Dette er en metode for å isolere livmor lymfoide celler fra både gravide og ikke-gravide mus. Denne metoden kan brukes til flere nedstrømsprogrammer som FACS-fenotyping, cellesortering, funksjonelle analyser, RNA-seq og proteomikk. Protokollen her demonstrerer hvordan fenotype gruppe 1 livmor medfødte lymfoide celler ved strømning cytometri.
Beskrevet her er en enkel metode for å isolere og fenotype musegruppe 1 livmor medfødte lymfoide celler (g1 uILCs) fra individuell gravid livmor ved strømning cytometri. Protokollen beskriver hvordan du setter opp tidsparring for å oppnå flere synkrone dammer, den mekaniske og enzymatiske fordøyelsen av den gravide livmoren, farging av encellede suspensjoner og en FACS-strategi for fenotype og diskriminere g1 uILCs. Selv om denne metoden uunngåelig mister den romlige informasjonen om cellulær distribusjon i vevet, har protokollen blitt brukt til å bestemme uILC-heterogenitet, deres respons på mors- og fosterfaktorer som påvirker graviditet, deres genuttrykksprofil og deres funksjoner.
Beskrevet her er en enkel metode for å oppnå et høyt utbytte av livmor medfødte lymfocytter fra individuell gravid livmor. Denne metoden bevarer proteinoverflateuttrykk og funksjonalitet av livmor medfødte lymfocytter, og den er egnet for etterfølgende applikasjoner som FACS fenotyping, RNAseq, proteomikk eller funksjonelle analyser. Her er fokuset på fenotyping av gruppe 1 uILCs ved flowcytometri.
Livmoren består av tre lag: endometrium, myometrium og perimetrium (figur 1). Endometrium er slimhinnen, fôrer livmorens lumen. Progesteron, produsert av corpus luteum, konverterer endometrium til decidua. Myometrium består av to lag med glatt muskel som utgjør livmorveggen. Perimetrium er serosa som pakker livmoren og forbinder den til bukhinnen gjennom det brede ligamentet kalt mesometrium. I et tverrsnitt av livmoren kalles delen motsatt lumen den mesometriale siden, mens delen nær lumen kalles anti-mesometrial side. En rekke mors leukocytter fyller endometrium og decidua, inkludert flere typer celler, hvor de medfødte immuncellene representerer de aller fleste celler. Medfødte lymfoide celler (ILCs), makrofager, dendritiske celler (DC), samt CD4 + og CD8 + T lymfocytter, regulatoriske T-celler (Tregs) og sjeldne B-celler, kan alle spille viktige roller i reguleringen av livmormiljøet gjennom graviditet1,2. ILCer i livmoren finnes ikke bare i slimhinnen, men også i myometrium hos mus. Inkludert alle tre gruppene av ILCer, livmor er faktisk orgelet tettest befolket av gruppe 1 ILCer. Med den strukturelle transformasjonen av livmorvev gjennom svangerskapet endres også antallet og andelen livmor leukocytter (se figur 2A for et eksempel på variasjoner i prosentandelen av gruppe 1 uILC-delsett)3,4.
Når mus refereres til i dette papiret, er C57BL /6-stammen av innavlede laboratoriemus ment. Utrangerte mus (f.eks. NMRI-mus) brukes ofte i reproduktiv forskning på grunn av deres høye reproduksjonshastighet. Imidlertid er bruk av innavlsstammer nødvendig for å generere konsistente resultater, og immunologens favoritt genetiske bakgrunn er C57BL / 6, også kjent som B6.
