Summary
상세한 단계별 프로토콜은 다성 성 O9-1 신경 문장 세포및 다양한 강성의 폴리 아크릴아미드 하이드로겔을 사용하여 시험관 내 기계적 신호를 연구하기 위해 여기에 설명되어 있습니다.
Abstract
신경 문장 세포 (NCC)는 다양한 장기와 조직을 초래하는 세포 모형의 넓은 배열로 이동하고 분화할 수 있는 척추동물 배아 다능성 세포입니다. 조직 강성은 NCC 분화에서 중요한 역할을 하는 물리적 인 단서인 기계적 힘을 생성합니다. 그러나 메커니즘은 불분명합니다. 여기에 설명된 방법은 다양한 강성의 폴리아크릴아미드 하이드로겔의 최적화된 생성, 이러한 강성의 정확한 측정, 그리고 생체 내 를 모방하는 NCC 라인인 O9-1 셀에서 기계적 신호의 영향 평가를 위한 상세한 정보를 제공한다.
하이드로겔 강성은 원자력 현미경검사(AFM)를 사용하여 측정되었으며 그에 따라 상이한 강성 수준을 나타냈다. 다양한 강성의 하이드로겔에 배양된 O9-1 NcC는 기계적 신호 변화로 인한 다양한 생물학적 효과를 나타내는 스트레스 섬유의 세포 형태와 유전자 발현을 상이하게 나타냈다. 더욱이, 하이드로겔 강성을 변화시켜 젤 강성을 변경하고 NcC의 분자 및 유전적 규제를 분석함으로써 기계적 신호를 조작하는 효율적인 체외 계통이 발생한다는 것을 확립했습니다. O9-1 NcC는 해당 분화 매체의 영향으로 광범위한 세포 유형으로 분화할 수 있으며, 생체 내에서화학 신호를 조작하는 것이 편리하다. 따라서, 이 체외 시스템은 NNC에서 기계 신호의 역할과 화학 신호와의 상호 작용을 연구하는 강력한 도구이며, 이는 연구원이 신경 문장 발달 및 질병의 분자 및 유전 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 도움이됩니다.
Introduction
신경 문장 세포 (NCC)는 다양한 장기및 조직의 개발에 기여하고 마이그레이션하고 기여하는 놀라운 능력을 가진 척추 동물 배아 발생 시 줄기 세포의 그룹입니다. NCC는 감각 뉴런, 연골, 뼈, 멜라닌세포 및 원활한 근육 세포를 포함한 상이한 세포 유형으로 분화할 수 있으며, 축 기원의 위치와 NCC1,2의 국소 환경 지침에 따라 분화할 수있다. 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력으로, 신경 문장(NC) 발달단계에서 난독증을 유발하는 유전적 이상이 수많은 선천성 질환으로 이어질 수있다 2. 예를 들어, NcC의 형성, 이동 및 발달 중 의 혼란은 신경근증증1,3로통칭되는 발달 장애로 이어진다. 이러한 질병은 트리처 콜린스 증후군과 같은 NCC 형성의 실패로 인한 두개골 면결에서 부터 흑색종3,4,5,6에서볼 수 있듯이 NCC 전이성 철새 능력으로 인한 다양한 암의 발달에 이르기까지 다양하다. 지난 수십 년 동안, 연구원은 개발 및 질병에 있는 NcC의 역할 그리고 기계장치에 관하여 현저한 발견을 했습니다, 사실 인정의 대다수는 화학신호에집중되고 있는7,8. 최근에는 NCC 개발9,10에서기계적 신호가 중요하지만 제대로 이해되지 않은 역할을 하도록 지시되었습니다.
NCC의 환경 단서는 다양한 세포 유형으로 NCC 분화의 규제를 포함하여 개발 중에 중요한 역할을합니다. 환경 단서, 예를 들어, 물리적 단서, 기능 적 다양화와 같은 중추적 인 행동 및 세포 반응에 영향을 미칩니다. 메카노트랜스듀션은 세포가 다양한 생물학적 과정을 유지하기 위해 이러한 단서를 감지하고 반응할 수있도록 2. NCC는 세포외 매트릭스(ECM)와 같은 주변 세포 및 상이한 기판에 둘러싸여 있어 항상성을 유지하고 운명 결정, 증식 및 세포멸을 통해 변화에 적응하기 위해 기계적 자극을 야기할 수있다. 메카노트랜스듀션은 기계적 세포외 자극의 감각 성분이 발생하는 플라즈마 멤브레인에서 시작하여세포(12)의세포내 조절을 초래한다. 플라즈마 멤브레인의 통합, 초점 접착 및 접합부는 전단력, 응력 및 주변 기판의 강성과 같은 기계적 신호를 화학 신호로 전달하여 세포반응(12)을생성한다. 플라즈마 멤브레인에서 최종 세포 조절에 이르는 화학 신호의 릴레이는 분화와 같은 유기체에 대한 중요한 프로세스를 마무리하기 위해 상이한 신호 경로를 통해 수행됩니다.
몇몇 연구 결과는 기질 강성에서 기계신호가 세포 분화13,14에있는 역할을 한다는 것을 건의했습니다. 예를 들어, 이전 연구는 뇌 조직의 강성과 연약한 기판에서 자란 중간엽 줄기 세포(MSC)가 뇌 조직(0.1-1.0 kPa 범위)과 유사한 강성을 가진 것으로 나타났으며, 그 결과 뉴런 세포분화(15,16)가발생한것으로 나타났다. 그러나, 더 많은 MSC는 근육의 강성을 모방8-17 kPa 기판에 성장할 때 근구와 같은 세포로 분화하고, MSC가 뻣뻣한 기판 (25-40 kPa)에 배양될 때 골세포와 같은 분화를 관찰하였다15,16. 메카노트랜스덕션의 중요성은 잠재적으로 암, 심혈관 질환 및골다공증17,18,19를포함한 심각한 발달 결함 및 질병으로 이어질 수 있는 기계적 신호 경로의 요철 및 이상에 의해 강조된다. 암에서는 정상적인 유방 조직이 연약하며 유방암의 위험은 뻣뻣하고 조밀한 유방 조직에서 증가하며, 유방 종양에 더 유사한환경(15). 이러한 지식을 바탕으로 NCC 발달에 대한 기계적 신호의 효과는 체외 시스템을 통해 기질 강성의 간단한 조작을 통해 연구될 수 있으며, NC 관련 질병 진행 및 병인학의 기초를 이해하는 데 있어 추가적인 이점과 가능성을 제공한다.
