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Bioengineering

ニューラル様組織の工学的なマウス皮質アストロサイトの3Dバイオプリンティング

Published: July 16, 2021
doi:
10.3791/62691
, , , ,
1Department of Biochemistry, Escola Paulista de Medicina,Universidade Federal de São Paulo

Summary

ここでは、中枢神経系におけるアストロサイトの機能性と神経疾患や治療におけるグリア細胞を含むメカニズムを研究するために、神経様組織をバイオファブリケートするための3Dバイオプリン皮質アストロサイトの方法を報告する。

Abstract

アストロサイトは、神経の支持および機能性を含む中枢神経系(CNS)に不可欠な役割を持つグリア細胞である。これらの細胞はまた、神経損傷に応答し、変性事象から組織を保護するために作用します。アストロサイトの機能性の インビトロ 研究は、このような事象に関与するメカニズムを解明し、神経疾患を治療するための治療法の開発に貢献するために重要である。このプロトコルは、3Dバイオプリンティングアストロサイトを含むバイオインクによってアストロサイトに富んだ神経様組織構造をバイオファブリケートする方法を説明する。この研究では、押出ベースの3Dバイオプリンターを使用し、C57Bl/ 6マウスの脳皮質からアストロサイトを抽出した。バイオインクは、ゼラチン、ゼラチンメタクリロイル(GelMA)、フィブリノーゲンからなる生体材料溶液に皮質アストロサイトを最大3から混合して調製し、最適なバイオプリンティング条件を提示した。3Dバイオプリンティング条件は細胞ストレスを最小限に抑え、74.08%±細胞がバイオプリンティング直後に生存可能であったプロセス中のアストロサイトの高い生存率に寄与した。インキュベーションの1週間後、アストロサイトの生存率は3.00%±83.54%に有意に増加し、3D構築物が細胞増殖に適した微小環境を表すことを示している。生体材料組成物は、細胞結合および刺激された星状細胞の挙動を可能にし、細胞は特異的なアストロサイトマーカーの線維性酸性タンパク質(GFAP)を発現し、典型的な星状形態を有する。この再現性プロトコルは、細胞の天然微小環境に似たアストロサイトに富んだ3D神経様組織をバイオファブリケートする貴重な方法であり、アストロサイトの機能性と神経疾患に関与するメカニズムとの関係を理解することを目的とした研究者に有用である。

Introduction

アストロサイトは中枢神経系(CNS)の中枢細胞の中で最も豊富な細胞型であり、脳恒常性において重要な役割を果たす。神経細胞の永続的なサポートに加えて、アストロサイトは神経伝達物質の取り込みを調節し、血液脳関門の完全性を維持し、ニューロンシナプス発生1、2を調節する役割を果たします。アストロサイトはまた、CNS炎症に必須の役割を有し、アストロシタリ機能または反応性アストログリオーシス3、4に至る過程で脳の傷害に反応し、変性剤5に対する健康な組織の広がりを防ぐグリア瘢痕を形成する。この事象は、アストロサイトの遺伝子発現、形態、および機能6,7の変化をもたらす。したがって、アストロサイトの機能性を含む研究は、神経疾患を治療するための治療法の開発に役立ちます。

インビトロ モデルは神経損傷に関連するメカニズムを研究するために重要であり、皮質アストロサイトの正常な分離と2次元(2D)培養が確立されたが、このモデルは、ネイティブの細胞挙動を模倣し、脳の複雑さを再現する現実的な環境を提供することができない.2D条件では、機械的および生化学的支持が悪いこと、低細胞および細胞マトリックス相互作用、および基底-腹極性の欠如につながる細胞平坦化は、細胞のシグナル伝達ダイナミクスおよび細胞形態および遺伝子発現の変化をもたらす実験的結果に影響を及ぼし、治療10に対する応答性を損なう。したがって、より現実的な神経環境を提供する代替案を開発し、その結果をクリニックに翻訳することを目指することが重要です。

3次元(3D)細胞培養は、CNS11を含む器官および組織の忠実性の高い特徴を再現する、より高度なモデルを表す。グリア培養に関しては、3Dモデルは、アストロサイト形態、細胞基底-極性、および細胞シグナル伝達12,13の維持に寄与する。3Dバイオプリンティング技術は、細胞と生体材料を使用してネイティブ組織の構造と特性を再現することで、3D生体組織を制御された方法でバイオハブ化する強力なツールとして登場しました。この技術の使用は、結果予測の大幅な改善につながり、CNS14、15、16に適用される再生医療に貢献しています。

