הדפסה ביולוגית תלת-ממדית של אסטרוציטים קליפת המוח מורין לרקמה דמוית עצב הנדסית
Summary
כאן אנו מדווחים על שיטה של אסטרוציטים קליפת המוח הדפסה ביולוגית 3D עבור biofabricating רקמות עצביות כדי ללמוד את הפונקציונליות של אסטרוציטים במערכת העצבים המרכזית ואת המנגנונים מעורבים תאי גליה במחלות נוירולוגיות וטיפולים.
Abstract
אסטרוציטים הם תאי גליה עם תפקיד חיוני במערכת העצבים המרכזית (מערכת העצבים המרכזית), כולל תמיכה עצבית ופונקציונליות. תאים אלה מגיבים גם לפציעות עצביות ופועלים כדי להגן על הרקמה מפני אירועים ניווניים. אין ויטרו מחקרים על תפקוד אסטרוציטים חשובים כדי לבהיר את המנגנונים המעורבים באירועים כאלה ולתרום לפיתוח טיפולים לטיפול בהפרעות נוירולוגיות. פרוטוקול זה מתאר שיטה לביו-פטרייתית מבנה רקמות דמוי עצב עשיר באסטרוציטים על ידי ביו-סינק עתיר אסטרוציטים תלת-ממדי. נעשה שימוש בביו-הדפסה תלת-ממדית מבוססת שחול בעבודה זו, ואסטרוציטים חולצו מגורי המוח של עכברי C57Bl/6. הביו-וינק הוכן על ידי ערבוב אסטרוציטים קליפת המוח ממעבר 3 לתמיסה ביו-חומרית המורכבת מג’לטין, ג’לטין-מתיאקרילויל (GelMA) ופיברינוגן, בתוספת למינין, שהציג תנאי הדפסה ביולוגית אופטימליים. תנאי הביוהדפסה בתלת-ממד מזערו את הלחץ בתאים, ותרמו לבישאיות הגבוהה של האסטרוציטים במהלך התהליך, שבו 74.08% ± 1.33% מהתאים היו ברי קיימא מיד לאחר הדפסה ביולוגית. לאחר שבוע אחד של דגירה, הכדאיות של אסטרוציטים גדלה באופן משמעותי ל 83.54% ± 3.00%, המציין כי המבנה 3D מייצג microenvironment מתאים לצמיחת התא. ההרכב הביו-חומריםי אפשר חיבור תאים והתנהגות אסטרוציטית מגורה, עם תאים המבטאים את החלבון חומצי פרברילית גליה סמן ספציפי (GFAP) ובעל מורפולוגיה אסטרוציטית טיפוסית. פרוטוקול רבייה זה מספק שיטה בעלת ערך לביו-פבריקט של רקמה דמוית עצב תלת-ממדית עשירה באסטרוציטים הדומים למיקרו-סביבה הטבעית של התאים, שימושית לחוקרים שמטרתם להבין את תפקודם של אסטרוציטים ואת יחסם למנגנונים המעורבים במחלות נוירולוגיות.
Introduction
אסטרוציטים הם סוג התא הנפוץ ביותר במערכת העצבים המרכזית (מערכת העצבים המרכזית) וממלאים תפקיד מפתח בהומאוסטזיס במוח. בנוסף לתמיכה עצבית מתמשכת, אסטרוציטים אחראים על ויסות ספיגת נוירוטרנסמיטורים, שמירה על שלמות מחסום הדם – מוח, ווויסות סינפטוגנזה עצבית1,2. אסטרוציטים יש גם תפקיד חיוני דלקת מערכת העצבים, תגובה לפציעות במוח בתהליך שמוביל תגובתיות אסטרוקטריקטית או אסטרוגליוזיס תגובתי3,4, יצירת צלקת גליה המונעת תערוכת רקמות בריאה סוכנים ניווניים5. אירוע זה גורם לשינויים בביטוי הגנים, המורפולוגיה והפונקציה6,7של אסטרוציטים . לכן, מחקרים המערבים את הפונקציונליות של אסטרוציטים מועילים לפיתוח טיפולים לטיפול בהפרעות נוירולוגיות.
מודלים במבחנה חיוניים לחקר מנגנונים הקשורים לפציעות נוירולוגיות, ולמרות שבידוד מוצלח ותרבות דו-ממדית (2D) של אסטרוציטים קליפת המוח הוקמו8, מודל זה אינו מצליח לספק סביבה מציאותית המחקה התנהגות תאים מקורית ולשכפל את המורכבות של המוח9 . במצב 2D, התמיכה המכנית והביוכימית הירודה, אינטראקציות נמוכות בין תאים לתאים ולמטריצת תאים, ושיטוח תאים המוביל להיעדר קוטביות בזאלית-אפית, משפיעים על דינמיקת איתות התא ועל התוצאות הניסיוניות המובילות לשינוי מורפולוגיה של תאים וביטוי גנים, אשר פוגעים בתגובה לטיפולים10. לכן, חשוב לפתח חלופות המספקות סביבה עצבית מציאותית יותר, במטרה לתרגם את התוצאות למרפאה.