NcC에서 기계 신호의 영향을 연구하기 위해, 우리는 이전에 발표 된 방법의 최적화및 다른 기계적신호20,21에대한 NcC의 응답의 평가를 기반으로 NcC에 대한 효율적인 시험관 시스템을 설립했다. 다양한 하이드로겔 강성 제제 및 NNC에서 의 기계적 신호의 영향에 대한 평가를 위한 상세한 프로토콜이 제공되었습니다. 이를 위해 O9-1 NCC는 NC 모델로 활용되어 경직대 소프트 하이드로겔에 대한 반응으로 효과와 변화를 연구한다. O9-1 NCC는 8.5일째에 마우스 배아(E)로부터 분리된 안정적인 NC 세포주이다. O9-1 NcC는 정의된 분화매체(22)에서다양한 NC 유래 세포 유형으로 분화할 수 있기 때문에 생체 내에서 NcC를 모방한다. NcC의 기계적 신호를 연구하기 위해, 매트릭스 기판은 생물학적기질 강성(20,21,23)과상관관계가 있는 원하는 강성을 달성하기 위해 아크릴아미드및 비스 아크릴아미드 용액의 다양한 농도로부터 튜닝 가능한 탄성으로 제조되었다. NcC, 특히 O9-1 셀에 대한 매트릭스 기판의 조건을 최적화하기 위해 이전에 게시된프로토콜(20)에서수정하였다. 이 프로토콜에서 한 가지 변화는 콜라겐 I에서 하이드로겔을 배양하는 것이었는데, 50m HEPES 대신 0.2% 아세트산으로 희석되어 하룻밤 사이에 37°C에서 이루어졌다. 아세트산의 낮은 pH는 균일한 분포와 더 높은 콜라겐 I 통합으로 이어지므로 ECM단백질(24)의보다 균일한 부착을 가능하게 한다. 또한, 말 혈청과 태아소 혈청(FBS)의 조합은 인큐베이터에 하이드로겔을 저장하기 전에 인산염 완충식염수(PBS)에서 각각 10% 및 5%의 농도에서 사용되었다. 말 혈청은 10%25의농도에서 세포 증식 및 분화를 촉진하는 능력으로 인해 FBS에 대한 추가 보충제로 사용되었다.
이 방법으로, 생물학적 환경은 ECM 단백질 코팅(예를 들어, 콜라겐 I)에 의해 모방되어NcC가 20,21로성장하고 생존할 수 있는 정확한 체외 환경을 조성하였다. 준비된 하이드로겔의 강성은 탄성 계수를 묘사하는 잘 알려진 기술인 원자력 현미경검사(AFM)를통해 정량적으로 분석되었다. NcC에 대한 상이한 강성 수준의 효과를 연구하기 위해 야생형 O9-1 세포는 기판 강성의 변화에 대응하여 세포 접착및 형태학의 차이를 보여주기 위해 면역형 형광(IF)을 위한 하이드로겔에 배양및 제조되었다. 이 체외 시스템을 활용하여 연구자들은 NcC에서 기계 신호의 역할과 다른 화학 신호와의 상호 작용을 연구하여 NcC와 기계 신호 사이의 관계를 더 깊이 이해할 수 있습니다.
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Protocol
1. 하이드로겔 준비
참고: 모든 단계는 멸균을 유지하기 위해 사용하기 전에 에탄올과 자외선(UV)에 소독된 세포 배양 후드에서 수행해야 합니다. 핀셋과 파이펫과 같은 도구는 에탄올로 분사되어야 합니다. 버퍼 솔루션도 멸균 필터링되어야 합니다.
- 아미노살란 코팅 유리 커버립의 준비
- 원하는 수의 유리 커버립을 실험실 닦아 조각에 놓습니다.
참고: 3-4 커버립을 추가로 준비하여 쉽게 파손될 때 충분한 백업 소모품을 보장합니다. 유리 커버의 다른 재료는 세포 시딩과 부착의 다른 호환성을 얻을 것이다. 실험을 시작하기 전에 실험에 가장 적합한 유형을 결정하는 것이 좋습니다(재료 표참조). - 알코올 버너 또는 분젠 버너를 사용하여 불꽃을 앞뒤로 통과하여 각 커버슬립을 살균하십시오(단백질 분석 실험용 30s). 각 유리 커버슬립을 실험실 닦아에 놓아 식힙니다.
- 유리 커버를 식히면 파막이 늘어선 페트리 접시에 옮겨 미끄러짐을 방지합니다.
참고: 커버립이 충분히 식지 않으면 잔류 열이 파라필름을 슬립에 녹여 사용할 수 없게 됩니다. - 커버립은 각각 약 200 μL 및 800 μL및 0.1 M NaOH800 μL로 커버하여 각각 12mm및 25mm 커버슬립으로 5분 동안 앉게 합니다. 그런 다음 0.1 M NaOH를 흡인하고 커버립이 5분 동안 공기 건조하여 균일한 필름을 형성할 수 있도록 합니다.
- 커버립이 건조되면 피펫은 각각 12mm 및 25mm 커버립을 위한 3-아미노프로필 트리에톡시실레인(APTS)의 약 80 μL 및 150 μL(150 μL)입니다. 파라필름에 용액이 유출되지 않도록 주의하십시오. 솔루션이 5분 동안 앉을 수 있도록 허용합니다.
- 가능한 한 많은 초과 APTS를 흡인하고 잔류 APTS가 5 분 동안 건조 할 수 있습니다. 커버를 잘 헹구면 멸균, 디온화(DI) H2O3회5분으로 매번 침수하여 커버스립을 잘 헹구는 다.
참고: 유리 커버립이 잘 헹구지 않으면 잔류 APTS는 글루타랄데히드와 원치 않는 반응을 일으켜 흰색 침전이 형성되어 사용할 수 없는 커버립을 생성합니다. - 커버립을 새로운 페트리 요리로 옮기고 반응하는 면을 향하게 합니다. 페트리 접시에 0.5% 글루타랄데히드를 추가하여 커버립을 완전히 덮고 커버립이 30분 동안 앉을 수 있도록 합니다.
- 0.5% 글루타랄데히드를 흡인하고 3분 동안 DI H2O로 다시 커버립을 헹구세요. 커버립을 실험실 닦기 또는 깨끗한 페트리 접시에 반응성 측면을 설정하여 사용하기 전에 완전히 공기 건조시하십시오.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 커버립은 사용 전까지 멸균 DI H2O에 배치해야 합니다.
- 원하는 수의 유리 커버립을 실험실 닦아 조각에 놓습니다.
- 실리콘 커버립 준비
- 아미노실란 코팅 커버립(1.1.1단계)과 동일한 수의 커버립을 파라필름이 늘어선 페트리 접시에 놓습니다.
- 피펫 40 μL 또는 150 μL 12mm 및 25mm 커버립립은 각각 디클로로메틸릴레인(DCMS)을 커버슬립의 한쪽에 대고 용액이 5분 동안 앉을 수 있도록 합니다.
- 커버슬립에서 남은 용액을 1분 동안 멸균 DI H2O로 1회 세척하고, 반응형 커버립을 실험실 닦아에 올려 놓고 다음 단계로 이동합니다.
