Evaluering af in vivo antitumoraktivitet af polyanhydrid IL-1α nanopartikler
Summary
En standardprotokol er beskrevet til undersøgelse af antitumoraktiviteten og associeret toksicitet af IL-1α i en syngeneisk musemodel af HNSCC.
Abstract
Cytokinterapi er en lovende immunterapeutisk strategi, der kan producere robuste antitumorimmunresponser hos kræftpatienter. Det proinflammatoriske cytokin interleukin-1 alfa (IL-1α) er blevet evalueret som et anticancermiddel i flere prækliniske og kliniske undersøgelser. Imidlertid har dosisbegrænsende toksiciteter, herunder influenzalignende symptomer og hypotension, dæmpet entusiasmen for denne terapeutiske strategi. Polyanhydrid nanopartikel (NP)-baseret levering af IL-1α ville udgøre en effektiv tilgang i denne sammenhæng, da dette kan muliggøre en langsom og kontrolleret frigivelse af IL-1α systemisk, samtidig med at toksiske bivirkninger reduceres. Her beskrives en analyse af antitumoraktiviteten af IL-1a-belastede polyanhydrid NP’er i en pladecellekarcinom (HNSCC) syngeneisk musemodel for hoved og hals. Murin orofaryngeal epitelceller, der stabilt udtrykte HPV16 E6 / E7 sammen med hRAS og luciferase (mEERL) celler blev injiceret subkutant i højre flanke af C57BL / 6J mus. Når tumorer nåede 3-4 mm i enhver retning, blev en 1,5% IL-1a – belastet 20:80 1,8-bis (p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctan: 1,6-bis (p-carboxyphenoxy) hexan (CPTEG: CPH) nanopartikel (IL-1α-NP) formulering administreret til mus intraperitonealt. Tumorstørrelse og kropsvægt blev kontinuerligt målt, indtil tumorstørrelse eller vægttab nåede eutanasikriterier. Blodprøver blev taget for at evaluere antitumorimmunresponser ved submandibulær venipunktur, og inflammatoriske cytokiner blev målt gennem cytokinmultiplexassays. Tumor- og inguinale lymfeknuder blev resekteret og homogeniseret i en enkeltcellesuspension for at analysere forskellige immunceller gennem flerfarvet flowcytometri. Disse standardmetoder vil gøre det muligt for efterforskere at studere antitumorimmunresponset og den potentielle mekanisme for immunstimulerende NP’er og andre immunterapimidler til kræftbehandling.
Introduction
Et af de nye områder inden for kræftimmunterapi er brugen af inflammatoriske cytokiner til at aktivere patienternes immunsystem mod deres tumorceller. Flere proinflammatoriske cytokiner (dvs. interferon-alfa (IFNα), interleukin-2 (IL-2) og interleukin-1 (IL-1)) kan montere betydelig antitumorimmunitet, hvilket har skabt interesse for at udforske antitumoregenskaberne såvel som sikkerheden ved cytokinbaserede lægemidler. Interleukin-1 alfa (IL-1α) er især et proinflammatorisk cytokin kendt som master cytokin af inflammation1. Siden opdagelsen af dette cytokin i slutningen af 1970’erne er det blevet undersøgt som et anticancermiddel såvel som et hæmatopoietisk lægemiddel til behandling af de negative virkninger af kemoterapi2. I slutningen af 1980’erne blev der udført flere prækliniske og kliniske undersøgelser for at bestemme anticancervirkningerne af IL-1α 3,4,5,6. Disse undersøgelser fandt lovende antitumoraktivitet af rekombinant IL-1α (rIL-1α) mod melanom, renalcellekarcinom og ovariekarcinom. Imidlertid blev toksiciteter, herunder feber, kvalme, opkastning, influenzalignende symptomer og mest alvorligt dosisbegrænsende hypotension almindeligt observeret. Desværre dæmpede disse dosisrelaterede toksiciteter entusiasmen for yderligere klinisk anvendelse af rIL-1α.
For at forsøge at løse det kritiske problem med IL-1a-medierede toksiciteter vil polyanhydrid nanopartikel (NP) formuleringer, der muliggør kontrolleret frigivelse af IL-1α ved overfladeerosionskinetik blive undersøgt. Disse NP-formuleringer er beregnet til at høste fordelene ved antitumoregenskaberne ved IL-1α og samtidig reducere dosisbegrænsende bivirkninger7. Polyanhydrider er FDA-godkendte polymerer, der nedbrydes gennem overfladeerosion, hvilket resulterer i næsten nul-ordens frigivelse af indkapslede midler 8,9,10,11,12. Amfifile polyanhydridcopolymerer indeholdende 1,8-bis-(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctan (CPTEG) og 1,6-bis-(p-carboxyphenoxy) hexan (CPH) er rapporteret at være fremragende leveringssystemer til forskellige nyttelast i onkologi- og immunologibaseret forskning 8,12. I den følgende protokol vil 20:80 CPTEG:CPH NP’er fyldt med 1,5 vægt% rIL-1α (IL-1α-NP’er) blive brugt til at studere antitumoraktiviteten og toksiciteten af dette cytokin i en musemodel af HNSCC.
