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया है।
यहां वर्णित व्यक्तिगत गर्भवती गर्भाशय से गर्भाशय जन्मजात लिम्फोसाइटों की उच्च उपज प्राप्त करने के लिए एक सरल विधि है। यह विधि प्रोटीन सतह अभिव्यक्ति और गर्भाशय जन्मजात लिम्फोसाइटों की कार्यक्षमता को संरक्षित करती है और यह FACS फेनोटाइपिंग, आरएनएसेक, प्रोटिओमिक्स या कार्यात्मक assays जैसे बाद के अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है। यहां, फोकस फ्लो साइटोमेट्री द्वारा समूह 1 यूआईएलसी के फेनोटाइपिंग पर है।
गर्भाशय तीन परतों से बना होता है: एंडोमेट्रियम, मायोमेट्रियम और पेरिमेट्रियम (चित्रा 1)। एंडोमेट्रियम म्यूकोसा है, जो गर्भाशय के लुमेन को अस्तर करता है। प्रोजेस्टेरोन, कॉर्पस ल्यूटियम द्वारा उत्पादित, एंडोमेट्रियम को डिसिडुआ में परिवर्तित करता है। मायोमेट्रियम चिकनी मांसपेशियों की दो परतों से बना होता है जो गर्भाशय की दीवार बनाते हैं। पेरिमेट्रियम सेरोसा है जो गर्भाशय को लपेटता है और इसे मेसोमेट्रियम नामक व्यापक स्नायुबंधन के माध्यम से पेरिटोनियम से जोड़ता है। गर्भाशय के एक क्रॉस-सेक्शन में, लुमेन के विपरीत भाग को मेसोमेट्रियल पक्ष कहा जाता है, जबकि लुमेन के करीब के हिस्से को एंटी-मेसोमेट्रियल साइड कहा जाता है। विभिन्न प्रकार के मातृ ल्यूकोसाइट्स एंडोमेट्रियम और डिसिडुआ को पॉप्युलेट करते हैं, जिसमें कई प्रकार की कोशिकाएं शामिल हैं, जहां जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाएं कोशिकाओं के विशाल बहुमत का प्रतिनिधित्व करती हैं। जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाएं (आईएलसी), मैक्रोफेज, डेंड्राइटिक कोशिकाएं (डीसी), साथ ही साथ सीडी 4 + और सीडी 8 + टी लिम्फोसाइट्स, नियामक टी कोशिकाएं (ट्रेग्स), और दुर्लभ बी कोशिकाएं, सभी गर्भावस्था के दौरान गर्भाशय के वातावरण के विनियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती हैं1,2। गर्भाशय में आईएलसी न केवल म्यूकोसा में पाए जाते हैं, बल्कि चूहों में मायोमेट्रियम में भी पाए जाते हैं। आईएलसी के सभी तीन समूहों सहित, गर्भाशय वास्तव में समूह 1 आईएलसी द्वारा सबसे घनी आबादी वाला अंग है। गर्भावस्था के दौरान गर्भाशय के ऊतकों के संरचनात्मक परिवर्तन के साथ, गर्भाशय ल्यूकोसाइट्स की संख्या और अनुपात भी बदल जाता है (समूह 1 यूआईएलसी सबसेट के प्रतिशत में भिन्नताओं के उदाहरण के लिए चित्रा 2 ए देखें)3,4।
जब चूहों को इस पेपर में संदर्भित किया जाता है, तो इनब्रीड प्रयोगशाला चूहों के C57BL / 6 तनाव का मतलब है। आउटब्रीड चूहों (उदाहरण के लिए, एनएमआरआई चूहों) का उपयोग अक्सर प्रजनन अनुसंधान में उनकी उच्च प्रजनन दर के कारण किया जाता है। हालांकि, लगातार परिणाम उत्पन्न करने के लिए इनब्रीड उपभेदों का उपयोग आवश्यक है, और इम्यूनोलॉजिस्ट की पसंदीदा आनुवंशिक पृष्ठभूमि C57BL / 6 है, जिसे B6 के रूप में भी जाना जाता है।
