Dendritiske rygsøjler er vigtige cellulære træk i nervesystemet. Her beskrives levende billeddannelsesmetoder til vurdering af strukturen og funktionen af dendritiske rygsøjler i C. elegans. Disse tilgange understøtter udviklingen af mutante skærme for gener, der definerer dendritisk rygsøjleform eller funktion.
Dendritiske rygsøjler er specialiserede steder for synaptisk innervering moduleret af aktivitet og tjener som substrater for læring og hukommelse. For nylig er dendritiske rygsøjler blevet beskrevet for DD GABAergiske neuroner som inputsteder fra præsynaptiske kolinerge neuroner i motorkredsløbet af Caenorhabditis elegans. Dette synaptiske kredsløb kan nu tjene som en kraftfuld ny in vivo-model af rygsøjlemorfogenese og funktion, der udnytter den letkøbte genetik og klar tilgængelighed af C. elegans til levende cellebilleddannelse.
Denne protokol beskriver eksperimentelle strategier til vurdering af DD-rygsøjlens struktur og funktion. I denne tilgang bruges en superopløsningsbilledstrategi til at visualisere de indviklede former af actinrige dendritiske rygsøjler. For at evaluere DD-rygfunktionen stimulerer den lysaktiverede opsin, Chrimson, de præsynaptiske kolinerge neuroner, og calciumindikatoren, GCaMP, rapporterer de fremkaldte calciumtransienter i postsynaptiske DD-rygsøjler. Sammen omfatter disse metoder kraftfulde tilgange til identifikation af genetiske determinanter for dendritiske rygsøjler i C. elegans , der også kan styre rygsøjlemorfogenese og funktion i hjernen.
Dendritiske rygsøjler er specialiserede cellulære strukturer, der modtager input fra naboneuroner til synaptisk transmission. Aktivering af neurotransmitterreceptorer hæver intracellulære calcium- og nedstrøms signalveje i disse karakteristiske neuronale fremspring1. På grund af den grundlæggende betydning af dendritiske rygsøjler for neurotransmission og deres fejlregulering i neuroudviklingssygdomme1, er opdagelsen af faktorer, der modulerer dendritisk rygmarvsmorfogenese og funktion, af stor interesse for neurovidenskab.
For nylig er dendritiske rygsøjler blevet identificeret i C. elegans nervesystem baseret på nøgleegenskaber, der deles med pattedyrs rygsøjler2. Denne bestemmelse er afgørende, fordi den åbner mulighed for at udnytte fordelene ved C. elegans til at undersøge rygsøjlebiologi. Dendritiske rygsøjler på Dorsal D (DD) motorneuroner modtager input fra kolinerge neuroner (VA og VB) i den ventrale nerveledning (figur 1A) 2,3,4. Her præsenteres billeddannelsesmetoder for at udforske strukturen af DD-dendritiske rygsøjler og deres funktion in vivo i et intakt nervesystem, der er let tilgængeligt for levende billeddannelse og genetisk analyse. Til overvågning af formen af dendritiske rygsøjler, (1) cytosoliske fluorescerende proteiner, som fylder dendritisk proces og rygsøjler; (2) membranbundne fluorescerende proteiner, som dekorerer grænsen til dendritiske rygsøjler og dendritter; eller (3) actinmarkørerne, LifeAct5 eller Utrophin6, som er beriget med dendritiske rygsøjler, anvendes og afslører dermed deres form. For at overvåge funktionaliteten af DD-rygsøjler bruges GCaMP-fluorescens til at detektere Ca ++ transienter fremkaldt ved aktivering af den rødforskudte opsin, Chrimson, i presynaptiske kolinerge neuroner7. Begge strategier forventes at lette undersøgelsen af DD dendritiske rygsøjler i vildtype og mutante dyr.
Airyscan-detektoren blev valgt til at erhverve snapshots af DD-rygsøjler, fordi den giver et højere signal-støj-forhold og bedre opløsning end konventionelle konfokale mikroskoper19,20. AiryScan-billeddannelse tillader også brug af konventionelle fluorescerende proteiner (f.eks. GFP, mCherry osv.), Der nu er bredt tilgængelige for C. elegans. Selvom billeder med højere opløsning kan opnås med andre superopløsningsmetoder (f.eks. STORM, STED, PALM), kræver disse metoder fotoaktiverbare eller fotoomskiftelige fluorescerende proteiner21. Som et alternativ til Airyscan anbefales konventionelle konfokale mikroskoper. For eksempel opnår billeddannelse med Nyquist-erhvervelse (figur 3) pixelstørrelsen ved hjælp af et 40x / 1.3-mål på 123.9 nm, der er tilstrækkeligt til at skelne mellem rygsøjlemorfologiske typer (figur 2).
Til bestemmelse af rygsøjlens tæthed anbefales det at bruge et cytosolisk fluorescerende protein såsom (1) mCherry eller GFP, (2) LifeAct til at mærke actincytoskelettet eller (3) et myristoyleret fluorescerende protein (f.eks. MYR::mRuby) til mærkning af plasmamembranen (figur 1B). Til sammenligning reducerer F-actinbindingsproteinet Utrophin rygsøjlens tæthed (figur 1C), hvilket indikerer en negativ effekt på rygsøjlemorfogenese, når Utrophin er overudtrykt.