- 하이드로겔 준비
- 아크릴아미드, 비스 아크릴아미드 및 DI H2O를 1.5mL 원심분리기 튜브에 혼합하여 다양한 강성으로 500μL의 용액을 준비합니다(표 1참조). 30 s가 완전히 혼합 할 수있는 용액을 소용돌이.
- 신속하게 작업하여 10% 암모늄 감산용액(APS)과 테트라메틸레틸레틸렌디아민(TEMED)을 튜브에 추가하고 솔루션을 다시 혼합하여 용액을 소용돌이시다.
참고: 신선한 10% APS를 준비하고 얼음위에 두거나 민감한 동결/해동 주기로 인해 일회용 알리쿼트로 동결하십시오. - 파이펫약 33 μL 또는 100 μL의 용액은 각각 건조된 12mm 또는 25mm 아미노릴란 코팅 커버립(section 1.1)에 각각 이다.
- 곡선 핀셋을 사용하여 즉시 DCMS 처리 커버슬립을 젤 용액위에 놓고 젤 용액을 만지고 DCMS 처리 커버슬립과 아미노릴로 코팅된 커버슬립 사이에 젤 용액을 끼워 줍니다.
- 겔 용액이 5-15분 동안 중합화되는 동시에 튜브 내의 남은 용액의 겔 중합화를 적극적으로 모니터링할 수 있도록 한다.
- 젤이 중합되면 DCMS 처리 커버슬립을 곡선 핀셋 또는 면도날로 분리하여 원래 아미노시란 코팅 커버슬립에 부착된 젤을 남깁니다.
- 부착된 하이드로겔을 부착된 커버슬립을 500 μL 및 멸균 PBS 또는 DI H2O2M로 각각 12mm 및 25mm 커버립으로 덮인 6웰 플레이트에 부착된 하이드로겔을 부착하여 젤이 건조되는 것을 방지합니다.
- 모든 커버립에 대해 1.3.4-1.3.7 단계를 반복합니다.
- 하이드로겔을 멸균 PBS 또는 DI H2O에 30분 동안 잠수하여 과도한 아크릴아미드 용액을 제거합니다. 하이드로겔을 멸균 PBS 또는 DI H2O에 4°C에 저장하여 여기서 절차적 정지를 한다.
- 어두운 방에서, 설포스니미딜 6-(4'-아지도-2'-니트로페닐라미노) 헥사노아테(sulfo-SANPAH) 혼합물을 50mMM 2-[4]의 2.5mL를 혼합하여 준비합니다.4-(2-하이드록세틸) 파이펫라진-1-yl] 에탄설포닉산(HEPES) (pH=8.5)와 50 μg/mL sulfo-SANPAH의 25μL을 원추형 튜브에서, 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 싸여 있습니다. 파이펫을 사용하여 사용하기 전에 솔루션을 잘 혼합합니다.
참고: 2.5mL의 설포-SANPAH 용액은 약 2512mm 하이드로겔 또는 5 25mm 하이드로겔에 충분합니다. - 웰 플레이트에서 PBS 또는 DI H2O를 흡인합니다. 젤을 커버하기 위해 각각 12mm 및 25mm 커버립에 약 100 μL 또는 500 μL을 추가합니다. 용액이 젤을 완전히 커버하도록 하십시오.
참고: 강한 힘이 하이드로겔을 찢거나 방해하지 않도록 진공 흡입 강도를 조정합니다. - 15W, 365 nm UV 광 아래 용액으로 젤을 10분 동안 놓고, 설포-SANPAH와 반응하는 UV 광의 간섭을 최소화합니다.
- 가능한 한 많은 용액을 수집하기 위해 플레이트를 기울여 과도한 설포-SANPAH를 흡인시합니다. 젤을 50m HEPES로 2~3회 세척합니다.
- 500 μL 및 2 mL을 12mm 및 25mm 젤에 넣고, 50 mg/mL 콜라겐을 각각 0.2% 아세트산으로 희석하여 하이드로겔을 함유하고 있습니다. 젤이 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양하도록 허용합니다.
참고: 콜라겐 I를 50m HEPES 대신 0.2% 아세트산으로 희석시켜 콜라겐 I의 균질분포와 부착을 촉진합니다. - 콜라겐 I를 흡인시키고 살균 PBS로 젤을 세 번 세척하여 세척 할 때마다 5 분 동안 과도한 콜라겐 I를 제거합니다. PBS에서 하이드로겔을 10% 말 세럼으로 배양하고, 37°C에서 2h, 5% CO2 인큐베이터로 5%의 FBS를 배양합니다.
참고: 10%의 말 세럼을 첨가하면 이전 간행물에서와 마찬가지로 FBS만 사용하는 것과 비교하여 더 높은 증식을 촉진합니다. - 매체를 흡인합니다. 멸균 여과DMEM(DMEM)의 500mL에 10% FBS와 1% 페니실린-연쇄절제술(P/S)을 각 웰에 추가합니다. 젤을 세포 배양에 대비할 때까지 37°C, 5% CO2 인큐베이터에 저장합니다.
- 일단 준비되면, 배양 접시에 있는 기저 배지에 약 1.5 × 104 O9-1 세포/cm2를 접시. 37°C, 5% CO2에서인큐베이터에서 2일 동안 세포를 배양한다. 세포가 젤에 충분히 부착되어 있는지 확인하고 분석을 위해 수집하기 전에 세포 수가 충분하도록 결합을 확인하십시오.
참고: O9-1셀(20)의복구, 통로 및 컬렉션 단계에 대해 이전에 게시된 프로토콜을 참조하십시오. - 하이드로겔의 추가 분석을 위해 섹션 2, 3 또는 4로 진행합니다.
2. AFM을 통한 강성의 정량적 분석
- AFM 시스템 컴퓨터를 시작하고 AFM 컨트롤러(재료 표참조)를 시작합니다.
- AFM 프로브 홀더에 AFM 캔틸레버를 장착합니다. 캔틸레버 끝에 장착된 0.5 μm 실리카 비드(구형 비드 캔틸레버)가 장착된 구형 캔틸레버를 사용하십시오.
참고: 10kPa, 20kPa 및 40kPa와 같은 더 단단한 하이드로겔의 경우 스프링 상수 0.24 N/m의 스프링 상수와 함께 더 단단한 프로브를 사용했습니다. 0.5kPa 및 1kPa와 같은 부드러운 하이드로겔에 부드러운 프로브가 사용되었으며 스프링 상수는 0.059 N/m입니다. - 접촉 모드로 AFM 소프트웨어를 설정합니다.
- 실리콘 웨이퍼를 AFM 샘플 스테이지에 장착하여 캔틸레버를 클릭하여 힘 곡선을 수집하여 힘 곡선을 생성하여 힘 곡선을 생성합니다.
- 위의 힘 곡선(2.4)을 사용하여 교정을 위해 제어 소프트웨어의 교정을 클릭하여 열 조정 조건에서 캔틸레버의 평균 스프링 상수를 얻고 제어 소프트웨어에서 보정된 값을 저장합니다.