मध्य-गर्भ में बी 6 बांधों में गर्भाशय ल्यूकोसाइट्स का लगभग 30% जी 1 यूआईएलसी हैं, जिन्हें प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा व्यवहार्य CD45 + CD3-CD19-NK1.1 + NKp46 + कोशिकाओं (चित्रा 2B) के रूप में परिभाषित किया गया है: प्रो-एंजियोजेनिक ऊतक-निवासी एनके (TRNK), IFN-g पारंपरिक NK (cNK) का उत्पादन करता है, और uILC14,5। यूएनके कोशिकाओं का प्रतिशत मनुष्यों में भी अधिक है, जो पहली तिमाही में लगभग 70% तक पहुंच गया है। मानव और माउस यूएनके और यूआईएलसी 7, 8 के बीच अंतर की तुलना में अधिक समानताएं हैं। यद्यपि मतभेदों को ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है, लेकिन दो प्रजातियों पर उपलब्ध जानकारी को एकीकृत करना उपयोगी है। जब कोई मनुष्यों और प्रयोगशाला कृन्तकों में यूआईएलसी की जांच से प्राप्त जानकारी को जोड़ता है, तो यह स्पष्ट है कि एनके कोशिकाएं गर्भाशय के जीव विज्ञान के लिए आवश्यक होमोस्टेटिक परिवर्तनों में सहायता करती हैं, जिसमें धमनी अखंडता 9 और सर्पिल धमनी रीमॉडलिंग 10 के रखरखाव के साथ-साथ ट्रोफोब्लास्ट आक्रमण 11,12 शामिल हैं। वे रोगजनकों के खिलाफ रक्षा में विशिष्ट भूमिका निभाते हैं13,14। चूहों और चूहों में, आरोपण स्थल के चारों ओर decidua भरने के अलावा, एनके कोशिकाएं एक क्षणिक संरचना में बांधों के मायोमेट्रियम की दो मांसपेशियों की परतों के बीच जमा होती हैं, जिसे गर्भावस्था के मेसोमेट्रियल लिम्फोइड एग्रीगेट (एमएलएपी) 15 (चित्रा 1 बी) के रूप में जाना जाता है, जिसे अतीत में मेट्रियल ग्रंथि के रूप में भी जाना जाता है, जिसके कार्य की खोज अभी तक नहीं की गई है।
यहां वर्णित है कि यांत्रिक विभेदन और एंजाइमेटिक पाचन के संयोजन का उपयोग करके गर्भवती चूहों के गर्भाशय से लिम्फोसाइट्स को अलग करने के लिए प्रयोगशाला में उपयोग की जाने वाली विधि का एक विस्तृत प्रोटोकॉल है। जैसा कि पूरे गर्भाशय का उपयोग विधि में किया जाता है, गर्भावस्था के दौरान गर्भाशय से अलग किए गए लिम्फोसाइट्स निर्णायक और मायोमेट्रल कोशिकाओं का मिश्रण हैं। गर्भाशय की दीवार और इसके एमएलएपी से डिसिडुआ का आगे विच्छेदन संभव है, और इसे 16 से पहले वर्णित किया गया है। यहां वर्णित विधि को प्रोटीन सतह अभिव्यक्ति, सेलुलर कार्यक्षमता और व्यवहार्यता को संरक्षित करते हुए गर्भाशय लिम्फोसाइट्स प्राप्त करने के लिए विकसित किया गया था। परिणाम न्यूनतम अवशिष्ट सेलुलर मलबे के साथ एक एकल सेल निलंबन है और आमतौर पर गर्भवती गर्भाशय के लिए मध्य-गर्भावस्था (10.5 दिन) में 1-5 मिलियन कोशिकाओं से लेकर उपज होती है। इस विधि के अनुप्रयोगों में प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा फेनोटाइपिंग, बाद के ट्रांसक्रिप्टोमिक या प्रोटिओमिक अध्ययनों के लिए सेल सॉर्टिंग, इंट्रासेल्युलर साइटोकाइन उत्पादन, डीग्रेनुलेशन, ELISPOT या साइटोटॉक्सिक एसेस जैसे कार्यात्मक अध्ययन शामिल हैं। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल समूह 1 आईएलसी की पहचान करने पर केंद्रित है, लेकिन अन्य सेल प्रकारों जैसे कि अन्य आईएलसी, टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, डीसी, या एफएसीएस विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी पैनल के मामूली संशोधनों के साथ मैक्रोफेज के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य ऊतकों से कोशिकाओं को अलग करने और पूल किए गए गैर-गर्भवती यूटेरी के लिए भी किया जा सकता है।
