Dendritiske spines er viktige cellulære egenskaper i nervesystemet. Her beskrives levende avbildningsmetoder for å vurdere strukturen og funksjonen til dendritiske spines i C. elegans. Disse tilnærmingene støtter utviklingen av mutante skjermer for gener som definerer dendritisk ryggradsform eller funksjon.
Dendritiske spines er spesialiserte steder for synaptisk innervering modulert av aktivitet og fungerer som substrater for læring og minne. Nylig har dendritiske spines blitt beskrevet for DD GABAergiske nevroner som inngangssteder fra presynaptiske kolinerge nevroner i motorkretsen til Caenorhabditis elegans. Denne synaptiske kretsen kan nå tjene som en kraftig ny in vivo-modell av ryggradsmorfogenese og funksjon som utnytter den lette genetikken og tilgjengeligheten til C. elegans til live-cell imaging.
Denne protokollen beskriver eksperimentelle strategier for å vurdere DD-ryggradens struktur og funksjon. I denne tilnærmingen brukes en superoppløsningsavbildningsstrategi for å visualisere de intrikate formene til aktinrike dendritiske spines. For å evaluere DD-ryggradsfunksjonen stimulerer den lysaktiverte opsinen, Chrimson, de presynaptiske kolinerge nevronene, og kalsiumindikatoren, GCaMP, rapporterer de fremkalte kalsiumtransientene i postsynaptiske DD-spines. Sammen utgjør disse metodene kraftige tilnærminger for å identifisere genetiske determinanter for dendritiske spines i C. elegans som også kan lede ryggradsmorfogenese og fungere i hjernen.
Dendritiske spines er spesialiserte cellulære strukturer som mottar innspill fra nærliggende nevroner for synaptisk overføring. Aktivering av nevrotransmitterreseptorer hever intracellulært kalsium og nedstrøms signalveier i disse karakteristiske nevronfremspringene1. På grunn av den grunnleggende betydningen av dendritiske spines for nevrotransmisjon og deres feilregulering i nevrodevelopmental sykdommer1, er oppdagelsen av faktorer som modulerer dendritisk ryggradsmorfogenese og funksjon av stor interesse for nevrovitenskap.
Nylig har dendritiske spines blitt identifisert i C. elegans nervesystem basert på nøkkelegenskaper som deles med pattedyrs spines2. Denne bestemmelsen er avgjørende fordi den åpner muligheten for å utnytte fordelene ved C. elegans for å undersøke ryggradsbiologi. Dendrittiske pigger på dorsale D (DD) motornevroner mottar input fra kolinerge nevroner (VA og VB) i ventralnerven (figur 1A)2,3,4. Her presenteres avbildningsmetoder for å utforske strukturen til DD dendritiske spines og deres funksjon in vivo i et intakt nervesystem som er lett tilgjengelig for levende bildebehandling og genetisk analyse. For å overvåke formen på dendritiske spines, (1) cytosoliske fluorescerende proteiner, som fyller dendritisk prosess og spines; (2) membranbundne fluorescerende proteiner, som dekorerer grensen til dendritiske spines og dendritter; eller (3) aktinmarkørene, LifeAct5 eller Utrophin6, som er beriket i dendritiske spines, brukes, og avslører dermed deres form. For å overvåke funksjonaliteten til DD-spines, brukes GCaMP-fluorescens til å oppdage Ca ++-transienter fremkalt ved aktivering av den rødforskjøvne opsinen, Chrimson, i presynaptiske kolinerge nevroner7. Begge strategiene forventes å lette studiet av DD dendritiske spines i villtype og mutante dyr.
Airyscan-detektoren ble valgt for å skaffe øyeblikksbilder av DD-pigger fordi den gir et høyere signal-til-støy-forhold og bedre oppløsning enn konvensjonelle konfokale mikroskoper19,20. AiryScan-avbildning tillater også bruk av konvensjonelle fluorescerende proteiner (f.eks. GFP, mCherry, etc.), nå allment tilgjengelig for C. elegans. Selv om bilder med høyere oppløsning kan oppnås med andre superoppløsningsmetoder (f.eks. STORM, STED, PALM), krever disse metodene fotoaktiverbare eller fotobyttbare fluorescerende proteiner21. Som et alternativ til Airyscan anbefales konvensjonelle konfokale mikroskoper. For eksempel oppnår bildebehandling med Nyquist-oppkjøp (figur 3) pikselstørrelsen ved hjelp av et 40x/1.3-mål på 123,9 nm, tilstrekkelig til å skille ryggradens morfologiske typer (figur 2).
For å bestemme ryggradens tetthet, anbefales det å bruke et cytosolisk fluorescerende protein som (1) mCherry eller GFP, (2) LifeAct for å merke aktincytoskjelettet, eller (3) et myristoylert fluorescerende protein (f.eks. MYR: : mRuby) for å merke plasmamembranen (figur 1B). Til sammenligning reduserer det F-aktinbindende proteinet Utrophin ryggradstettheten (figur 1C), noe som indikerer en negativ effekt på ryggradens morfogenese når Utrophin er overuttrykt.
