ここでは、中枢神経系におけるアストロサイトの機能性と神経疾患や治療におけるグリア細胞を含むメカニズムを研究するために、神経様組織をバイオファブリケートするための3Dバイオプリン皮質アストロサイトの方法を報告する。
アストロサイトは、神経の支持および機能性を含む中枢神経系(CNS)に不可欠な役割を持つグリア細胞である。これらの細胞はまた、神経損傷に応答し、変性事象から組織を保護するために作用します。アストロサイトの機能性の インビトロ 研究は、このような事象に関与するメカニズムを解明し、神経疾患を治療するための治療法の開発に貢献するために重要である。このプロトコルは、3Dバイオプリンティングアストロサイトを含むバイオインクによってアストロサイトに富んだ神経様組織構造をバイオファブリケートする方法を説明する。この研究では、押出ベースの3Dバイオプリンターを使用し、C57Bl/ 6マウスの脳皮質からアストロサイトを抽出した。バイオインクは、ゼラチン、ゼラチンメタクリロイル(GelMA)、フィブリノーゲンからなる生体材料溶液に皮質アストロサイトを最大3から混合して調製し、最適なバイオプリンティング条件を提示した。3Dバイオプリンティング条件は細胞ストレスを最小限に抑え、74.08%±細胞がバイオプリンティング直後に生存可能であったプロセス中のアストロサイトの高い生存率に寄与した。インキュベーションの1週間後、アストロサイトの生存率は3.00%±83.54%に有意に増加し、3D構築物が細胞増殖に適した微小環境を表すことを示している。生体材料組成物は、細胞結合および刺激された星状細胞の挙動を可能にし、細胞は特異的なアストロサイトマーカーの線維性酸性タンパク質(GFAP)を発現し、典型的な星状形態を有する。この再現性プロトコルは、細胞の天然微小環境に似たアストロサイトに富んだ3D神経様組織をバイオファブリケートする貴重な方法であり、アストロサイトの機能性と神経疾患に関与するメカニズムとの関係を理解することを目的とした研究者に有用である。
アストロサイトは中枢神経系(CNS)の中枢細胞の中で最も豊富な細胞型であり、脳恒常性において重要な役割を果たす。神経細胞の永続的なサポートに加えて、アストロサイトは神経伝達物質の取り込みを調節し、血液脳関門の完全性を維持し、ニューロンシナプス発生1、2を調節する役割を果たします。アストロサイトはまた、CNS炎症に必須の役割を有し、アストロシタリ機能または反応性アストログリオーシス3、4に至る過程で脳の傷害に反応し、変性剤5に対する健康な組織の広がりを防ぐグリア瘢痕を形成する。この事象は、アストロサイトの遺伝子発現、形態、および機能6,7の変化をもたらす。したがって、アストロサイトの機能性を含む研究は、神経疾患を治療するための治療法の開発に役立ちます。
インビトロ モデルは神経損傷に関連するメカニズムを研究するために重要であり、皮質アストロサイトの正常な分離と2次元(2D)培養が確立されたが、このモデルは、ネイティブの細胞挙動を模倣し、脳の複雑さを再現する現実的な環境を提供することができない.2D条件では、機械的および生化学的支持が悪いこと、低細胞および細胞マトリックス相互作用、および基底-腹極性の欠如につながる細胞平坦化は、細胞のシグナル伝達ダイナミクスおよび細胞形態および遺伝子発現の変化をもたらす実験的結果に影響を及ぼし、治療10に対する応答性を損なう。したがって、より現実的な神経環境を提供する代替案を開発し、その結果をクリニックに翻訳することを目指することが重要です。
3次元(3D)細胞培養は、CNS11を含む器官および組織の忠実性の高い特徴を再現する、より高度なモデルを表す。グリア培養に関しては、3Dモデルは、アストロサイト形態、細胞基底-極性、および細胞シグナル伝達12,13の維持に寄与する。3Dバイオプリンティング技術は、細胞と生体材料を使用してネイティブ組織の構造と特性を再現することで、3D生体組織を制御された方法でバイオハブ化する強力なツールとして登場しました。この技術の使用は、結果予測の大幅な改善につながり、CNS14、15、16に適用される再生医療に貢献しています。
ここで説明するプロトコルは、皮質アストロサイトの分離と培養について詳述する。このプロトコルはまた、ラミニンを補充したゼラチン/ゼラチンメタクリロイル(GelMA)/フィブリノーゲンに埋め込まれたアストロサイトをバイオプリントする再現可能な方法を詳述する。本研究では、1 x106細胞/mLの密度で皮質アストロサイトを含む生体材料組成物を印刷するために、押出ベースのバイオプリンターを使用した。バイオプリンティングせん断応力は、印刷速度を制御することによって最小限に抑え、そして、アストロサイトは、プロセス後に高い生存率を示した。バイオプリント構築物を1週間培養し、アストロサイトはヒドロゲル内で広がり、付着し、生存し、星状形態を維持し、特異的マーカーグリア性フィブリラリー酸性タンパク質(GFAP)4を発現することができた。
この手順は、ピストン駆動押出ベースのバイオプリンターと互換性があり、異なるソースから得られたバイオプリントアストロサイトに使用することができます。ここで提案される3Dバイオプリントモデルは、健康組織のアストロサイト機能に関与するメカニズムの研究や、神経学的病理の進行や治療開発の理解など、幅広い神経工学用途に適しています。
3Dバイオプリンティング技術は、脳23を含む天然組織22に構造的および生理的に類似した精製構造の工学を可能にするバイオファブリケーション代替手段として浮上している。神経様組織のバイオファブリケーションは、生体外の天然の微小環境モデリングを可能にし、CNS11に影響を及ぼす多くの疾患の開発および治療に関連する細胞および分子<sup cla…
The authors have nothing to disclose.
