Bestimmung der Toxizität von UV-Strahlung und Chemikalien auf primären und immortalisierten humanen Hornhautepithelzellen

Summary

Dieser Artikel beschreibt die Verfahren zur Bewertung der Toxizität von UV-Strahlung und chemischen Toxinen auf einer primären und immortalisierten Zelllinie.

Abstract

Dieser Artikel beschreibt die Methoden zur Messung der Toxizität von ultravioletter (UV) Strahlung und Augentoxinen auf primären (pHCEC) und immortalisierten (iHCEC) humanen Hornhautepithelzellkulturen. Die Zellen wurden UV-Strahlung und toxischen Dosen von Benzalkoniumchlorid (BAK), Wasserstoffperoxid (_H2O2) und Natriumdodecylsulfat (SDS) ausgesetzt. Die metabolische Aktivität wurde mit einem metabolischen Assay gemessen. Die Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen wurde mit einem Multiplex-Interleukin (IL)-1β-, IL-6-, IL-8- und Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α)-Assay gemessen, und die Zellen wurden mit Fluoreszenzfarbstoffen auf ihre Lebensfähigkeit untersucht.

Die schädigenden Auswirkungen von UV-Strahlung auf die Stoffwechselaktivität und die Freisetzung von Zytokinen traten bei 5 min UV-Exposition für iHCEC und 20 min für pHCEC auf. Ähnliche prozentuale Abnahmen der metabolischen Aktivität von iHCEC und pHCEC traten nach Exposition gegenüber BAK,_H2O₂ oder SDS auf, und die signifikantesten Veränderungen in der Zytokinfreisetzung traten für IL-6 und IL-8 auf. Die Mikroskopie von fluoreszenzgefärbten iHCEC- und pHCEC-BAK-exponierten Zellen zeigte den Zelltod bei 0,005% BAK-Exposition, obwohl der Grad der Ethidiumfärbung bei den iHCECs größer war als bei pHCECs. Unter Verwendung mehrerer Methoden zur Beurteilung toxischer Wirkungen mittels Mikroskopie, Bewertung der Stoffwechselaktivität und Zytokinproduktion konnte die Toxizität von UV-Strahlung und chemischen Toxinen sowohl für primäre als auch für immortalisierte Zelllinien bestimmt werden.

Introduction

In-vitro-toxikologische Studien werden durchgeführt, um die toxischen Wirkungen von Chemikalien und anderen Wirkstoffen vorherzusagen, die Zellen schädigen können. Bei der Bewertung der Toxizität für die Hornhaut wurden humane Hornhautepithelzellen (HCECs) in Modellen zur Bewertung dieser Effekte verwendet 1,2,3,4. Diese Modelle bewerten in der Regel physiologische Effekte wie Veränderungen der Stoffwechselaktivität der Zelle, Zellproliferation und andere Zellfunktionen wie die Produktion und Freisetzung von entzündlichen Zytokinen.....

Protocol

1. Kultivierung von pHCECs und iHCECs

1. Züchten Sie die pHCECs und iHCECs in humanem okulärem Epithelmedium (HOEM) mit den folgenden Nahrungsergänzungsmitteln: 6 mM L-Glutamin, 0,002 % Zellmedienergänzung O (Materialtabelle), 1,0 μM Epinephrin, 0,4 % Zellmedienergänzung P (Materialtabelle), 5 μg/ml rh Insulin, 5 μg/ml Apotransferrin und 100 ng/ml Hydrocortisonhemisuccinat in Kollagen-1-beschichteten Kulturflaschen (18 ml in einem 75 cm² Kulturkolben).
2. Wechseln Sie das Medium in den Kolben alle 2-3 Tage, indem Sie das Medium entfernen, nachdem die Zellen auf ~80% Konfluenz gewachsen sind. Dissoziationslösun....

Results

Zellengröße
Die primären und immortalisierten HCECs wurden mit drei Fluoreszenzfarbstoffen visualisiert, die drei verschiedene Stadien der Zellviabilität widerspiegeln. Lebende Zellen sind grün (Calcein-AM), tote Zellen rot (Ethidium-Homodimer-1) und apoptotische Zellen gelb (Annexin-V-Computer-angepasste Farbe zur besseren Visualisierung des Fluoreszenzsignals). Lebende Zellen enthalten Esterasen im Zellzytoplasma und wandeln Calcein-AM in Calcein um. Tote Zellen haben Zellmembranen, die für Ethidium.......

Discussion

Mögliche Unterschiede in der Verwendung von zwei Arten von HCECs wurden bewertet. Die Zellen wurden in das gleiche Medium (HOEM) mit identischen Zellkonzentrationen eingebracht und dann kurzen und langen Perioden von UV-Strahlung und drei Augentoxinen ausgesetzt. Die Dosen von UV-Strahlung und Chemikalien wurden auf der Grundlage ihrer physiologischen Wirkungen ausgewählt, die für die Zellen schädlich genug waren, um Zwischenreaktionen hervorzurufen, die verglichen werden konnten. Expositionszeiten von 5 und 20 min für U.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
75 cm2 Belüftete Flasche	Corning	354485	Dies ist die BioCoat-Marke, kollagenbeschichtete 96-Well-Platte
	costar	3370
alamarBlue	Fisher Scientific	dal 1025
Annexin Staining Pufferlösung	Invitrogen, Burlington, ON, Kanada
Annexin V	Invitrogen, Burlington, ON, Kanada
Axiovert 100 Mikroskop mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop von Zeiss 510 System	Carl Zeiss Inc., Deutschland
Corning 48 Well Platten	Corning	354505	Dies ist die Marke BioCoat, kollagenbeschichtete
Cytation 5	BioTek	CYT5MPV	Kann Fluoreszenz von 280 - 700 nm lesen (für Assay 540/590)
Fötales Rinderserum	Hycone	SH30396.03
Deckgläser mit Glasboden	MatTek Corporation, Ashland, MA, USA
Menschliche Hornhautepithelzellen	University of Ottawa	N/A	SV40-immortalisierte menschliche Hornhautepithelzellen von Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Kanada) und wurden charakterisiert Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Funktionelle menschliche Hornhautäquivalente, die aus Zelllinien konstruiert werden. Wissenschaft. 1999;286:2169-72.
Human Ocular Epithelia Media (HOEM) mit den folgenden Ergänzungen:	Millipore, Billerica, MA, USA	SCMC001	Epigro Basismedium ergänzt mit 6 mM L-Glutamin, 0,002% EpiFactor O (Zellmedienergänzung O im Artikel), 1,0 μ M Epinephrin, 0,4% EpiFactor P (Zellmedienergänzung P im Artikel), 5 μ g/mL rh Insulin, 5 μ g/ml Apo-Transferrin und 100 ng/ml Hydrocortison-Hemisuccinat in Kollagen-1-beschichteten Kulturflaschen (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).
Lebendes totes Calcien- und Ethidium-Homodimer	Invitrogen, Burlington, ON, Kanada
MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 Instrument	Rockville, MD, USA
MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex Assay	Rockville, MD, USA
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122	100-fache Konzentration, also 1 mL zu jedem 99 mL Medium hinzufügen
Primäre Hornhautepithelzellen	Millipore, Billerica, MA, USA	SCCE016
SpectraMax Fluoreszenz-Multiwell-Plattenleser	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA
TrypLE Express (Zelldissoziationslösung)	Fisher	Scientific 12605036