Scambio idrogeno/deuterio basato sull'elettroforesi capillare per la caratterizzazione conformazionale di proteine con spettrometria di massa top-down
Summary
Qui viene presentato un protocollo per un approccio di scambio idrogeno/deuterio (HDX) basato sull’elettroforesi capillare accoppiato con la spettrometria di massa top-down. Questo approccio caratterizza la differenza nelle strutture di ordine superiore tra diverse specie proteiche, comprese le proteine in diversi stati e diverse proteoforme, conducendo simultaneamente HDX differenziale e separazione elettroforetica.
Abstract
La risoluzione dell’eterogeneità conformazionale di più stati proteici che coesistono in soluzione rimane uno dei principali ostacoli nella caratterizzazione delle terapie proteiche e nella determinazione delle vie di transizione conformazionali critiche per le funzioni biologiche, che vanno dal riconoscimento molecolare alla catalisi enzimatica. La reazione di scambio idrogeno/deuterio (HDX) accoppiata con l’analisi spettrometrica di massa top-down (MS) fornisce un mezzo per caratterizzare le strutture e le dinamiche di ordine superiore delle proteine in modo conforme-specifico. Il potere risolutivo conformazionale di questa tecnica dipende fortemente dall’efficienza di separare gli stati proteici a livello proteico intatto e ridurre al minimo il contenuto protico residuo non deuterato durante le reazioni HDX.
Qui descriviamo una variante basata sull’elettroforesi capillare (CE) dell’approccio HDX MS che mira a migliorare la risoluzione conformazionale. In questo approccio, le proteine subiscono reazioni HDX mentre migrano attraverso una soluzione elettrolitica di fondo deuterata (BGE) durante la separazione elettroforetica capillare. Diversi stati proteici o proteoforme che coesistono in soluzione possono essere separati in modo efficiente in base ai loro diversi rapporti carica-dimensione. La differenza nella mobilità elettroforetica tra proteine e molecole di solvente protico riduce al minimo il solvente residuo non deuterato, risultando in un ambiente di deuterazione quasi completo durante il processo HDX. L’interfaccia CE-MS microviale flow-through consente un’efficiente ionizzazione elettrospray delle specie proteiche eluite a seguito di una rapida miscelazione con la soluzione modificante estinguente e denaturante all’uscita dello spruzzatore. L’analisi online top-down della SM misura il livello di deuterazione globale delle specie proteiche intatte eluite e, successivamente, la deuterazione dei loro frammenti in fase gassosa. Questo documento dimostra questo approccio nell’HDX differenziale per i sistemi, comprese le varianti proteiche naturali che coesistono nel latte.
Introduction
Distinguere le specie proteiche in diversi stati conformazionali, leganti o modificativi e caratterizzare le loro differenze strutturali è importante per monitorare i percorsi di transizione tra queste specie coinvolte in eventi biologici, che vanno dal riconoscimento molecolare alla catalisi enzimatica, e comprendere i meccanismi alla base di questi eventi. Le tecniche biofisiche convenzionali non forniscono una soluzione completa a causa delle limitazioni come la risoluzione insufficiente e la perdita di informazioni dinamiche in soluzione. Lo scambio idrogeno/deuterio accoppiato con la spettrometria di massa (HDX MS) è una tecnica che etichetta le caratteristiche strutturali e conformazionali delle proteine con deuterio (2H) attraverso lo scambio tra atomi di idrogeno labile di proteine e 2H dalla soluzione di 2H2O deliberatamente introdotta. I protoni coinvolti nel legame idrogeno o che sono sequestrati dal solvente all’interno della proteina non si scambiano facilmente1. Pertanto, poiché il tasso di cambio in un sito scambiabile dipende fortemente dal suo coinvolgimento in strutture di ordine superiore, le strutture proteiche possono essere rivelate ad alta risoluzione spaziale da MS che sonda l’estensione e il tasso di assorbimento di 2H in base alle diverse masse atomiche tra 1H e 2H. Negli ultimi decenni, HDX MS è diventata una tecnica di eccezionale successo per lo studio delle conformazioni proteiche e delladinamica 2.