Omtrent 30% av livmor leukocytter i B6 dammer ved midten av svangerskapet er g1 uILCs, som er definert av flowcytometri som levedyktig CD45+CD3-CD19-NK1.1+NKp46+-celler (figur 2B): pro-angiogen vevsresident NK (trNK), IFN-g som produserer konvensjonell NK (cNK) og uILC14,5. Prosentandelen av uNK-celler er enda høyere hos mennesker, og når ca 70% i første trimester6. Det er flere likheter enn forskjeller mellom menneske og mus uNK og uILC7,8. Selv om det er viktig å huske på forskjellene, er det nyttig å integrere informasjon som er tilgjengelig på de to artene. Når man kombinerer informasjon hentet fra å undersøke uILC hos mennesker og laboratoriegnagere, er det klart at NK-celler hjelper til med homeostatiske endringer som er avgjørende for livmorens biologi, inkludert vedlikehold av arteriell integritet9 og spiralarterieoppussing10, samt trofoblalastinvasjon11,12. De spiller også spesifikke roller i forsvaret mot patogener13,14. Hos mus og rotter, foruten å fylle decidua rundt implantasjonsstedet, akkumuleres NK-celler mellom de to muskellagene i myometriumet av dammer i en forbigående struktur kjent som Mesometrial Lymphoid Aggregate of pregnancy (MLAp)15 (Figur 1B), også kjent tidligere som metrialkjertelen, hvis funksjon ennå ikke er oppdaget.
Beskrevet her er en detaljert protokoll av metoden som brukes i laboratoriet for å isolere lymfocytter fra livmoren til gravide mus ved hjelp av en kombinasjon av mekanisk disaggregation og enzymatisk fordøyelse. Siden hele livmoren brukes i metoden, er lymfocytter isolert fra livmoren under svangerskapet en blanding av løvceller og myometrieceller. Videre disseksjon av decidua fra livmorveggen og mlap er mulig, og det har blitt beskrevet før16. Metoden beskrevet her ble utviklet for å oppnå livmor lymfocytter samtidig bevare protein overflateuttrykk, cellulær funksjonalitet og levedyktighet. Utfallet er en enkeltcellet suspensjon med minimal gjenværende cellulært rusk og et utbytte som vanligvis spenner fra 1-5 millioner celler ved midten av svangerskapet (10,5 dager) for en gravid livmor. Anvendelsen av denne metoden omfatter fenotyping ved strømningscytometri, cellesortering for etterfølgende transkripsjons- eller proteomiske studier, funksjonelle studier som intracellulær cytokinproduksjon, degranulering, ELISPOT eller cytotoksiske analyser. Protokollen som presenteres her fokuserer på å identifisere gruppe 1 ILCer, men kan tilpasses andre celletyper som andre ILCer, T-celler, B-celler, DC eller makrofager med mindre modifikasjoner av antistoffpanelet som brukes til FACS-analyse. Protokollen kan også brukes til å isolere celler fra andre vev og for samlet ikke-gravid uteri.
Metoden inneholder flere kritiske trinn som er diskutert heretter. Det første kritiske trinnet er å oppnå flere synkrone graviditeter som den relative frekvensen av leukocyttpopulasjoner endres gjennom graviditet. Å ha flere demninger på samme svangerskapsdag tillater enten biologiske repetisjoner i de samme forsøkene eller sammenslåing av lymfocytter fra individuelle dammer for å oppnå større antall som kreves for nedstrøms applikasjoner. Tidsbetimet parring gjør det mulig for forskeren å finne unnfangelse innen en 24 timers periode. Selv om mus lever i rundt 2,5 år, vil de være av reproduktiv alder fra 4-7 uker til 6-8 måneder. Ettersom yngre mus vanligvis produserer mindre valper, blir kvinnelige mus generelt ikke parret før de er mellom 6-8 uker, og mannlige mus til de er mellom 8-10 uker. Gitt at østrus varer ca 15 h hos mus og forekommer hver 4-5 dager, er den typiske parringsraten (avslørt av en vaginal plugg, se figur 4) rundt 25%. Det er derfor viktig å bruke mus i østrus og planlegge tilstrekkelig antall for å oppnå det nødvendige antall dammer for et gitt eksperiment. Østrus syklus fase kan bestemmes av vaginal smør cytologi22. Plugghastigheten kan forbedres ved å hvile menn 48 timer før parring og ved å dra nytte av Whitten-effekten18. Alternativt kan man administrere gravid mare serum, som etterligner effekten av den endogene follikkelstimulerende hormonet, indusere oocytt modning og, 42-50 h senere, menneskelig chorionic gonadotropin, som etterligner effekten av den endogene luteiniserende hormon, induserende eggløsning. Denne hormonelle behandlingen omgår kravet til østrus og gjør nesten alle behandlede kvinner mottakelige.