- 60mm 페트리 접시에 부착된 하이드로겔로 커버슬립을 AFM 스캐닝 스테이지에 배치하여 시료를 장착합니다. 젤이 건조되는 것을 방지하기 위해 측정을 수행하기 전에 PBS 3mL을 접시에 넣습니다.
- AFM을 접촉 모드(유체)에서 작동하도록 설정하여 측정을 시작합니다. 구형 비드를 참여하여 젤 샘플에서 지속적으로 터치하고 들어올립니다.
- 캔틸레버를 설정하여 편향 임계값이 10nm에 유지되도록 합니다. 프로브의 램핑 크기를 10μm로 유지합니다. 그런 다음 2.4 단계에서와 같이 힘 곡선을 기록합니다.
- 하이드로겔 표면을 가로질러 적어도 3~10개의 다른 반점으로부터 최소 20개의 힘 곡선을 획득한다.
- AFM 이미징 및 분석 소프트웨어를 사용하여 각 스팟마다 평균 영의 계수를 ~20개의 힘 곡선을 계산합니다. 확장 램프 힘 곡선과 선형화된 모델(구형)을 사용합니다. 각 샘플의 모든 반점의 평균을 계산하여 최종 강성을 산출합니다.
참고: 영의 계수 및 관련데이터(예: 표준 편차)는 스프레드시트로 자동으로 저장됩니다. - 모든 샘플에 대해 2.6-2.10 단계를 반복합니다.
3. 면역 형광 염색을 통한 강성의 분자 분석
- 핀셋을 사용하여 덮개 슬립을 새 플레이트로 운반하여 플레이트에 직접 자라는 세포의 거짓 신호를 최소화합니다. 멸균 PBS의 500 μL로 세포를 세 번 세척하여 죽은 세포와 남은 배양 배지를 제거하십시오.
- 실온에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드(PFA)의 500 μL을 사용하여 세포를 수정합니다. 그런 다음 PBS/웰500 μL을 사용하여 각각 2분 동안 세포를 세 번 다시 세척합니다.
참고: 4°C에 보관하여 절차상의 정지를 위해 보관하십시오. - 실온에서 15분 동안 500 μL의 0.1% 트리톤 X-100으로 세포를 치료한다. 그런 다음 PBS/웰의 500 μL로 셀을 세 번 씻으시다.
- 실온에서 30분 동안 양당 당나귀 혈청(PBS에서 희석되고 0.1% Tween 20)의 250 μL로 세포를 차단합니다.
- 실온에서 2시간 또는 4°C에서 하룻밤 동안 1차 항체의 250 μL로 세포를 배양한다. 그런 다음, PBS/웰의 500 μL로 세포를 각각 5분 동안 세 번 씻는다.
참고: 안티 빈컬린(Vcl) (1:250) 및 항 AP2 알파(1:250)가 이 실험에서 사용되었고 당나귀 혈청10%로 희석하였다. - 10% 당나귀 혈청의 250 μL에서 1:400의 희석시 F액틴 염색에 사용되는 해당 이차 항체 및/또는 프할로이드딘으로 세포를 실온에서 30분 동안 배양한다. 그런 다음 PBS로 세포를 각각 5 분 동안 세 번 씻으신다.
참고: 568 nm Phalloidin 488 nm 또는 647 nm 이차 항체 또는 자체적으로 공동 배양 될 수 있습니다. - 10분 동안 PBS의 250 μL에서 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:1000 희석)로 세포를 배양하고 2 분 동안 PBS의 마지막 세척을 합니다.
- 각 웰에 3-4 방울의 장착 매체를 추가합니다. 시료를 4°C에 저장하여 이미징 전에 적어도 2시간 동안 설정하여 마운팅 매체가 제대로 설정되었는지 확인합니다.
- 형광 현미경으로 하이드로겔 샘플 당 최소 3 개의 무작위 프레임의 이미지를 캡처하여 개별 및 병합 채널을 생성합니다.
4. 정량적 실시간 PCR (RT-qPCR)
- RNA 수집을 위한 부착 된 세포로 하이드로겔을 새로운 플레이트로 전달하여 세포 판에 부착 된 세포로부터 원치 않는 RNA를 최소화합니다. 죽은 세포와 배양 배지를 제거하기 위해 PBS로 세포를 세 번 세척합니다.
- RNA 추출 키트를 사용하여 총 mRNA를 추출합니다. 제조업체의 지시에 따라 역전사 슈퍼믹스를 사용하여 CDNA에 RNA의 역전사를 수행한다.
- 선택의 강성 마커로 Vcl에 대한 프라이머와 RT-qPCR을 수행하고2-ΔΔCT 방법을 사용하여 분석한다.
참고: Vcl의 프라이머 시퀀스: 포워드 5' GCTTCAGTCAGACCCATACTCG 3'; 리버스 5' AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.
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Representative Results
AFM 및 Hertz 모델을 통한 하이드로겔 제제 및 강성 평가
여기서, 아크릴아미드와 비스 아크릴아미드의 비율을 조절함으로써 다양한 강성의 폴리아크릴아미드 하이드로겔을 생성하기 위한 상세한 프로토콜이 제공된다. 그러나, 폴리아크릴아미드 하이드로겔은 ECM 단백질의 부족으로 인한 세포의 접착을 위한 준비가 되어 있지 않다. 따라서, 설포-SANPAH는, 링커로서 작용하는, 하이드로겔에 동적으로 결합하고 UV 활성화 후 설포-산파H에서 N-하이드록시슈니미드 에스테르를 통해 하이드로겔의 표면에 ECM 단백질의 접착을 허용하기 위해 ECM 단백질의 1차 아민과 반응한다. 콜라겐 타입 I는 O9-1 세포 부착을 효과적으로 촉진하기 위해 선택한 ECM 단백질로 사용되었습니다. 다양한 하이드로겔의 정확한 강성 값을 보장하기 위해 탄성 계수를 묘사하는 잘 알려진 기술인 AFM을 사용하여 강성 평가를 수행했습니다.
유리 커버슬립에 폴리아크릴아미드 하이드로겔을 성공적으로 형성하고 부착한 후, 겔은 균일한 표면과 최소한의 찢어짐으로 커버슬립을 부착했습니다. 강성은 인덴션 기술의 원리에 기초하여 AFM에 의해 측정되었으며, 여기서 강성 인덴터는 들여쓰기깊이(26)에도달하는 데 필요한 힘으로 샘플에 적용되었다. 이 측정을 통해 Young의 탄성 계수는 Hertz모델(26)의 깊이와 힘을 들여쓰기에기초하여 계산되었다. 그러나, AFM에 의한 결과의 큰 변화로 인해,겔용액(26)의고르지 않은 표면과 불완전한 균질성의 최소한의 충격으로 정량적 결과를 얻기 위해 추가적인 통계적 방법이 적용되었다. AFM을 이용하여 정량적 측정을 생성하기 위해, 겔 샘플의 각 위치에서 최소 50개의 힘 및 거리 곡선을 컴파일하여 평균 시료 강성을 위해 취하였다. 고강성 겔에 적용된 힘은 부드러운 겔에 적용된 힘보다 높았으며, 이는 강력한 기판이 포스 대 Z 그래프에서 가파른 경사를 산출했음을 나타내며, 이는 힘이 nN에서 측정되고, Z는 인덴터와 샘플 사이의 들여쓰기 깊이를 나타낸다.