De nuværende billeddannelsesmetoder skal hjælpe med at identificere genetiske varianter, der styrer rygsøjlemorfologi 1,16. DD-rygsøjlemorfologi (dvs. tynd/svampet, filopodial, stubby, forgrenet, se figur 2) kan vurderes ud fra enkelte 2D-fremskrivninger af de ventrale nervelednings laterale billeder, da de fleste DD-rygsøjler antager en karakteristisk ventralt rettet orientering. I disse sammenligninger er det vigtigt at bruge den samme fluorescerende markør for hver tilstand, da tilsyneladende rygsøjlemorfologiske typer synes at være påvirket af mærkningsmetoden (f.eks. MYR::mRuby vs. LifeAct::GFP). Derudover blev det bemærket, at rygformerne er dynamiske og sandsynligvis ændrer form som reaktion på de eksterne signaler 2,16. Det er således også vigtigt at sammenligne rygformer mellem genotyper på lignende udviklingsstadier og under lignende forhold.
Orienteringen af C. elegans ventrale ledning er kritisk afgørende for nøjagtig billedoptagelse. Både de ventrale og dorsale ledninger på modsatte sider af dyret skal være synlige i samme Z-plan, hvilket indikerer, at ormen er orienteret på sin side (figur 1B). Det er bedst ikke at samle billeder af orme, der bevæger sig eller er i kontakt med andre orme eller bobler nær den ventrale ledning, da dette kan nedbryde billeder af rygsøjler.
Til in vivo calciumbilleddannelse skal friske dias forberedes umiddelbart før hver erhvervelse. Det er bedst at afbilde orme i kontakt med kun tynde limfibre vs. “klumper” af lim, der har tendens til at udtørre orme og nedbryde billedet (figur 4B). I eksperimentet vist i figur 4 aktiverer pulsen på 561 nm lys hele synsfeltet. For at øge den tidsmæssige og rumlige opløsning til at detektere lokale Ca++ transienter, for eksempel inden for individuelle DD-rygsøjler, kan en galvo miniscanner, der er oprettet til 561 nm laserlinjen, bruges til at stimulere et mindre område af interesse17.
The authors have nothing to disclose.
Billeddannelse og analyse af Imaris blev udført i Vanderbilt Cell Imaging Shared Resource (CIRS) understøttet af NIH (CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 og EY08126). LSM 880 er støttet af tilskud 1S10OD201630. Billedbehandling på en Nikon-spindedisk blev udført på Nikon Center of Excellence. Vi takker Jenny Schafer, CISR-direktør, og Bryan Millis for træning og indsigtsfulde diskussioner og medlemmer af Burnette-laboratoriet: Dylan Burnette, Aidan Fenix og Nilay Taneja for råd. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health-tilskud til DMM (R01NS081259 og R01NS106951) og et American Heart Association-tilskud til ACC (18PRE33960581).
All-trans retinal (ATR) | Sigma-Aldrich | R2500-100MG | Necessary cofactor for neuronal excitation with Chrimson |
diH2O | MilliQ | To prepare M9 buffer | |
Ethanol 100% | Sigma | 64-17-5 | To dilute ATR and make control plates for neuronal excitation |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (tricaine) | To immobilize animals for imaging dendritic spines | ||
ImageJ | NIH | (Schindelin J et al., 2012) | Open source image processing software |
KH2PO4 | Fisher Bioreagents | 7758-11-4 | To prepare M9 buffer |
Levamisole hydrochloride | Sigma | 16595-80-5 | To immobilize animals for imaging dendritic spines |
MgSO4 | Fisher Chemical | M63-500 | To prepare M9 buffer |
Microscope cover glass | Fisherbrand | 12542B | To mount animals for microscopy acquisition |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S369-500 | To prepare M9 buffer |
NaCl | Fisher Chemical | S671-3 | To prepare M9 buffer |
NIS Elements version 05.21 | Nikon | To analyze images and movies (e.g., Deconvolution, image alignment) | |
Polybeads carboxylate 0.05um microspheres | Polysciences, Inc | 15913-10 | To immobilize animals for imaging Ca++ transients |
Prism | For statistical analysis and graphing normalized Ca++ transients | ||
SeaKen ME agarose | Lonza | 50014 | To make agarose pads to mount animals for imaging |
Super Glue | The gorilla company | To immobilize animals for imaging Ca++ transients | |
Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 22-034-980 | To mount animals for microscopy acquisition |
vaseline | Covidien | 8884430300 | To seal sample for confocal snapshots |
Wax | Fisherbrand | 23-021-399 | Paraplast tissue embedding medium |
Microscope for super-resolution imaging | |||
LSM880 | Zeiss | ||
AiryScan detector | Zeiss | ||
Plan Apochromat (oil) 63x/ 1.40 NA, WD = 0.19 mm | |||
Laser lines | |||
Stage controller | |||
Microscope for Nyquist image acquisition | |||
A1R Confocal | Nikon | ||
Plan Fluor (oil) 40x/1.3 NA, WD 0.24 mm | |||
488 nm, 16mW | |||
561 nm, 17mW | |||
Microscope to monitor evoked Ca++ transients in dendritic spines | |||
Spinning Disk Confocal | Nikon | ||
Andor DU-897 EMCCD camera | |||
Spinning disk Head CSU-X1 | Yokogawa | ||
Apo TIRF (oil) 100x/1.49 NA ,WD 0.12 mm | |||
488 nm, 65mW | |||
561 nm, 86mW | |||
525 nm (+/- 18 nm) | |||
605 nm (+/- 35 nm) |