Et annet kritisk skritt er å sikre kvaliteten på FACS-fargingen. Antistoffer som brukes i strømningscytometri må alltid titreres og brukes ved optimal konsentrasjon, og det er nødvendig å kontrollere at den enzymatiske fordøyelsen ikke cleave avgjørende antigene epitoper. For å vurdere om et enzym vil spalte en epitop, kan man flekke to brøkdeler av samme prøve parallelt, den ene gjennomgår enzymatisk og den andre mekaniske fordøyelsen. På samme måte er bruk av passende kontroller og enkeltflekker avgjørende for å oppnå pålitelige data. For sjeldne hendelser kan perler brukes til å generere enkeltflekkprøver. Det anbefales ikke å bruke perler for å sette opp spenninger, men snarere en populasjon av celler som inneholder lymfocytter og andre leukocytter, for eksempel splenocytter. Hvis perler brukes, er det nødvendig å titrate antistoffer for perlefarging, slik at fluorescensintensiteten til fargede perler vil være sammenlignbar med fluorescensintensiteten til celler. Ved vanskeligheter med å skille positivt fra negative celler for en bestemt markør, kan en FMO-kontroll også brukes til å lette gatingen for en bestemt markør. Når det gjelder intracellulære markører, må en isotypekontroll brukes som intracellulær farging kan føre til gjenværende ubundne antistoffer, som fortsatt kan være til stede i celler etter vasketrinnene og dermed øke bakgrunnssignalet. Det anbefales å kjøre prøvene innen 24 timer etter å ha fikset cellene for å oppnå de beste resultatene i fenotyping ved FACS-analyse, da autofluorescens øker betydelig over tid, og fluorescensintensiteten til noen antistoffer kan avta over tid.
En annen avgjørende faktor å vurdere er nedstrøms anvendelsen av encellet suspensjon oppnådd med protokollen. For funksjonelle analyser er det viktig å jobbe i sterile forhold. På samme måte, for etterfølgende omics-studier, er det viktig å jobbe i steril og RNase, DNase og proteasefri.
Protokollen som presenteres her fokuserer på fenotyping gruppe 1 ILCer, men kan tilpasses for fenotyping av andre celletyper ved å modifisere antistoffpanelet. Det anbefales at alle antistoffer testes mot fordøyd og ikke-fordøyd cellefjæring for å oppdage tap /endring av overflateepiller ved enzymatisk behandling. På samme måte kan forskjellige enzymer brukes til å fordøye vevet og øke celleutbyttet, men effekten på viktige antigene epitoper må studeres nøye. Mens NKp46 er en god markør for spleniske NK-celler og fungerer i alle stammer av laboratoriemus, er uttrykket av NKp46 på uNK-celler i C57BL / 6 mus betydelig lavere enn på milt NK-celler. Det er best å flekke for både NK1.1 og NKp46 samtidig. Hvis flere organer skal sammenlignes direkte, anbefales det å behandle alle prøver likt, selv om den enzymatiske fordøyelsen ikke er nødvendig for vev som milten eller benmargen. Selv om metoden som presenteres her gjelder for den ikke-gravide livmoren, vil lymfocyttringens isolasjon av en tofaset Percoll-gradient være utfordrende, og utbyttet av isolerte celler kan være for lavt for pålitelig FACS-analyse og vil derfor kreve å samle celler isolert fra livmoren til individuelle, ikke-gravide mus23.
Det er begrensninger i protokollen å vurdere for tolkningen av dataene. Som det er tilfelle for alle vev, vil sirkulerende lymfocytter som kommer fra blodet bli isolert sammen med vevsboende celler. Hvis utelukkelse av sirkulerende lymfocytter er avgjørende for datatolkning, kan intravital farging utføres for å merke sirkulerende celler. Videre er en annen begrensning i protokollen at noen celler vil gå tapt, da ikke alle celler kan trekkes ut av vevet. De vanligste problemene og feilsøkingen vises i tabell 2.