연약한 하이드로겔의 경우, 생성된 힘 곡선의 경사는 AFM 프로브로부터 필요한 힘이 적기 때문에 완만했다(도1A). 그러나, 40kPa의 계수를 가진 것과 같은 뻣뻣한 하이드로겔의 경우, 적용된 힘이 부드러운젤(도 1B)보다높았기 때문에 생성된 경사가 훨씬 가파르게 많았다. 프로브와 하이드로겔 샘플 사이의 분리가 감소함에 따라 프로브 끝이 유리 커버슬립에 닿을 때 곡선이 크게 증가합니다. 그러나 분리 거리가 증가함에 따라 적용된 힘이 없기 때문에 커브는 0에 만 접근합니다.
도 1A에도시된 바와 같이, AFM 프로브의 캔틸레버가 젤에 접근하여 청색선으로 표시하고, 프로브는 겔 시료를 관통하고 결국 유리 커버슬립에 도달하는 데 필요한 적용된 힘을 측정하여 급격한 힘의 증가를 일으켰다. 필요한 솔루션의 품질과 같은 가능한 절차 및 기악 오류로 인해 하이드로겔 샘플의 진정한 강성은 원하는 강성과 크게 다릅니다. 따라서 AFM은 추가 실험에서 거짓 데이터 프리젠 테이션을 방지하면서 방법론을 검증하고 확인하는 데 유용한 도구입니다.
이러한 AFM 평가에서, 5개의 제조된 하이드로겔 샘플은 정량적 접근법을 통해 측정하였다. 이 프로토콜은 다양한 세포 유형의 분화를 위해 보고된 생물학적 기질 강성 수준의 폭을 모방한 0.5kPa, 1kPa, 10kPa, 20kPa 및 40kPa의 하이드로겔 강성 수준에 초점을 맞췄다. AFM 측정에서 얻은 힘 곡선은 AFM 분석 알고리즘소프트웨어(그림 2)를사용하여 킬로파스칼에서 영의 탄성 계수를 생성하는 데 활용되었다.
폴리아크릴아미드 하이드로겔 시스템 및 셀 유형 비교
Tse와 동료에 의한 원래 프로토콜의 이 적응은 O9-1세포(20)를사용하여 NCC의 메카노타민성 측면을 연구하는 효율적이고 효과적인 접근법을 제공한다. 이전 프로토콜에 대한 수정은 ECM 단백질 인큐베이션을 수정하는 것을 포함합니다: 50 mM HEPES를 0.2% 아세트산으로 교체하고 세포 배양을 위한 10% 말 혈청 및 FBS의 추가(단계 1.3.14-1.3.15). 이러한 수정은 이 수정된 젤 시스템에서 O9-1 NcC의 성장 및 유지 관리를 원래(control) 프로토콜과 비교하여 검증되었습니다. 여기서, 우리는 기저 배지에서 각 시스템에 대해 1 kPa 및 40 kPa의 탄성 계수를 가진 두 하이드로겔 시스템에 야생 형 O9-1 세포를 배양했습니다. 전반적인 세포 성장 상태 및 개발은 수산화겔에 대한 세포 부착, 스트레스 형태 및 세포 부착을 위해 밝은 필드 광 현미경을 사용하여 시각화되었다. O9-1 세포는 원래 겔 계통에서 성장하여 1kPa 및 40 kPa 하이드로겔 모두에 대해 둥근세포(도 3E,F)를초과하여 표시된 죽은 세포의 수가 증가하였다.
대조적으로, 변형된 겔 계에서 자란 O9-1 세포는 하이드로겔 기판에 건강한 세포 성장과 충분한 부착을나타냈다(도 3G,H). 또한, 수정된 하이드로겔 시스템과의 NcC의 호환성은 NCC 마커, Tcfap2α(AP-2)의 IF 염색을 수행함으로써 평가되었다. AP-2는 마우스 배아의 발달을 조절하기 위해 NC 혈통에서 발현된 전사 인자이므로호환성(27)을평가하기에 적합하다. O9-1 세포가 제어 및 변형 된 하이드로겔 시스템에서 모두 AP-2를 발현했지만, 변형 된 하이드로겔 시스템에 도금된 O9-1 세포에서 AP-2 발현이 크게 증가했으며, 이는 더 강한 형광 신호 및 해당 정량화(도 4A,B)에의해 표시되었다.
또한, P19 세포는 세포의 성장을 위해 변형된 하이드로겔 시스템의 이점을 더욱 검증하기 위해 사용되었다. P19는마우스(28)에서배아 유래 성각종으로부터 유래된 배아 암종 세포주이다. P19 세포는 해당 배양 프로토콜을 사용하여 생존 및 성장 특성을 모니터링하기 위해 제어 및 변형 된 하이드로겔 시스템에서 모두 성장하였다. 브라이트필드 이미징은 두 하이드로겔 시스템에 도금된 P19 세포가 둥근 부동 세포의 과잉 및 세포 기판 부착물(도3A-D)의부족을 나타냈다는 것을 밝혔다. 이 관찰은 수정된 프로토콜이 O9-1 NcC가 NNC에서 기계적 신호를 연구하는 데 더 적합하다는 것을 시사했습니다.
딱딱한 기판에 고응 섬유 발현의 시각화
수정된 하이드로겔은 상이한 강성 수준 및 기타 이펙터의 젤에 배양된 세포의 형태에 대한 차이에 대한 정량적 및 질적 분석을 허용하였다. 하이드로겔이 세포 파종에 대비되면 야생형 O9-1 세포가 서로 다른 강성 수준의 하이드로겔로 파종되었다. 세포는 그들의 모양, 공간 퍼짐, 최소한의 죽은 세포로 하이드로겔에 부착조차 관찰하여 그들의 건강 및 성장을 위해 감시되었습니다. 일부 연구는 높은 강성 기판에 MSC에 대한 스트레스 섬유와 세포 접착의 증가를 보여 주었다, 더 단단한 기판에서 성장 NCC는 또한 부드러운 기판에서 성장 NCC에 비해 유사한 결과를 나타낼 것이라는 점을 시사29,30.