תרבית תאים תלת מימדית (תלת-ממדית) מייצגת מודל מתקדם יותר המשיב את תכונות הנאמנות המוגברות של איברים ורקמות, כולל CNS11. לגבי תרבות גליה, מודלים תלת-ממדיים תורמים לשמירה על מורפולוגיה אסטרוציטים, קוטביות בזאלית-אפית של תאים, ואיתות תאים12,13. טכנולוגיית הביו-הדפסה בתלת-ממד התפתחה ככלי רב עוצמה לביו-פבריות של רקמות חיות תלת-ממדיות באופן מבוקר באמצעות תאים וביו-חומרים כדי לשחזר את המבנה והמאפיינים של רקמות מקומיות. השימוש בטכנולוגיה זו הוביל לשיפור משמעותי בחיזוי התוצאות ותרם לרפואה רגנרטיבית המיושמת ב- CNS14,15,16.
הפרוטוקול המתואר כאן מפרט את הבידוד והתרבות של אסטרוציטים קליפת המוח. הפרוטוקול מפרט גם שיטה לשחזור אסטרוציטים ביו-הדפסה מוטבע ג’לטין / ג’לטין מתאקרילויל (GelMA)/פיברינוגן, בתוספת למינין. בעבודה זו, ביו-הדפסה מבוססת שחול שימשה להדפסת ההרכב הביו-חומרי המכיל אסטרוציטים קליפת המוח בצפיפות של 1 x 106 תאים/מ”ל. לחץ הגיוטה של ביו-הדפסה צומצם על ידי שליטה במהירות ההדפסה, ואסטרוציטים הראו כדאיות גבוהה לאחר התהליך. מבנים מודפסים ביו-מודפסים היו מתורבתים במשך שבוע אחד, ואסטרוציטים הצליחו להתפשט, לצרף ולשרוד בתוך ההידרוג’ל, לשמור על המורפולוגיה האסטרוציטית ולהביע סמן ספציפי של חלבון חומצי גליה (GFAP)4.
הליך זה תואם עם ביו-הדפסה מונחית בוכנה וניתן להשתמש בו כדי לבצע אסטרוציטים בהדפסה ביולוגית שמקורם במקורות שונים. המודל המודפס בתלת-ממד המוצע כאן מתאים למגוון רחב של יישומי הנדסה עצבית, כגון מחקרים של המנגנונים המעורבים בפונקציונליות אסטרוציטים ברקמות בריאות והבנת התקדמות הפתולוגיות הנוירולוגיות ופיתוח הטיפול.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכנולוגיית הביו-הדפסה התת-ממדית התפתחה כחלופה ביו-פיברית המאפשרת הנדסת מבנים מעודנים הדומים מבחינה מבנית ופיזיולוגית לרקמות מקומיות22, כולל המוח23. biofabrication של רקמות דמויי עצבים מאפשר הנדסה במבחנה מיקרו-וירוסמנט מקומי מודלים, להיות כלי חשוב להבנת המנגנונים ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר של סאו פאולו (FAPESP), מספרי מענקים 2018/23039-3 ו-2018/12605-8; המועצה הלאומית לפיתוח מדעי וטכנולוגי (CNPq), מספרי מענקים 465656/2014-5 ו-309679/2018-4; ותיאום לשיפור כוח האדם להשכלה גבוהה (CAPES), קוד פיננסי 001.