Det overordnede mål med følgende procedurer er at vurdere antitumoraktiviteten af IL-1a-NP’er på HNSCC’er. De beskrevne procedurer, herunder vurdering af tumorvækst og overlevelse, kan anvendes på ethvert immunmodulerende middel af interesse. Disse procedurer bør udføres i en syngeneisk musemodel med et intakt immunsystem13 for at maksimere klinisk relevans. IL-1a-NP toksicitet vil også blive vurderet ved at måle ændringer i cirkulerende niveauer af proinflammatoriske cytokiner og dyrevægt. Der er mange metoder til bestemmelse af in vivo lægemiddeltoksicitet; De mest anvendte metoder omfatter imidlertid måling af serumenzymer for organtoksicitet og histologiske ændringer i disse organer. For at udføre histologiske analyser skal dyret dog ofres, hvilket vil påvirke eksperimentets overlevelseskurver. Derfor vil denne protokol indeholde en protokol for indsamling af blod fra levende mus til måling af cytokiner i serumprøver. Det indsamlede serum kan anvendes til måling af eventuelle ønskede serumanalysander for organtoksicitet. Flerfarvet flowcytometri vil blive brugt til at forstå ændringerne i immuncellepopulationen i tumormikromiljøet og immuncellemigration til lymfeknuden. Andre metoder kan anvendes til at identificere immunceller, herunder immunhistokemi og/eller immunfluorescens af konserverede afsnit14. Disse teknikker kan dog være tidskrævende og kedelige at udføre på et stort antal dyr. Samlet set vil følgende metoder gøre det muligt for efterforskere at studere antitumorimmunresponset og potentielle mekanismer for immunstimulerende midler til kræftbehandling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol vil gøre det muligt for enhver efterforsker at studere antitumoraktiviteten og nogle af de underliggende mekanismer for immunmodulerende lægemidler i et in vivo tumormusemodelsystem. Her blev der anvendt en syngeneisk subkutan tumormodel, som har flere fordele i forhold til ortopiske modeller, herunder dens teknisk ligefremme protokol, let overvågning af tumorvækst, mindre dyresygelighed og højere producerbarhed. Subkutane tumormodeller kan også modificeres til en bilateral tumormodel ved at…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist støttet af Merit Review Award #I01BX004829 fra USA Department of Veterans Affairs, Biomedical Laboratory Research and Development Service og støttet af Mezhir Award Program gennem Holden Comprehensive Cancer Center ved University of Iowa.
Materials
| Bio-Plex 200 Systems | Bio-Rad | The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care | |
| Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay | Bio-Rad | M60009RDPD | |
| C57BL/6J Mice | Jakson Labs | 664 | 4 to 6 weeks old |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EGF | Millipore Sigma | SRP3196-500UG | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | 12103C-500ML | |
| Gentamycin sulfate solution | IBI Scientific | IB02030 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi biotec | ||
| Hand-Held Magnetic Plate Washer | Thermo Fisher Scientific | EPX-55555-000 | |
| Hydrocortisone | Millipore Sigma | H6909-10ML | |
| Insulin | Millipore Sigma | I0516-5ML | |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| MEERL cell line | Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells | ||
| Portable Balances | Ohaus | ||
| Scienceware Digi-Max slide caliper | Millipore Sigma | Z503576-1EA | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Cardinal | COV5110.PMP | |
| Transferrin Human | Millipore Sigma | T8158-100MG | |
| Tri-iodothyronin | Millipore Sigma | T5516-1MG |
References
- Dinarello, C. A., Simon, A., vander Meer, J. W. Treating inflammation by blocking interleukin-1 in a broad spectrum of diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (8), 633-652 (2012).
- de Mooij, C. E. M., Netea, M. G., vander Velden, W., Blijlevens, N. M. A. Targeting the interleukin-1 pathway in patients with hematological disorders. Blood. 129 (24), 3155-3164 (2017).
- Veltri, S., Smith, J. W. Interleukin 1 trials in cancer patients: a review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects. Stem Cells. 14 (2), 164-176 (1996).
- Grandis, J. R., Chang, M. J., Yu, W. D., Johnson, C. S. Antitumor activity of interleukin-1 alpha and cisplatin in a murine model system. Archives of Otolaryngology- Head & Neck Surgery. 121 (2), 197-200 (1995).
- Curti, B. D., Smith, J. W. Interleukin-1 in the treatment of cancer. Pharmacology & Therapeutics. 65 (3), 291-302 (1995).
- Smith, J. W., et al. The effects of treatment with interleukin-1 alpha on platelet recovery after high-dose carboplatin. New England Journal of Medicine. 328 (11), 756-761 (1993).
- Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).
- Carbone, A. L., Uhrich, K. E. Design and synthesis of fast-degrading Poly(anhydride-esters). Macromolecular Rapid Communications. 30 (12), 1021 (2009).
- Gopferich, A., Tessmar, J. Polyanhydride degradation and erosion. Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 911-931 (2002).
- Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (8), 889-907 (2008).
- Jain, J. P., Modi, S., Domb, A. J., Kumar, N. Role of polyanhydrides as localized drug carriers. Journal of Controlled Release : Official Journal of the Controlled Release Society. 103 (3), 541-563 (2005).
- Kumar, N., Langer, R. S., Domb, A. J. Polyanhydrides: an overview. Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 889-910 (2002).
- Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
- Seth, A., Park, H. S., Hong, K. S. Current perspective on in vivo molecular imaging of immune cells. Molecules. 22 (6), (2017).
- Espinosa-Cotton, M., et al. Interleukin-1 alpha increases antitumor efficacy of cetuximab in head and neck squamous cell carcinoma. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 79 (2019).
- Veltri, S., Smith, J. W. Interleukin 1 trials in cancer patients: A review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects. The Oncologist. 1 (4), 190-200 (1996).