미오신 II, α 액티닌 및 기타 사이토스켈레탈 단백질과 함께 F-actin은 스트레스섬유(31)로통칭된다. 이전 연구는 증가 된 기계적 힘에 대한 응답으로 응력 섬유 조립의 증가를 관찰(31). 응력 섬유의 한쪽 또는 양쪽 끝에서 초점 접착 복합체에 부착하면 세포가 ECM31을마이그레이션하고 부착할 수 있습니다. CNC에서 F-액틴 발현 및 조직을 시각화하는 Phalloidin 염색은 기계적 신호에 대한 응답으로 건강한 세포 성장을 입증하였다(그림5). 또한, 저강성 또는 고강성 하이드로겔에서 자란 O9-1 세포는 다양한 양의 응력섬유(그림 5)를통해 상이한 형태를 나타냈다. MSC를 사용하여 수행된 보고된 연구에서 관찰된 바와 유사하게, O9-1 세포가 단단한 기판에서 자라는 것을 관찰하였고, 40kPa는 더 많은 응력 섬유를 나타내고 부드러운 하이드로겔에서 자란 세포에 비해 잘 퍼지는 것으로 관찰되었으며, 1kPa강성(29,30)으로나타났다.
세포 접착 평가
기판 강성의 변화가 NCC 접착력에 영향을 미친다는 가설을 더욱 확인하기 위해 Vcl 발현의 변화는 다른 하이드로겔 강성 수준에 반응하는 NCC의 RT-qPCR을 통해 정량적으로 측정되었다. Vcl은 기판과의 접촉을 확립하고 ECM특성(32)을감지하는 세포의 과정에서 초점 접착 복합체에 존재하는 수많은 사이토셀레탈 단백질 중 하나입니다. 초점 접착은 세포근육 작용 세포골격에 고정되는 인테그린 수용체를 통해 ECM에 대한 세포의 접점이며, F-actin33 Vcl 유전자 발현 수준은 기판 경직에 반응하여 O9-1 세포의 초점 접착 및 세포 접착의 변화를 시사한다.
이전 연구는 그것의 표현에 있는 다름에 의하여 배아 줄기 및 섬유아세포 세포에 있는 세포 접착에 Vcl의 효력을 보여주었습니다. Vcl의높은 발현에 대응하여 초점 접착의 수와 크기도 증가했지만 Vcl이 34를쓰러뜨렸을 때 감소했습니다. 일관되게, Vcl-결핍세포는 또한 세포 접착및 확산35에있는 유의한 감소를 보여주었습니다. 또한, Vcl은 초점접착(36)을안정화하여 세포 접착을 조절하는 역할을 한다. 초점 접착력, 성숙 수준 및 조성물의 크기는 기판 강성에 따라 다르므로 신호가 세포내로 변환되고 세포가 환경단서(37)에반응할 수 있게 한다. 따라서, Vcl은 RT-qPCR(도6C)에의해 검출된 더 높은 mRNA 수준에 의해 반영됨에 따라 경직기판상에서 자란 세포의 초점 접착 복합체에 고도로채용된다.
부드러운 기판에서 자란 세포는세포(15)에서 Vcl의 낮은 mRNA 수준에 의해 반사되는 최소한의 초점 접착 복합체를 형성한다. 도 6C에서,O9-1 세포는 연약한 기판보다 뻣뻣한 기판상에 Vcl의 더 높은 발현을 나타냈다. 이러한 결과는 부드러운 기판에 O9-1 세포보다 뻣뻣한 기판에 O9-1 세포의 세포 기판 접착의 높은 수준을 제안한다. 또한, Vcl 발현은 RT-qPCR 발견을 더욱 보완하고 지원하기 위해 안티Vcl 항체로 IF 염색을 통해 질적으로 시각화되었다. 일관되게, 경직기질상에서 자란 O9-1 세포의 Vcl 발현은 더 부드러운 기판(도6A,B)에서자란 세포보다 높았으며, 이는 F-actin phalloidin 염색 및 Vcl-q-q
그림 1: AFM 프로브의 들여쓰기에서 생성된 힘 곡선입니다. 힘(y축)은 nN에 적용된 필요한 힘을 나타내고 Z(x축)는 μm 의 샘플로부터 브루커 AFM 프로브 거리를 나타냅니다. 1 kPa 하이드로겔(A)의 경우, 생성된 경사는 40kPa 하이드로겔(B)에 대해 관찰된 가파른 경사대 완만하다. 컬러 곡선은 하이드로겔 샘플에서 (파란색) 및 후퇴(빨간색)에 접근할 때 AFM 프로브의 캔틸레버의 움직임을 나타냅니다. 곡선의 가장 높은 시작점은 유리 커버슬립의 단단한 접촉을 나타냅니다. (B)40kPa 하이드로겔에서 후퇴곡선의 큰 딥은 비드와 시료 사이의 접착력을 나타낸다. 약어 : AFM = 원자력 현미경 검사법. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 영의 탄성 계수에서 계산 된 하이드로 겔 (kPa)의 평균 강성. 영의 계수는 도 1의힘 곡선에서 생성되었다. 하이드로겔의 레퍼런스 탄성 모툴리는 0.5kPa, 1kPa, 10kPa, 20kPa 및 40 kPa이었다. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: P19 및 O9-1 세포의 밝은 필드 이미지는 세포 성장 특성을 검출하기 위해 제어 및 변형 된 젤 시스템의 1 kPa 및 40 kPa 하이드로 겔에 도금됩니다. 죽은 세포는 적색 화살표로 표시됩니다. 스케일 바 = 25 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
도 4: NCC 마커 AP-2의 면역불광 염색은 NCC 호환성을 시각화하기 위해 O9-1 NcC에서 AP-2를 시각화합니다. (A)40 kPa 변형 하이드로겔 시스템은(B)40 kPa 제어에 비해. AP-2 (녹색); 핵은 DAPI(파란색)로 염색하였다. 스케일 바 = 25 μm.(C)막대 그래프는 유의성(p-값 = 0.003) (n=3)를 나타내는 AP-2 식 레벨의 정량화를 제공한다. 데이터는 제공된 표준 편차 오류 막대가 있는 상대식을 표시합니다. 약어: NCC = 신경 문장 세포; DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 40 kPa 하이드로겔에 O9-1 세포에서 잘 퍼지는 응력 섬유를 보여주는 F-액틴의 형광 프할로이드진 염색. O9-1 세포는1kPa(A)및 40kPa 하이드로겔(B)에서 배양되었다. O9-1 세포는 알렉사 플루어 488 Phalloidin (녹색)를 사용하여 염색되었고, 핵은 DAPI (파란색)로 염색되었다. 스케일 바 = 25 μm. 약어: DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: O9-1 세포에서 빈쿨린의 면역 형광 이미지. O9-1 세포는1kPa(A)및 40kPa(B) 하이드로겔에 도금하였다. 핵은 DAPI (파란색)로 염색되었다. 스케일 바 = 25 μm.(C)1 kPa 및 40 kPa 하이드로겔에 배양된 O9-1 세포에서 Vcl의 총 mRNA 수준의 실시간 정량적 PCR 분석. 1kPa 하이드로겔의 Vcl 발현 수준은 40kPa 하이드로겔(p-값 = 0.02)보다 현저히 낮다. 데이터는 제공된 표준 편차 오류 막대가 있는 평균을 표시합니다. 약어: DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 500 μL 총 부피 | 0.5 kPa | 1 kPa | 10 kPa | 20 kPa | 40 kPa | ||
| 아크릴아미드 40% (μL) | 37.5 | 62.5 | 125 | 100 | 100 | ||
| 20% 비스 아크릴아미드 (μL) | 15 | 7.5 | 25 | 66 | 120 | ||
| H2O (μL) | 447.5 | 430 | 350 | 334 | 280 | ||
| 10% APS (μL) | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | ||
| TEMED (μL) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | ||
표 1: 원하는 강성 수준을 얻기 위한 해당 솔루션 볼륨입니다.