この研究はサンパウロ研究財団(FAPESP)、助成金番号2018/23039-3および2018/12605-8によって支えられました。国家科学技術開発評議会(CNPq)、助成金数465656/2014-5および309679/2018-4;高等教育人材の向上のための調整 (CAPES), 金融コード 001.
3D Bioprinter | 3D Biotechnology Solutions | Extrusion-based bioprinter | |
Blunt-tip forceps | Integra Miltex | 6–30 | Forceps for brain dissection previously sterilized |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | Protease free, fatty acid free, essentially globulin free |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
Cell culture flask | Fisher Scientific | 156340 | Culture flask T25 |
Cell strainer | Corning Incorporated | 352340 | Cell strainer 40 µm |
Confocal microscope | Leica | Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system | |
Conical tubes | Thermo Scientific | 339651, 339652 | Sterile tubes of 15 mL and 50 mL |
DAPI | Abcam | ab224589 | DAPI staining solution |
DMEM/F12 | Gibco; Life Technologies Corporation | 12500062 | DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
Dyalisis tubing | Sigma-Aldrich | D9527 | Molecular weight cut-off = 14 kDa |
Ethanol | Fisher Scientific | 64-15-5 | Reagent grade |
Fetal Bovine Serum | Gibco; Life Technologies Corporation | 12657011 | Research Grade |
Fibrinogen | Sigma-Aldrich | 9001-32-5 | Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma |
Gelatin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | Gelatin powder from porcine skin |
Glycine | Sigma-Aldrich | 56-40-6 | Glycine powder |
Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco; Life Technologies Corporation | 14175095 | No calcium, no magnesium, no phenol red |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 56-85-9 | L-Glutamine crystalline powder |
Laminin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl |
Live dead kit cell imaging kit | Thermo Scientific | R37601 | Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm) |
Methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 760-93-0 | For GelMA preparation |
Microtubes | Corning Incorporated | MCT-150-C | Microtubes of 1,5 mL |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
Needle 22G | Fisher Scientific | NC1362045 | Sterile blunt needle |
Operating scissor | Integra Miltex | 05–02 | Sharp scissor for brain dissection previously sterilized |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Paraformaldehyde powder |
Penicillin/Streptomycin | Gibco; Life Technologies Corporation | 15070063 | Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin) |
Petri dish | Corning Incorporated | 430591, 430588 | Sterile petri dishes of 35 and 100 mm |
Phalloidin | Abcam | ab176753 | iFluor 488 reagent |
Photoinitiator | Sigma-Aldrich | 106797-53-9 | 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone |
Phosphate buffer saline (PBS) | Gibco; Life Technologies Corporation | 10010023 | PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000 |
Primary antobody | Abcam | ab4674 | Chicken polyclonal to GFAP |
Secondary antibody | Abcam | ab150176 | Alexa fluor 594 anti-chicken |
Spatula | Miltex | V973-70 | Number 24 cement spatula previously sterilized |
Stereomicroscope | Fisherbrand | 3000038 | Microscope for brain dissection |
Syringe 5 mL | BD | 1222C84 | Sterile syringe |
Syringe filter 2 µm | Fisher Scientific | 09-740-105 | Polypropylene filter for sterilization |
Thrombin | Sigma-Aldrich | 9002–04-4 | Thrombin cristalline powder from bovine plasma |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Laboratory grade |
Trypsin-EDTA | Gibco; Life Technologies Corporation | 15400054 | Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS |
Versene solution | Gibco; Life Technologies Corporation | 15040066 | Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS |
Well plate | Thermo Scientific | 144530 | Sterile 24-well plate |