ここで説明するプロトコルは、皮質アストロサイトの分離と培養について詳述する。このプロトコルはまた、ラミニンを補充したゼラチン/ゼラチンメタクリロイル(GelMA)/フィブリノーゲンに埋め込まれたアストロサイトをバイオプリントする再現可能な方法を詳述する。本研究では、1 x106細胞/mLの密度で皮質アストロサイトを含む生体材料組成物を印刷するために、押出ベースのバイオプリンターを使用した。バイオプリンティングせん断応力は、印刷速度を制御することによって最小限に抑え、そして、アストロサイトは、プロセス後に高い生存率を示した。バイオプリント構築物を1週間培養し、アストロサイトはヒドロゲル内で広がり、付着し、生存し、星状形態を維持し、特異的マーカーグリア性フィブリラリー酸性タンパク質(GFAP)4を発現することができた。

この手順は、ピストン駆動押出ベースのバイオプリンターと互換性があり、異なるソースから得られたバイオプリントアストロサイトに使用することができます。ここで提案される3Dバイオプリントモデルは、健康組織のアストロサイト機能に関与するメカニズムの研究や、神経学的病理の進行や治療開発の理解など、幅広い神経工学用途に適しています。

Protocol

動物に関するすべての手順は、研究における動物の使用に関する国際的なガイドライン(http://www.iclas.org)に従い(http://www.iclas.org)、サンパウロ連邦大学研究倫理委員会(CEUA 2019/9292090519)によって承認されました。 1. マウスの脳解剖 冷たいハンクス緩衝塩溶液(HBSS)の10 mLを100mm培養皿に、1 mLを1.5 mLマイクロチューブに移します。動物1匹につき1本のマイクロチューブを?…

Representative Results

この研究は、3Dバイオプリンティング技術を用いて、層ごとの一次アストロサイトを含むゼラチン/GelMA/フィブリノーゲンバイオインクを堆積させる神経様組織の開発を目的とした。アストロサイトをマウスの子犬の大脳皮質(図1)から抽出して単離し、生体物質組成物に添加し、生きた3D構築物のバイオファブリケーションを可能にした。 コンピュー…

Discussion

3Dバイオプリンティング技術は、脳23を含む天然組織22に構造的および生理的に類似した精製構造の工学を可能にするバイオファブリケーション代替手段として浮上している。神経様組織のバイオファブリケーションは、生体外の天然の微小環境モデリングを可能にし、CNS11に影響を及ぼす多くの疾患の開発および治療に関連する細胞および分子<sup cla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究はサンパウロ研究財団(FAPESP)、助成金番号2018/23039-3および2018/12605-8によって支えられました。国家科学技術開発評議会(CNPq)、助成金数465656/2014-5および309679/2018-4;高等教育人材の向上のための調整 (CAPES), 金融コード 001.

Materials

3D Bioprinter 3D Biotechnology Solutions Extrusion-based bioprinter
Blunt-tip forceps Integra Miltex 6–30 Forceps for brain dissection previously sterilized
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich 9048-46-8 Protease free, fatty acid free, essentially globulin free
CaCl2 Sigma-Aldrich 10043-52-4
Cell culture flask Fisher Scientific 156340 Culture flask T25
Cell strainer Corning Incorporated 352340 Cell strainer 40 µm
Confocal microscope Leica Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system
Conical tubes Thermo Scientific 339651, 339652 Sterile tubes of 15 mL and 50 mL
DAPI Abcam ab224589 DAPI staining solution
DMEM/F12 Gibco; Life Technologies Corporation 12500062 DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Dyalisis tubing Sigma-Aldrich D9527 Molecular weight cut-off = 14 kDa
Ethanol Fisher Scientific 64-15-5 Reagent grade
Fetal Bovine Serum Gibco; Life Technologies Corporation 12657011 Research Grade
Fibrinogen Sigma-Aldrich 9001-32-5 Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma
Gelatin Sigma-Aldrich 9000-70-8 Gelatin powder from porcine skin
Glycine Sigma-Aldrich 56-40-6 Glycine powder
Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) Gibco; Life Technologies Corporation 14175095 No calcium, no magnesium, no phenol red
L-Glutamine Sigma-Aldrich 56-85-9 L-Glutamine crystalline powder
Laminin Sigma-Aldrich 114956-81-9 Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl
Live dead kit cell imaging kit Thermo Scientific R37601 Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Methacrylic anhydride Sigma-Aldrich 760-93-0 For GelMA preparation
Microtubes Corning Incorporated MCT-150-C Microtubes of 1,5 mL
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
Needle 22G Fisher Scientific NC1362045 Sterile blunt needle
Operating scissor Integra Miltex 05–02 Sharp scissor for brain dissection previously sterilized
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 30525-89-4 Paraformaldehyde powder
Penicillin/Streptomycin Gibco; Life Technologies Corporation 15070063 Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)
Petri dish Corning Incorporated 430591, 430588 Sterile petri dishes of 35 and 100 mm
Phalloidin Abcam ab176753 iFluor 488 reagent
Photoinitiator Sigma-Aldrich 106797-53-9 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone
Phosphate buffer saline (PBS) Gibco; Life Technologies Corporation 10010023 PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich 25988-63-0 Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000
Primary antobody Abcam ab4674 Chicken polyclonal to GFAP
Secondary antibody Abcam ab150176 Alexa fluor 594 anti-chicken
Spatula Miltex V973-70 Number 24 cement spatula previously sterilized
Stereomicroscope Fisherbrand 3000038 Microscope for brain dissection
Syringe 5 mL BD 1222C84 Sterile syringe
Syringe filter 2 µm Fisher Scientific 09-740-105 Polypropylene filter for sterilization
Thrombin Sigma-Aldrich 9002–04-4 Thrombin cristalline powder from bovine plasma
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9002-93-1 Laboratory grade
Trypsin-EDTA Gibco; Life Technologies Corporation 15400054 Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS
Versene solution Gibco; Life Technologies Corporation 15040066 Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS
Well plate Thermo Scientific 144530 Sterile 24-well plate
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References