De nåværende bildemetodene skal bidra til å identifisere genetiske varianter som styrer ryggradsmorfologi 1,16. DD-ryggradens morfologi (dvs. tynn/sopp, filopodial, stubby, forgrenet, se figur 2) kan vurderes ut fra enkle 2D-projeksjoner av laterale bilder av den ventrale nervestrengen siden de fleste DD-pigger har en karakteristisk ventralt rettet orientering. I disse sammenligningene er det viktig å bruke samme fluorescerende markør for hver tilstand siden tilsynelatende ryggradsmorfologiske typer ser ut til å være påvirket av merkingsmetoden (f.eks. MYR::mRuby vs. LifeAct::GFP). I tillegg ble det bemerket at ryggradsformene er dynamiske og sannsynligvis endrer form som svar på de eksterne signalene 2,16. Dermed er det også viktig å sammenligne ryggradsformer mellom genotyper i lignende utviklingsstadier og under lignende forhold.
Orienteringen av C. elegans ventral ledning er kritisk viktig for nøyaktig bildeopptak. Både ventrale og dorsale ledninger på motsatte sider av dyret skal være synlige i samme Z-plan, noe som indikerer at ormen er orientert på siden (figur 1B). Det er best å ikke samle bilder av ormer som beveger seg eller er i kontakt med andre ormer eller bobler nær ventralledningen, da dette kan forringe bilder av spines.
For in vivo kalsiumavbildning må friske lysbilder tilberedes umiddelbart før hvert oppkjøp. Det er best å avbilde ormer i kontakt med bare tynne limfibre vs. “klumper” av lim som har en tendens til å tørke ormer og forringe bildet (figur 4B). I eksperimentet vist i figur 4 aktiverer pulsen på 561 nm lys hele synsfeltet. For å øke den tidsmessige og romlige oppløsningen for å oppdage lokale Ca ++ transienter, for eksempel i individuelle DD-spines, kan en galvo mini-skanner satt opp for 561 nm laserlinjen brukes til å stimulere et mindre område av interesse17.
The authors have nothing to disclose.
Avbildning og analyse på Imaris ble utført i Vanderbilt Cell Imaging Shared Resource (CIRS) støttet av NIH (CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 og EY08126). LSM 880 støttes av tilskudd 1S10OD201630. Avbildning på en Nikon-spinnedisk ble utført ved Nikon Center of Excellence. Vi takker Jenny Schafer, CISR-direktør, og Bryan Millis for opplæring og innsiktsfulle diskusjoner og medlemmer av Burnette-laboratoriet: Dylan Burnette, Aidan Fenix og Nilay Taneja for råd. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health tilskudd til DMM (R01NS081259 og R01NS106951) og en American Heart Association stipend til ACC (18PRE33960581).
All-trans retinal (ATR) | Sigma-Aldrich | R2500-100MG | Necessary cofactor for neuronal excitation with Chrimson |
diH2O | MilliQ | To prepare M9 buffer | |
Ethanol 100% | Sigma | 64-17-5 | To dilute ATR and make control plates for neuronal excitation |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (tricaine) | To immobilize animals for imaging dendritic spines | ||
ImageJ | NIH | (Schindelin J et al., 2012) | Open source image processing software |
KH2PO4 | Fisher Bioreagents | 7758-11-4 | To prepare M9 buffer |
Levamisole hydrochloride | Sigma | 16595-80-5 | To immobilize animals for imaging dendritic spines |
MgSO4 | Fisher Chemical | M63-500 | To prepare M9 buffer |
Microscope cover glass | Fisherbrand | 12542B | To mount animals for microscopy acquisition |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S369-500 | To prepare M9 buffer |
NaCl | Fisher Chemical | S671-3 | To prepare M9 buffer |
NIS Elements version 05.21 | Nikon | To analyze images and movies (e.g., Deconvolution, image alignment) | |
Polybeads carboxylate 0.05um microspheres | Polysciences, Inc | 15913-10 | To immobilize animals for imaging Ca++ transients |
Prism | For statistical analysis and graphing normalized Ca++ transients | ||
SeaKen ME agarose | Lonza | 50014 | To make agarose pads to mount animals for imaging |
Super Glue | The gorilla company | To immobilize animals for imaging Ca++ transients | |
Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 22-034-980 | To mount animals for microscopy acquisition |
vaseline | Covidien | 8884430300 | To seal sample for confocal snapshots |
Wax | Fisherbrand | 23-021-399 | Paraplast tissue embedding medium |
Microscope for super-resolution imaging | |||
LSM880 | Zeiss | ||
AiryScan detector | Zeiss | ||
Plan Apochromat (oil) 63x/ 1.40 NA, WD = 0.19 mm | |||
Laser lines | |||
Stage controller | |||
Microscope for Nyquist image acquisition | |||
A1R Confocal | Nikon | ||
Plan Fluor (oil) 40x/1.3 NA, WD 0.24 mm | |||
488 nm, 16mW | |||
561 nm, 17mW | |||
Microscope to monitor evoked Ca++ transients in dendritic spines | |||
Spinning Disk Confocal | Nikon | ||
Andor DU-897 EMCCD camera | |||
Spinning disk Head CSU-X1 | Yokogawa | ||
Apo TIRF (oil) 100x/1.49 NA ,WD 0.12 mm | |||
488 nm, 65mW | |||
561 nm, 86mW | |||
525 nm (+/- 18 nm) | |||
605 nm (+/- 35 nm) |