Materials
| 3D Bioprinter | 3D Biotechnology Solutions | Extrusion-based bioprinter | |
| Blunt-tip forceps | Integra Miltex | 6–30 | Forceps for brain dissection previously sterilized |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | Protease free, fatty acid free, essentially globulin free |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Cell culture flask | Fisher Scientific | 156340 | Culture flask T25 |
| Cell strainer | Corning Incorporated | 352340 | Cell strainer 40 µm |
| Confocal microscope | Leica | Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system | |
| Conical tubes | Thermo Scientific | 339651, 339652 | Sterile tubes of 15 mL and 50 mL |
| DAPI | Abcam | ab224589 | DAPI staining solution |
| DMEM/F12 | Gibco; Life Technologies Corporation | 12500062 | DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
| Dyalisis tubing | Sigma-Aldrich | D9527 | Molecular weight cut-off = 14 kDa |
| Ethanol | Fisher Scientific | 64-15-5 | Reagent grade |
| Fetal Bovine Serum | Gibco; Life Technologies Corporation | 12657011 | Research Grade |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | 9001-32-5 | Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | Gelatin powder from porcine skin |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 56-40-6 | Glycine powder |
| Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco; Life Technologies Corporation | 14175095 | No calcium, no magnesium, no phenol red |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 56-85-9 | L-Glutamine crystalline powder |
| Laminin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl |
| Live dead kit cell imaging kit | Thermo Scientific | R37601 | Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm) |
| Methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 760-93-0 | For GelMA preparation |
| Microtubes | Corning Incorporated | MCT-150-C | Microtubes of 1,5 mL |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Needle 22G | Fisher Scientific | NC1362045 | Sterile blunt needle |
| Operating scissor | Integra Miltex | 05–02 | Sharp scissor for brain dissection previously sterilized |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Paraformaldehyde powder |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco; Life Technologies Corporation | 15070063 | Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin) |
| Petri dish | Corning Incorporated | 430591, 430588 | Sterile petri dishes of 35 and 100 mm |
| Phalloidin | Abcam | ab176753 | iFluor 488 reagent |
| Photoinitiator | Sigma-Aldrich | 106797-53-9 | 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Gibco; Life Technologies Corporation | 10010023 | PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000 |
| Primary antobody | Abcam | ab4674 | Chicken polyclonal to GFAP |
| Secondary antibody | Abcam | ab150176 | Alexa fluor 594 anti-chicken |
| Spatula | Miltex | V973-70 | Number 24 cement spatula previously sterilized |
| Stereomicroscope | Fisherbrand | 3000038 | Microscope for brain dissection |
| Syringe 5 mL | BD | 1222C84 | Sterile syringe |
| Syringe filter 2 µm | Fisher Scientific | 09-740-105 | Polypropylene filter for sterilization |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | 9002–04-4 | Thrombin cristalline powder from bovine plasma |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Laboratory grade |
| Trypsin-EDTA | Gibco; Life Technologies Corporation | 15400054 | Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS |
| Versene solution | Gibco; Life Technologies Corporation | 15040066 | Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS |
| Well plate | Thermo Scientific | 144530 | Sterile 24-well plate |
References
- Di, L., Mannelli, C., Cuzzocrea, S. Astrocytes: Role and functions in brain pathologies. Frontiers in Pharmacology. 10, 1114 (2019).
- Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of astrocytes and their potential as therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7 (4), 338-353 (2010).
- Giovannoni, F., Quintana, F. J. The role of astrocytes in CNS inflammation. Trends in Immunology. 41 (9), 805-819 (2020).
- Escartin, C., et al. Reactive astrocyte nomenclature, definitions, and future directions. Nature Neuroscience. 24 (3), 312-325 (2021).
- Carson, M. J., Thrash, J. C., Walter, B. The cellular response in neuroinflammation: The role of leukocytes, microglia and astrocytes in neuronal death and survival. Clinical Neuroscience Research. 6 (5), 237-245 (2006).
- Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential. Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).
- Clarke, L. E., et al. Normal aging induces A1-like astrocyte reactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unied States of America. 115 (8), 1896-1905 (2018).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e50079 (2013).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Knight, E., Przyborski, S. Advances in 3D cell culture technologies enabling tissue-like structures to be created in vitro. Journal of Anatomy. 227 (6), 746-756 (2015).
- Zhuang, P., Sun, A. X., An, J., Chua, C. K., Chew, S. Y. 3D neural tissue models: From spheroids to bioprinting. Biomaterials. 154, 113-133 (2018).
- Balasubramanian, S., Packard, J. A., Leach, J. B., Powell, E. M. Three-dimensional environment sustains morphological heterogeneity and promotes phenotypic progression. Tissue Engineering. Part A. 22 (11-12), 885-898 (2016).
- Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D glial cell culture systems and applications for neurodegeneration and neuroinflammation. SLAS Discovery. 22 (5), 583-601 (2017).
- Li, Y. E., Jodat, Y. A., Samanipour, R., Zorzi, G., Zhu, K. Toward a neurospheroid niche model: optimizing embedded 3D bioprinting for fabrication of neurospheroid brain-like co-culture constructs. Biofabrication. , (2020).
- Zhou, X., et al. Three-dimensional-bioprinted dopamine-based matrix for promoting neural regeneration. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (10), 8993-9001 (2018).
- de la Vega, L., et al. 3D bioprinting human induced pluripotent stem cell-derived neural tissues using a novel lab-on-a-printer technology. Applied Sciences. 8 (12), 2414 (2018).