विधि में इसके बाद चर्चा किए गए कई महत्वपूर्ण चरण शामिल हैं। पहला महत्वपूर्ण कदम कई तुल्यकालिक गर्भधारण प्राप्त करना है क्योंकि गर्भावस्था के माध्यम से ल्यूकोसाइट आबादी की सापेक्ष आवृत्ति में परिवर्तन होता है। एक ही गर्भावधि दिन में कई बांधहोने से या तो एक ही प्रयोगों में जैविक दोहराव या अलग-अलग बांधों से लिम्फोसाइट्स को पूल करने की अनुमति मिलती है ताकि डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक बड़ी संख्या प्राप्त की जा सके। समयबद्ध संभोग शोधकर्ता को 24 घंटे की अवधि के भीतर गर्भाधान को इंगित करने की अनुमति देता है। हालांकि चूहे लगभग 2.5 साल तक जीवित रहते हैं, वे 4-7 सप्ताह से 6-8 महीने की उम्र तक प्रजनन आयु के होंगे। जैसा कि छोटे चूहे आमतौर पर छोटे पिल्लों का उत्पादन करते हैं, मादा चूहों को आमतौर पर तब तक संभोग नहीं किया जाता है जब तक कि वे 6-8 सप्ताह के बीच न हों, और पुरुष चूहे जब तक कि वे 8-10 सप्ताह के बीच न हों। यह देखते हुए कि एस्ट्रस चूहों में लगभग 15 घंटे तक रहता है और हर 4-5 दिनों में होता है, विशिष्ट संभोग दर (योनि प्लग द्वारा प्रकट, चित्रा 4 देखें) लगभग 25% है। इसलिए एस्ट्रस में चूहों का उपयोग करना और किसी दिए गए प्रयोग के लिए आवश्यक संख्या में बांधों को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त संख्या की योजना बनाना महत्वपूर्ण है। एस्ट्रस चक्र चरण योनि स्मीयर cytology22 द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। संभोग से पहले पुरुषों को आराम 48 ज और Whitten effect18 का लाभ उठाकर प्लग दर में सुधार किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, कोई भी गर्भवती घोड़ी सीरम का प्रशासन कर सकता है, जो अंतर्जात कूप-उत्तेजक हार्मोन के प्रभाव की नकल करता है, ओसाइट परिपक्वता को प्रेरित करता है और, 42-50 घंटे बाद, मानव कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन, जो अंतर्जात ल्यूटिनाइजिंग हार्मोन के प्रभाव की नकल करता है, ओव्यूलेशन को प्रेरित करता है। यह हार्मोनल उपचार एस्ट्रस की आवश्यकता को दरकिनार करता है और लगभग सभी उपचारित महिलाओं को ग्रहणशील बनाता है।
एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम FACS धुंधला की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए है। प्रवाह साइटोमेट्री में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी को हमेशा इष्टतम एकाग्रता पर टिटरेट और उपयोग किया जाना चाहिए, और यह जांचना आवश्यक है कि एंजाइमेटिक पाचन महत्वपूर्ण एंटीजेनिक एपिटोप को बंद नहीं करता है। यह आकलन करने के लिए कि क्या एक एंजाइम एक एपिटोप को बंद कर देगा, एक समानांतर में एक ही नमूने के दो अंशों को दाग सकता है, एक एंजाइमेटिक और दूसरा यांत्रिक पाचन से गुजर रहा है। इसी तरह, विश्वसनीय डेटा प्राप्त करने के लिए उचित नियंत्रण और एकल दाग का