  1. Di, L., Mannelli, C., Cuzzocrea, S. Astrocytes: Role and functions in brain pathologies. Frontiers in Pharmacology. 10, 1114 (2019).
  2. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of astrocytes and their potential as therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7 (4), 338-353 (2010).
  3. Giovannoni, F., Quintana, F. J. The role of astrocytes in CNS inflammation. Trends in Immunology. 41 (9), 805-819 (2020).
  4. Escartin, C., et al. Reactive astrocyte nomenclature, definitions, and future directions. Nature Neuroscience. 24 (3), 312-325 (2021).
  5. Carson, M. J., Thrash, J. C., Walter, B. The cellular response in neuroinflammation: The role of leukocytes, microglia and astrocytes in neuronal death and survival. Clinical Neuroscience Research. 6 (5), 237-245 (2006).
  6. Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential. Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).
  7. Clarke, L. E., et al. Normal aging induces A1-like astrocyte reactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unied States of America. 115 (8), 1896-1905 (2018).
  8. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e50079 (2013).
  9. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  10. Knight, E., Przyborski, S. Advances in 3D cell culture technologies enabling tissue-like structures to be created in vitro. Journal of Anatomy. 227 (6), 746-756 (2015).
  11. Zhuang, P., Sun, A. X., An, J., Chua, C. K., Chew, S. Y. 3D neural tissue models: From spheroids to bioprinting. Biomaterials. 154, 113-133 (2018).
  12. Balasubramanian, S., Packard, J. A., Leach, J. B., Powell, E. M. Three-dimensional environment sustains morphological heterogeneity and promotes phenotypic progression. Tissue Engineering. Part A. 22 (11-12), 885-898 (2016).
  13. Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D glial cell culture systems and applications for neurodegeneration and neuroinflammation. SLAS Discovery. 22 (5), 583-601 (2017).
  14. Li, Y. E., Jodat, Y. A., Samanipour, R., Zorzi, G., Zhu, K. Toward a neurospheroid niche model: optimizing embedded 3D bioprinting for fabrication of neurospheroid brain-like co-culture constructs. Biofabrication. , (2020).
  15. Zhou, X., et al. Three-dimensional-bioprinted dopamine-based matrix for promoting neural regeneration. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (10), 8993-9001 (2018).
  16. de la Vega, L., et al. 3D bioprinting human induced pluripotent stem cell-derived neural tissues using a novel lab-on-a-printer technology. Applied Sciences. 8 (12), 2414 (2018).
  17. Scheraga, H. A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).
  18. Ariens, R. A. S., Lai, T., Weisel, J. W., Greenberg, C. S., Grant, P. J. Role of factor XIII in fibrin clot formation and effects of genetic polymorphisms. Blood. 100 (3), 743-754 (2002).
  19. Yue, K., et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of Gelatin Methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  20. de Melo, B. A. G., et al. Strategies to use fibrinogen as bioink for 3D bioprinting fibrin-based soft and hard tissues. Acta Biomaterialia. 117, 60-76 (2020).
  21. Wang, X., et al. Gelatin-based hydrogels for organ 3D bioprinting. Polymers (Basel). 9 (9), 401 (2017).
  22. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Naure. Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
  23. de la Vega, L., Lee, C., Sharma, R., Amereh, M., Willerth, S. M. 3D bioprinting models of neural tissues: The current state of the field and future directions. Brain Research Bulletin. 150, 240-249 (2019).
  24. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
  25. Hanu, R., et al. Monocarboxylic acid transporters, MCT1 and MCT2, in cortical astrocytes in vitro and in vivo. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 278 (5), 921-930 (2000).