Historisk har studiet av celler i vev stolt på histologisk undersøkelse av vevsseksjoner. Sandra Peels utmerkede gjennomgang24 oppsummerer arbeidet som er gjort over mer enn 100 år frem til slutten av 80-tallet. Beskrivelser av celler senere kjent som uNK-celler vises faktisk i manuskripter publisert mer enn et halvt århundre før lymfocytter til og med ble oppdaget. Så, før oppdagelsen av NK-celler i 1975, og uNK-cellene har blitt indikert som mors glykogenceller eller granulerte metriale kjertelceller. Anne Croy har gjort store bidrag på feltet25 og har lært teamet disseksjonen hun hadde optimalisert3, og som brukes for tiden. Selv om det er medvirkende til å beskrive morfologien og vevsplasseringen til uNK-celler, er klassisk histologisk undersøkelse begrenset til påvisning av bare noen få markører på cellene av interesse. I 2008 ble en strømningscytometribasert metode for samtidig å oppdage flere markører på livmorlymfocytter beskrevet26. Dette er egentlig metoden som er beskrevet i dette dokumentet. Nyere teknologier som romlig transkripsjon og avbildning ved massecytometri kombinerer kraften i histologi og strømningscytometri, slik at både samtidig deteksjon av flere gener eller proteiner, henholdsvis, og bevaring av den normale vevsarkitekturen.
Anvendelsen av metoden som er beskrevet her er flere og inkluderer FACS-fenotyping, funksjonell analyse (for eksempel ELISPOT, deriangulering eller cytotoksiske analyser), cellesortering og påfølgende transkripsjons- eller proteomikk. Videre applikasjoner som kan utvikles basert på denne metoden inkluderer kultur og utvidelse av løvfisk NK-celler etter cellesortering eller berikelse ved negativ uttømming. For tiden er det ingen protokoll til kultur og utvide musen uNK celler og bevare deres levedyktighet og funksjonalitet for en lengre periode, på samme måte som menneskelige NK celler som kan dyrkes og utvides i 7-14 dager ved tillegg av IL-2 eller en kombinasjon IL-12 og IL-15. Optimalisering av en slik metode for muse-uNK-celler vil gi mer fleksibilitet når du utfører funksjonelle analyser og tillater at flere forhold testes med et høyere cellenummer. På den annen side er kulturforhold kjent for å endre den unike fenotypen av lymfocytter og potensielt deres funksjon også.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker de forrige og nåværende teammedlemmene som har bidratt til å utvikle denne metoden, inkludert Jean-Marc Doisne, Norman Shreeve, Iva Filipovic og Anita Qualls. Denne forskningen ble finansiert av Wellcome trust [Grant number 200841/Z/16/Z ] og Medical Research Council (MR/P001092/1). Med det formål å åpne tilgangen, har forfatteren brukt en CC BY offentlig opphavsrettslisens til enhver forfatter akseptert manuskriptversjon som oppstår fra denne innsendingen.
70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | |
BSA | Sigma | A9647-100G | |
CD19 antibody | BD | 562701 | |
CD3 antibody | BD | 562600 | |
CD45 antibody | BioLegend | 103108 | |
CD49a antibody | BD | 740262 | |
DNase I | Roche (Sigma) | 10104159001 | |
EOMES antibody | eBioscience | 12-4875-82 | |
Fc block Trustain fcx | BioLegend | 101320 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10217-106 | |
Fix/Perm buffer (part of BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit) | BD | 554714 | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Gibco | 14025092 | |
Liberase DH | Roche (Sigma) | 5401089001 | |
Lysis buffer Pharmlyse | BD | 555899 | |
NK1.1 antibody | BioLegend | 108739 | |
NKp46 antibody | BioLegend | 137608 | |
Paraformaldehyde 16% Solution (methanol-free) | Agar Scientific | AGR1026 | |
PBS 10x | Gibco | 14030-048 | |
PBS 1x (no Ca2+ or Mg2+) | Thermo Scientific | 14190144 | |
Percoll | VWR international | 17-0891-01 | |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
Pre-Separation filters | Miltenyi | 130-095-823 | |
RMPI-1640 medium + GlutaMAX | Gibco | 61870-010 | |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Scientific | 15575020 | |
Zombie Violet Fixable Viability dye | BioLegend | 423113 |