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Discussion
현재 연구의 목표는 NNC에서 기계적 신호의 영향을 더 잘 이해하기 위해 효과적이고 효율적인 체외 시스템을 제공하는 것입니다. 위에서 언급한 단계별 프로토콜을 따르는 것 외에도, 연구자들은 O9-1 NcC의 세포 배양이 하이드로겔을 준비하는 데 사용되는 유리 커버립의 유형에 의해 영향을 받는다는 것을 명심해야 합니다. 예를 들어, 특정 유형의 유리 커버슬립(재료 표 참조)에 시드된 세포가 생존하고 잘 확산되는 반면, 다른 유형의유리 커버립에 시드된 배양 세포가 더 많은 세포 사명을 보였다는 점에 주목했습니다. 더욱이, O9-1 NCC38에대한 정확한 세포 배양 조건을 엄격히 따르는 것이 중요하다. 하이드로겔을 가능한 한 빨리 사용하거나 멸균 37°C 인큐베이터에 최대 2일 동안 저장될 때 세포 배양의 품질이 최적입니다.
프로토콜의 각 구성 요소의 감도로 인해 탄성 모둘리는 실험마다 다를 수 있습니다. 10% APS에 관한 프로토콜(1.3.2단계)에 언급된 점 외에도, 염두에 두어야 할 다른 중요한 요소도 변화에 영향을 미칩니다. AFM 측정에서 큰 변화를 일으키는 것으로 의심되는 또 다른 요인은 하이드로겔의 두께였습니다. 이전 연구는 영의 moduli에 두께의 효과를 조사했다, 에 이르기까지 15 받는 다 1000 μm, 두께의 차이는 크게 영의 moduli를 변경하지 않은 것으로 나타났습니다39. 그러나, 기판의 두께는 또한 세포가 감지할 수 있는 기계적 특성에 영향을 미치며, 상이한형태학(40,41,42)으로이어진다. 다양한 연구에 따르면 하이드로겔의 두께가 크게 증가하여 세포 영역의 감소, 확산 및하이드로겔40,41,42의효과적인 강성의 감소로 이어졌다. 그러나, 세포의 표현형은 또한 상당히 얇은 하이드로겔에 대한 반응으로 변화하며, 예를 들어, 저강성하이드로겔(40,41,42)에서도더 높은 확산을 한다. 폴리 아크릴아미드 젤의 일관된 볼륨으로, 약간의 편차가 AFM 측정에서 탄성 계측에 크게 영향을 미치지 않도록 하이드로겔의 두께가 균일해야합니다.
다른 살균 방법이 더 복잡하고 유리 커버립에 잠재적 인 손상을 일으킬 수 있기 때문에 알코올 버너를 사용하여 불꽃에 앞뒤로 전달하여 커버립을 살균하는 것이 좋습니다. 유리 커버의 다른 크기는 실험 요구 사항에 따라 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 면역 히스토케와 RT-qPCR을 위해 각각 12mm 및 25mm 커버립을 활용했습니다. 실험에 맞게 적절한 크기의 젤을 사용하면 효율성을 높이고 폐기물을 최소화합니다. 이러한 수정은 원래(control) 하이드로겔시스템(20)에비해 O9-1 NcC에 대한 최적화를 보장하기 위해 질적으로 정량적으로 검증되었다. O9-1 NcC의 전반적인 건강 및 성장은 세포 및 기판 부착 특성에 대한 밝은 필드 현미경으로 평가되었다.
또한, O9-1 세포의 호환성은 IF 염색을 사용하여 AP-2 식을 질적으로 시각화함으로써 이 프로토콜의 수정을 더욱 검증하기 위해 제어 및 수정된 하이드로겔 시스템 간의 비교되었다. 신호의 강도는 제어 대 변형된 하이드로겔 시스템 간의 O9-1 세포에서 AP-2 발현의 대표적인 이미지를 더욱 지원하기 위해 정량화되었다. AP-2는 일반적인 NCC 마커이지만, 다른 잘 알려진 마커는 흉부 및 생존28의NCC 유지 보수에 대한 중요성때문에 Sox10 및 Pax3와 같은 유효성 검사를 위해 고려해야합니다. 또한, 이러한 프로토콜의 최적화는 O9-1 NC 셀을 다른 세포주인 P19와 비교하여 이 하이드로겔 시스템이 NC 세포에 효율적이고 신뢰할 수 있는지 확인하였다. P19 세포는 불멸의 특성을 가지고 쉽게 배양되지만, 하이드로겔 시스템 중 하나에서 잘 번창하지 못했습니다.
세포가 부착되는 기판 또는 조직 강성으로부터 생성된 장시간 력에 대한 저항성은 영의 탄성계수(45)로종종 발현된다. AFM을 사용하면 영의 탄성 계수는 적용된수직력(26)으로부터생성된 힘 곡선으로부터 얻어진다. AFM 측정 중에 측정 중에 큰 변화가 발생할 수 있으며, 이는 더 단단한 하이드로겔에 대한 부정확한 판독값으로 이어질 수 있습니다. 불일치는 측정에 사용되는 부적절한 프로브로 인해 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 20kPa 및 40kPa 하이드로겔의 측정은 스프링 상수(k = 0.24 N/m)가 높은 단단한 프로브를 사용해야 합니다. 단단한 프로브는 부드러운 프로브에 비해 더 낮은 해상도를 허용합니다. 그러나 너무 부드러운 캔틸레버가샘플(46)을고수할 수 있기 때문에 딱딱한 프로브의 선택을 선호하는 이유가 있다. 또한, 너무 부드러운 프로브는 매우 민감하여 원치 않는 입자의 잘못된 신호에 기여하며, 실제강성(46)보다인위적으로 낮거나 높은 강성 값을 초래한다. 또한 측정 재료에 따라 푸아송 비율에 대한 정확한 입력을 주목해야 합니다. 이것은 데이터 출력에 현저하게 영향을 미치기 때문에 표준화된 연구에서 찾아볼 수 있었습니다.