Nel classico approccio bottom-up di HDX MS, l’insieme di specie proteiche in diversi stati conformazionali, leganti o modificativi è proteolizzato senza separazione a livello proteico intatto, rendendo impossibile caratterizzare le singole specie analizzando i frammenti proteolitici risultanti con contenuto di deuterio contorto. Al contrario, nell’approccio top-down, diversi stati proteici o proteoforme che hanno incorporato diversi contenuti di deuterio danno origine a molteplici distribuzioni di masse proteiche intatte in una scansione della SM. Ciò consente di separare le singole specie mediante la selezione di massa di ioni corrispondenti a ciascuna distribuzione di massa utilizzando un filtro di massa appropriato (come un quadrupolo) e la caratterizzazione delle loro differenze conformazionali nella successiva analisi TANDEM MS 3,4,5,6. Tuttavia, l’efficienza della separazione degli stati proteici o dei proteoformi in questa strategia è limitata dall’entità della differenza nelle loro corrispondenti distribuzioni di massa.
L’elettroforesi capillare (CE) fornisce un mezzo per separare le specie proteiche in base alle loro diverse cariche e dimensioni idrodinamiche nella fase di soluzione con alta efficienza7. La combinazione di CE con HDX offre un’ulteriore separazione degli stati proteici o delle proteoforme nella fase di soluzione. Inoltre, il piccolo volume del capillare CE consente l’utilizzo di una soluzione completamente deuterata come soluzione elettrolitica di fondo (BGE), cioè il buffer in esecuzione, rendendo il capillare come reattore HDX per campioni proteici. A causa della differenza nella mobilità elettroforetica tra proteine e reagenti protici nel processo di elettroforesi, la conduzione di HDX durante la CE si traduce in un ambiente di deuterazione quasi completo per gli analiti proteici con contenuti residui non deuterati minimi, migliorando così la sensibilità dell’analisi strutturale utilizzando i dati HDX. Pertanto, abbiamo sviluppato un approccio HDX differenziale basato su CE accoppiato con SM top-down per caratterizzare le strutture proteiche di ordine superiore in modo specifico per stato o proteoforme8.
Questo documento descrive i protocolli per questo approccio dettagliando le fasi di preparazione dei materiali, procedura sperimentale e analisi dei dati. I fattori che possono influire sulle prestazioni del metodo o sulla qualità dei dati sono elencati in brevi note. I risultati rappresentativi qui presentati includono i dati HDX differenziali di miscele di diverse proteine e varianti naturali di β-lattoglobulina bovina (β-lg), la principale proteina del siero di latte presente nel latte9. Dimostriamo l’efficienza di separazione, la riproducibilità e le prestazioni di etichettatura 2H delle due abbondanti varianti di β-lg, cioè A e B10,11 durante l’HDX basato su CE e la caratterizzazione specifica della variante delle loro conformazioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli obiettivi del rivestimento della parete interna del capillare CE includono la minimizzazione del flusso elettroosmotico e l’assorbimento delle proteine durante il processo CE13. Sebbene il flusso elettroosmotico sia vantaggioso per l’analisi CE convenzionale di piccole molecole grazie alla sua capacità di guidare specie neutre o caricate in modo opposto al rivelatore, compromette l’efficienza di separazione di specie proteiche con dimensioni simili e cariche nette in soluzione. Rivestire il c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (NSFC 21974069). Gli autori hanno anche ricevuto il supporto dell’Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, Cina; Jiangsu Collaborative Innovation Center of Biomedical Functional Materials; e Jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials presso la Nanjing Normal University, Cina.
Materials
| ammonium acetate | Fisher Chemical | A/3446/50 | ≥99% |
| CESI 8000 plus capillary electrophoresis system | Sciex, USA | ||
| centrifuge | Eppendorf | 5406000097 | |
| centrifugal filter | Merck | UFC201024 | 10 kDa cutoff |
| deuterium oxide | Energy Chemical | E090001 | 99.9 % D |
| formic acid | Acros Organics | 270480250 | |
| fused silica glass capillary | Polymicro Technologies | 1068150017 | ID 50μm, OD 360μm |
| gas chromatography | Agilent | GC6890N | |
| hydrochloric acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| hydroxypropyl cellulose | Aladdin | H113415 | MW 100000 |
| magnetic stirrers | DLAB | 8030101212 | |
| methanol | Fisher Chemical | A456-4 | MS grade |
| microvolume UV-Vis spectrophotometer | DeNovix | 84677JK7731 | |
| myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System | Beckman Coulter, USA | ||
| Q Exactive UHMR mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific, Germany | ||
| sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | |
| ubiquitin | Sigma Aldrich | U6253 | |
| ultrasonicator | SCIENTZ | SB-5200 | |
| β-lactoglobulin | Sigma Aldrich | L0130 | |
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