उपयोग महत्वपूर्ण है। दुर्लभ घटनाओं के लिए, मोतियों का उपयोग एकल दाग के नमूने उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। वोल्टेज की स्थापना के लिए मोतियों का उपयोग न करने की सिफारिश की जाती है, बल्कि लिम्फोसाइट्स और अन्य ल्यूकोसाइट्स युक्त कोशिकाओं की आबादी, जैसे कि स्प्लेनोसाइट्स। यदि मोतियों का उपयोग किया जाता है, तो मनका धुंधला होने के लिए एंटीबॉडी को टाइटरेट करना आवश्यक है, इसलिए दाग वाले मोतियों की प्रतिदीप्ति तीव्रता कोशिकाओं की प्रतिदीप्ति तीव्रता के बराबर होगी। किसी विशेष मार्कर के लिए नकारात्मक कोशिकाओं से सकारात्मक को अलग करने में कठिनाई के मामले में, एक FMO नियंत्रण का उपयोग एक विशिष्ट मार्कर के लिए गेटिंग की सुविधा के लिए भी किया जा सकता है। इंट्रासेल्युलर मार्करों के मामले में, एक आइसोटाइप नियंत्रण का उपयोग किया जाना चाहिए क्योंकि इंट्रासेल्युलर स्टेनिंग के परिणामस्वरूप अवशिष्ट अनबाउंड एंटीबॉडी हो सकते हैं, जो धोने के चरणों के बाद कोशिकाओं के भीतर अभी भी मौजूद हो सकते हैं और इसलिए पृष्ठभूमि सिग्नल को बढ़ाते हैं। FACS विश्लेषण द्वारा फेनोटाइपिंग में सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं को ठीक करने के 24 घंटे के भीतर नमूनों को चलाने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि समय के साथ ऑटोफ्लोरेसेंस काफी बढ़ जाता है और समय के साथ कुछ एंटीबॉडी की प्रतिदीप्ति तीव्रता में गिरावट आ सकती है।
विचार करने के लिए एक और महत्वपूर्ण कारक प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त एकल-सेल निलंबन का डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग है। कार्यात्मक assays के लिए, बाँझ स्थितियों में काम करना आवश्यक है। इसी तरह, बाद के ओमिक्स अध्ययनों के लिए, बाँझ और RNase, DNase और प्रोटीज-मुक्त में काम करना महत्वपूर्ण है।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल फेनोटाइपिंग समूह 1 आईएलसी पर केंद्रित है, लेकिन एंटीबॉडी पैनल को संशोधित करके अन्य सेल प्रकारों को फेनोटाइप करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह अनुशंसा की जाती है कि एंजाइमेटिक उपचार द्वारा सतह एपिटोप के नुकसान / परिवर्तन का पता लगाने के लिए सभी एंटीबॉडी का पाचन और गैर-पचाए गए सेल निलंबन के खिलाफ परीक्षण किया जाता है। इसी तरह, ऊतक को पचाने और कोशिका उपज बढ़ाने के लिए विभिन्न एंजाइमों का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन महत्वपूर्ण एंटीजेनिक एपिटोप पर इसके प्रभाव का सावधानीपूर्वक अध्ययन किया जाना चाहिए। जबकि NKp46 प्लीहा एनके कोशिकाओं के लिए एक अच्छा मार्कर है और प्रयोगशाला चूहों के सभी उपभेदों में काम करता है, C57BL / 6 चूहों में uNK कोशिकाओं पर NKp46 की अभिव्यक्ति प्लीहा एनके कोशिकाओं की तुलना में काफी कम है। NK1.1 और NKp46 दोनों के लिए एक साथ दाग करना सबसे अच्छा है। यदि कई अंगों की सीधे तुलना की जानी है, तो सभी नमूनों को समान रूप से इलाज करने की सिफारिश की जाती है, भले ही प्लीहा या अस्थि मज्जा जैसे ऊतकों के लिए एंजाइमेटिक पाचन की आवश्यकता न हो। यद्यपि यहां प्रस्तुत विधि गैर-गर्भवती गर्भाशय पर लागू होती है, दो-चरण परकोल ग्रेडिएंट द्वारा लिम्फोसाइट रिंग अलगाव चुनौतीपूर्ण होगा, और अलग-अलग कोशिकाओं की उपज विश्वसनीय एफएसीएस विश्लेषण के लिए बहुत कम हो सकती है और इसलिए व्यक्तिगत, गैर-गर्भवती चूहों के गर्भाशय से अलग कोशिकाओं को एक साथ पूल करने की आवश्यकता होगी23।