또한, AFM은 하이드로겔의 두께를 측정하는 데 활용되었으며, 두께는 세포가 환경을 감지하는 방식에 영향을 미치는 또 다른 기계적 특성이기 때문에47,42. 다양한 보고된 연구에서, 소프트 하이드로겔에서 재배되는 세포는세포 형47,42,48에따라 ~2-5 μm에서 보고되는 "임계 두께"를 넘어 둥근 모양으로 관찰된다. 그러나, 세포가 동일한 강성의 하이드로겔상에 도금되었을 때 훨씬 더 높은 확산이 관찰되었지만"임계 두께"보다 두께가 낮았다42,48. 이 흥미로운 발견에 대한 잠재적 인 설명은 하이드로겔의 하위 임계 두께는 세포가 측면 변위(47)에대한 견인력을 발휘함에 따라 세포가 단단한 기본 유리 커버립을 감지 할 수 있다는 것입니다. 모든 강성 하이드로겔의 평균 두께는 342 μm이었고 표준 편차는 27 μm입니다. 하이드로겔의 두께는 제안된 "임계 두께"보다 높았으며, 400 μm 미만의 시험 범위 내에서, 이는 연구 및 제조된 미리 만들어진 하이드로겔에서 보고되었으며, 이러한 세포는 하이드로겔의 상이한 강성을 감지할 수 있고 기본 강성 유리커버(42,48)가아니다.
AFM 정량 분석 방법 외에도, 하이드로겔은 또한 면역조직화학을 통해 질적으로 분석하여 O9-1 세포에서 다양한 강성에 의해 영향을 받는 마커의 발현을 연구하고 세포의 건강한 성장을 시각화하였다. 세포질에서의 F-액틴은 탈림 및 Vcl과 같은 시토스켈레탈 단백질 세트를 통해 멤브레인 결합 된 통합에 연결되어 초점 접착 복합체(33)를형성한다. 세포내 응력 섬유의 발현은 또한 초점 접착 염색 키트를 사용하여 함께 시각화될 수 있는 탈신 및 인테그린과 같은 세포내 다른 사이토셀레탈 유전자의 발현을 측정함으로써 분석될 수 있었다.
기계적 신호 전달을 통해 세포 접착 및 응력 섬유의 변화에서 볼 수 있듯이 NCC 형태및 반응에 영향을 미치는 다양한 정도의 하이드로겔 강성이 있었습니다. 이 프로토콜은 체외내의해당 배양 조건을 수정하여 다양한 세포 유형으로 세포 분화에 영향을 미치는 기능을 제공하므로 NNC에서 기계적 신호 및 화학 신호의 조작을 편리하게 하는 방법을 제공한다. 앞서 언급했듯이 NCC 분화의 운명은 주로 주변 조직에 존재하는 기계적 힘에 의해 유도되며, 그 강성2,3. 이 논문의 즉각적인 목표는 NCC 문화를 위한 하이드로겔을 준비하기 위한 단계별 프로토콜을 개발하는 것이었지만, 이 프로토콜의 잠재적 이점은 방법론을 넘어 NcC의 기계적 신호에 대한 추가 지식을 추구합니다. 그것은 또한이 체외 시스템에 몇 가지 제한이 있다는 것을 주목할 필요가있다. 하이드로겔을 제작하는 이 기술은 이질성, 고르지 않은 표면 및 부정확한 강성을 포함하여 잠재적으로 기술적 변화를 유발할 수 있는 여러 단계로 구성됩니다. 따라서 사용자는 실험 중에 기술적 변화를 최소화하기 위해 이러한 단계를 신중하게 수행해야 합니다. 또한, 본 시스템에서 폴리아크릴아미드 젤은 아크릴아미드의 독성으로 인한 2D 배양에 대한 연구를 제한하고, NcC가50에거주하는 정확한 3D 생물학적 환경을 무시하고 있다.
이러한 제약에도 불구하고, 이 체외 시스템은 모든 수준의 연구에 혜택을 주며 연구원이 충분하고 기능적인 다운스트림 테스트를 수행할 수 있도록 저렴하고 간단한 방법을 허용합니다. 최근 연구 결과에서 볼 수 있듯이, NCC는 전단력 및 기질 강성, 그리고 척추동물내 심장 발달뿐만 아니라척추동물내 심장 발달뿐만 아니라 Wnt 및 섬유아세포 성장 인자 신호와 같은 화학 신호와 같은 기계적 신호에 크게의존한다. 이 프로토콜을 사용하여 체외 실험을 위한 로컬 마이크로환경은 분화, 마이그레이션, 세포 반응 및 해로운 질병 진행 가능성을 포함한 NcC에 대한 향후 연구를 위해 쉽게 모방될 수 있습니다. 따라서, 이 체외 시스템은 NCC에서 기계적 신호의 역할과 NCC 발달 및 관련 질병의 분자 및 유전 메커니즘의 이해를 심화할 다른 신호 경로와의 상호 작용을 연구하는 강력한 도구가 될 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 이 프로젝트에서 AFM에 기여한 전문 지식을 위해 텍사스 대학 건강 과학 센터의 원자력 현미경-UT 코어 시설의 운영자인 아나 마리아 자스케 박사에게 감사드립니다. 우리는 또한 건강의 국가 학회 (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704, 및 R01HL142704에서 J. Wang)의 자금 출처에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-012 | |
| 2% Bis-Acrylamide | Sigma Aldrich | M1533 | |
| 24-well plate | Greiner Bio-one | 662165 | |
| 25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-025 | |
| 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) | Sigma Aldrich | A3648 | |
| 4-well cell culture plate | Thermo Scientific | 179830 | |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | J61899-AP | |
| 40% Acrylamide | Sigma Aldrich | A4058 | |
| 50% glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G7651 | |
| 6-well cell culture plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| AFM cantilever (spherical bead) | Novascan | ||
| AFM software | Catalyst NanoScope | Model: 8.15 SR3R1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher | A12379 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 248614 | Powder |
| anti-AP-2α Antibody | Santa Cruz | sc-12726 | |
| anti-Vinculin antibody | Abcam | ab129002 | |
| Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst | Bruker Corporation | ||
| Collagen type I (100mg) | Corning | 354236 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dichloromethylsilane (DCMS) | Sigma Aldrich | 440272 | |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fluorescence microscope | Leica | Model DMi8 | |
| Fluoromount-G mounting medium | SouthernBiotech | 0100-35 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Powder |
| Horse serum | Corning | 35-030-CI | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad | 1708841 | |
| Penicillin-Streptomycin antibiotic | Thermo Fisher | 15140148 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| Sterile 1x PBS | Hyclone | SH30256.02 | |
| Sterile deionized water | Hardy Diagnostics | U284 | |
| sulfo-SANPAH | Thermo Fisher | 22589 | |
| SYBR green | Applied Biosystems | 4472908 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |
References
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