- Scheraga, H. A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).
- Ariens, R. A. S., Lai, T., Weisel, J. W., Greenberg, C. S., Grant, P. J. Role of factor XIII in fibrin clot formation and effects of genetic polymorphisms. Blood. 100 (3), 743-754 (2002).
- Yue, K., et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of Gelatin Methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
- de Melo, B. A. G., et al. Strategies to use fibrinogen as bioink for 3D bioprinting fibrin-based soft and hard tissues. Acta Biomaterialia. 117, 60-76 (2020).
- Wang, X., et al. Gelatin-based hydrogels for organ 3D bioprinting. Polymers (Basel). 9 (9), 401 (2017).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Naure. Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
- de la Vega, L., Lee, C., Sharma, R., Amereh, M., Willerth, S. M. 3D bioprinting models of neural tissues: The current state of the field and future directions. Brain Research Bulletin. 150, 240-249 (2019).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
- Hanu, R., et al. Monocarboxylic acid transporters, MCT1 and MCT2, in cortical astrocytes in vitro and in vivo. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 278 (5), 921-930 (2000).
- Liu, R., Wang, Z. h., Gou, L., Xu, H. A cortical astrocyte subpopulation inhibits axon growth in vitro and in vivo. Molecular Medicine Reports. 12 (2), 2598-2606 (2015).
- Winter, C. C., Cullen, D. K., Donnell, J. C. O., Song, Y. J., Hernandez, N. S. Three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55848 (2018).
- East, E., Golding, J. P., Phillips, J. B. A versatile 3D culture model facilitates monitoring of astrocytes undergoing reactive gliosis. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 3 (8), 634-646 (2009).
- Hawkinsn, B. T., Grego, S., Sellgren, K. L. Three-dimensional culture conditions differentially affect astrocyte modulation of brain endothelial barrier function in response to transforming growth factor B1. Brain Research. 1608, 167-176 (2015).
- Abelseth, E., et al. 3D printing of neural tissues derived from human induced pluripotent stem cells using a fibrin-based bioink. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (1), 234-243 (2019).
- Filippo, T. R. M., et al. CXCL12 N-terminal end is sufficient to induce chemotaxis and proliferation of neural stem/progenitor cells. Stem Cell Research. 11 (2), 913-925 (2013).
- Galindo, L. T., et al. Chondroitin sulfate impairs neural stem cell migration through ROCK activation. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3185-3195 (2018).
- Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 03001 (2018).
- Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-sabah, A., Whitaker, I. S. Printability of candidate biomaterials for extrusion-based 3D printing: state-of-the-art. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), (2017).
- Blaeser, A., et al. Controlling shear stress in 3D bioprinting is a key factor to balance printing resolution and stem cell integrity. Advanced Healthcare Materials. 5 (3), 326-333 (2016).
- Miyawaki, O., Omote, C., Matsuhira, K. Thermodynamic analysis of sol-gel transition of gelatin in terms of water activity in various solutions. Biopolymers. 103 (12), 685-691 (2015).
- Shirahama, H., Lee, B. H., Tan, L. P., Cho, N. Precise tuning of facile one-pot Gelatin Methacryloyl (GelMA) synthesis. Science Reports. 6, 31036 (2016).
- Antonovaite, N., Beekmans, S. V., Hol, E. M., Wadman, W. J., Iannuzzi, D. Regional variations in stiffness in live mouse brain tissue determined by depth-controlled indentation mapping. Science Reports. 8 (1), 12517 (2018).
- Iwashita, M., et al. Comparative analysis of brain stiffness among amniotes using glyoxal fixation and atomic force microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619 (2020).
- Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews. 5, 351-370 (2010).
- Ye, W., et al. 3D printing of gelatin methacrylate-based nerve guidance conduits with multiple channels. Materials and Design. 192, 108757 (2020).
- Wu, Y., et al. The influence of the stiffness of GelMA substrate on the outgrowth of PC12 cells. Bioscience Reports. 39 (1), 1-9 (2019).
- Edgar, J. M., Robinson, M., Willerth, S. M. Fibrin hydrogels induce mixed dorsal/ventral spinal neuron identities during differentiation of human induced pluripotent stem cells. Acta Biomaterialia. 51, 237-245 (2017).
- Arulmoli, J., et al. Combination scaffolds of salmon fibrin, hyaluronic acid, and laminin for human neural stem cell and vascular tissue engineering. Acta Biomaterialia. 43, 122-138 (2016).
- Brenner, M. Role of GFAP in CNS Injuries. Neuroscience. Letters. 565, 7-13 (2014).