डेटा की व्याख्या के लिए विचार करने के लिए प्रोटोकॉल की सीमाएं हैं। जैसा कि यह सभी ऊतकों के लिए मामला है, रक्त से आने वाले परिसंचारी लिम्फोसाइटों को ऊतक-निवासी कोशिकाओं के साथ अलग किया जाएगा। यदि परिसंचारी लिम्फोसाइट्स का बहिष्करण डेटा व्याख्या के लिए आवश्यक है, तो परिसंचारी कोशिकाओं को लेबल करने के लिए इंट्रावाइटल स्टेनिंग किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल की एक दूसरी सीमा यह है कि कुछ कोशिकाएं खो जाएंगी क्योंकि सभी कोशिकाओं को ऊतक से नहीं निकाला जा सकता है। सबसे आम समस्याओं और उनके समस्या निवारण तालिका 2 में प्रस्तुत किए गए हैं।
ऐतिहासिक रूप से, ऊतकों में कोशिकाओं के अध्ययन ने ऊतक वर्गों की हिस्टोलॉजिकल परीक्षा पर भरोसा किया है। सैंड्रा पील की उत्कृष्ट समीक्षा 24 80 के दशक के अंत तक 100 से अधिक वर्षों में किए गए काम को सारांशित करती है। बाद में यूएनके कोशिकाओं के रूप में जानी जाने वाली कोशिकाओं का विवरण वास्तव में लिम्फोसाइट्स की खोज से आधी शताब्दी से अधिक समय पहले प्रकाशित पांडुलिपियों में दिखाई देता है। इसलिए, 1975 में एनके कोशिकाओं की खोज से पहले, और यूएनके कोशिकाओं को मातृ ग्लाइकोजन कोशिकाओं या दानेदार मेट्रियल ग्रंथि कोशिकाओं के रूप में इंगित किया गया है। ऐनी क्रॉयड ने फील्ड 25 में प्रमुख योगदान दिया है और कृपया टीम को विच्छेदन सिखाया है जिसे उसने अनुकूलित किया था3, और वर्तमान में इसका उपयोग किया जाता है। यद्यपि यह यूएनके कोशिकाओं के आकृति विज्ञान और ऊतक स्थान का वर्णन करने में महत्वपूर्ण है, शास्त्रीय हिस्टोलॉजिकल परीक्षा ब्याज की कोशिकाओं पर केवल कुछ मार्करों का पता लगाने तक सीमित है। 2008 में, गर्भाशय लिम्फोसाइट्स पर कई मार्करों का एक साथ पता लगाने के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित विधि का वर्णन किया गया था26। यह अनिवार्य रूप से वह विधि है जिसे इस पेपर में वर्णित किया गया है। अधिक हाल की प्रौद्योगिकियों जैसे कि स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोमिक्स और बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री द्वारा इमेजिंग हिस्टोलॉजी और फ्लो-साइटोमेट्री की शक्ति को जोड़ती हैं, जिससे क्रमशः कई जीन या प्रोटीन का एक साथ पता लगाने और सामान्य ऊतक वास्तुकला के संरक्षण दोनों की अनुमति मिलती है।