  26. Liu, R., Wang, Z. h., Gou, L., Xu, H. A cortical astrocyte subpopulation inhibits axon growth in vitro and in vivo. Molecular Medicine Reports. 12 (2), 2598-2606 (2015).
  27. Winter, C. C., Cullen, D. K., Donnell, J. C. O., Song, Y. J., Hernandez, N. S. Three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55848 (2018).
  28. East, E., Golding, J. P., Phillips, J. B. A versatile 3D culture model facilitates monitoring of astrocytes undergoing reactive gliosis. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 3 (8), 634-646 (2009).
  29. Hawkinsn, B. T., Grego, S., Sellgren, K. L. Three-dimensional culture conditions differentially affect astrocyte modulation of brain endothelial barrier function in response to transforming growth factor B1. Brain Research. 1608, 167-176 (2015).
  30. Abelseth, E., et al. 3D printing of neural tissues derived from human induced pluripotent stem cells using a fibrin-based bioink. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (1), 234-243 (2019).
  31. Filippo, T. R. M., et al. CXCL12 N-terminal end is sufficient to induce chemotaxis and proliferation of neural stem/progenitor cells. Stem Cell Research. 11 (2), 913-925 (2013).
  32. Galindo, L. T., et al. Chondroitin sulfate impairs neural stem cell migration through ROCK activation. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3185-3195 (2018).
  33. Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 03001 (2018).
  34. Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-sabah, A., Whitaker, I. S. Printability of candidate biomaterials for extrusion-based 3D printing: state-of-the-art. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), (2017).
  35. Blaeser, A., et al. Controlling shear stress in 3D bioprinting is a key factor to balance printing resolution and stem cell integrity. Advanced Healthcare Materials. 5 (3), 326-333 (2016).
  36. Miyawaki, O., Omote, C., Matsuhira, K. Thermodynamic analysis of sol-gel transition of gelatin in terms of water activity in various solutions. Biopolymers. 103 (12), 685-691 (2015).
  37. Shirahama, H., Lee, B. H., Tan, L. P., Cho, N. Precise tuning of facile one-pot Gelatin Methacryloyl (GelMA) synthesis. Science Reports. 6, 31036 (2016).
  38. Antonovaite, N., Beekmans, S. V., Hol, E. M., Wadman, W. J., Iannuzzi, D. Regional variations in stiffness in live mouse brain tissue determined by depth-controlled indentation mapping. Science Reports. 8 (1), 12517 (2018).
  39. Iwashita, M., et al. Comparative analysis of brain stiffness among amniotes using glyoxal fixation and atomic force microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619 (2020).
  40. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews. 5, 351-370 (2010).
  41. Ye, W., et al. 3D printing of gelatin methacrylate-based nerve guidance conduits with multiple channels. Materials and Design. 192, 108757 (2020).
  42. Wu, Y., et al. The influence of the stiffness of GelMA substrate on the outgrowth of PC12 cells. Bioscience Reports. 39 (1), 1-9 (2019).
  43. Edgar, J. M., Robinson, M., Willerth, S. M. Fibrin hydrogels induce mixed dorsal/ventral spinal neuron identities during differentiation of human induced pluripotent stem cells. Acta Biomaterialia. 51, 237-245 (2017).
  44. Arulmoli, J., et al. Combination scaffolds of salmon fibrin, hyaluronic acid, and laminin for human neural stem cell and vascular tissue engineering. Acta Biomaterialia. 43, 122-138 (2016).
  45. Brenner, M. Role of GFAP in CNS Injuries. Neuroscience. Letters. 565, 7-13 (2014).

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de Melo, B. A. G., Cruz, E. M., Ribeiro, T. N., Mundim, M. V., Porcionatto, M. A. 3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue. J. Vis. Exp. (173), e62691, doi:10.3791/62691 (2021).
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