यहां वर्णित विधि के अनुप्रयोग कई हैं और इसमें FACS phenotyping, कार्यात्मक परख (जैसे ELISPOT, degranulation या cytotoxic assays), सेल सॉर्टिंग, और बाद में ट्रांसक्रिप्टोमिक्स या प्रोटिओमिक्स शामिल हैं। इस विधि के आधार पर विकसित किए जा सकने वाले आगे के अनुप्रयोगों में नकारात्मक कमी द्वारा सेल सॉर्टिंग या संवर्धन के बाद निर्णायक एनके कोशिकाओं की संस्कृति और विस्तार शामिल है। वर्तमान में, माउस यूएनके कोशिकाओं को संस्कृति और विस्तारित करने के लिए कोई प्रोटोकॉल नहीं है और एक विस्तारित अवधि के लिए उनकी व्यवहार्यता और कार्यक्षमता को संरक्षित करता है, मानव एनके कोशिकाओं के समान फैशन में, जिन्हें आईएल -2 या एक संयोजन आईएल -12 और आईएल -15 के अलावा 7-14 दिनों के लिए खेती और विस्तारित किया जा सकता है। माउस uNK कोशिकाओं के लिए इस तरह की एक विधि का अनुकूलन कार्यात्मक assays प्रदर्शन करते समय अधिक लचीलापन प्रदान करेगा और कई स्थितियों के लिए एक उच्च सेल संख्या के साथ परीक्षण किया जा करने की अनुमति देगा। दूसरी ओर, संस्कृति की स्थिति लिम्फोसाइट्स के अद्वितीय फेनोटाइप और संभावित रूप से उनके कार्य को भी संशोधित करने के लिए जानी जाती है।
The authors have nothing to disclose.
हम पिछले और वर्तमान टीम के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं जिन्होंने इस विधि को विकसित करने में मदद की है, जिसमें जीन-मार्क डोइसने, नॉर्मन श्रीवे, इवा फिलिपोविक और अनीता क्वाल्स शामिल हैं। इस शोध को वेलकम ट्रस्ट [अनुदान संख्या 200841 / Z / 16 / Z ] और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (MR / P001092 / 1) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। खुली पहुंच के उद्देश्य के लिए, लेखक ने इस सबमिशन से उत्पन्न होने वाले किसी भी लेखक स्वीकृत पांडुलिपि संस्करण के लिए एक सीसी बाय पब्लिक कॉपीराइट लाइसेंस लागू किया है।
70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | |
BSA | Sigma | A9647-100G | |
CD19 antibody | BD | 562701 | |
CD3 antibody | BD | 562600 | |
CD45 antibody | BioLegend | 103108 | |
CD49a antibody | BD | 740262 | |
DNase I | Roche (Sigma) | 10104159001 | |
EOMES antibody | eBioscience | 12-4875-82 | |
Fc block Trustain fcx | BioLegend | 101320 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10217-106 | |
Fix/Perm buffer (part of BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit) | BD | 554714 | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Gibco | 14025092 | |
Liberase DH | Roche (Sigma) | 5401089001 | |
Lysis buffer Pharmlyse | BD | 555899 | |
NK1.1 antibody | BioLegend | 108739 | |
NKp46 antibody | BioLegend | 137608 | |
Paraformaldehyde 16% Solution (methanol-free) | Agar Scientific | AGR1026 | |
PBS 10x | Gibco | 14030-048 | |
PBS 1x (no Ca2+ or Mg2+) | Thermo Scientific | 14190144 | |
Percoll | VWR international | 17-0891-01 | |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
Pre-Separation filters | Miltenyi | 130-095-823 | |
RMPI-1640 medium + GlutaMAX | Gibco | 61870-010 | |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Scientific | 15575020 | |
Zombie Violet Fixable Viability dye | BioLegend | 423113 |