Een geoptimaliseerd O9-1/Hydrogel-systeem voor het bestuderen van mechanische signalen in neurale crest-cellen
Summary
Gedetailleerde stapsgewijze protocollen worden hier beschreven voor het bestuderen van mechanische signalen in vitro met behulp van multipotente O9-1 neurale crest cellen en polyacrylamide hydrogels van verschillende stijfheid.
Abstract
Neurale crest-cellen (NCC’s) zijn embryonale multipotente cellen van gewervelde dieren die kunnen migreren en differentiëren in een breed scala aan celtypen die aanleiding geven tot verschillende organen en weefsels. Weefselstijfheid produceert mechanische kracht, een fysieke aanwijzing die een cruciale rol speelt bij NCC-differentiatie; het mechanisme blijft echter onduidelijk. De hier beschreven methode biedt gedetailleerde informatie voor de geoptimaliseerde generatie van polyacrylamidehydrogels met verschillende stijfheid, de nauwkeurige meting van dergelijke stijfheid en de evaluatie van de impact van mechanische signalen in O9-1-cellen, een NCC-lijn die in vivo NCC’s nabootst.
Hydrogelstijfheid werd gemeten met behulp van atoomkrachtmicroscopie (AFM) en gaf dienovereenkomstig verschillende stijfheidsniveaus aan. O9-1 NCC’s gekweekt op hydrogels met verschillende stijfheid vertoonden verschillende celmorfologie en genexpressie van stressvezels, wat duidde op verschillende biologische effecten veroorzaakt door mechanische signaalveranderingen. Bovendien werd vastgesteld dat het variëren van de hydrogelstijfheid resulteerde in een efficiënt in vitro systeem om mechanische signalering te manipuleren door de gelstijfheid te veranderen en de moleculaire en genetische regulatie in NCC’s te analyseren. O9-1 NCC’s kunnen differentiëren in een breed scala aan celtypen onder invloed van de overeenkomstige differentiatiemedia, en het is handig om chemische signalen in vitrote manipuleren . Daarom is dit in vitro systeem een krachtig hulpmiddel om de rol van mechanische signalering in NCC’s en de interactie met chemische signalen te bestuderen, wat onderzoekers zal helpen de moleculaire en genetische mechanismen van de ontwikkeling en ziekten van de neurale top beter te begrijpen.
Introduction
Neurale crest-cellen (NCC’s) zijn een groep stamcellen tijdens gewervelde embryogenese met een opmerkelijk vermogen om te migreren en bij te dragen aan de ontwikkeling van verschillende organen en weefsels. NCC’s kunnen differentiëren in verschillende celtypen, waaronder sensorische neuronen, kraakbeen, bot, melanocyten en gladde spiercellen, afhankelijk van de locatie van axiale oorsprong en de lokale omgevingsrichtlijnen van de NCC1,2. Met het vermogen om te differentiëren in een breed scala aan celtypen, kunnen genetische afwijkingen die ontregeling veroorzaken in elk stadium van de ontwikkeling van de neurale top (NC) leiden tot tal van aangeboren ziekten2. Verstoringen tijdens de vorming, migratie en ontwikkeling van NCC’s leiden bijvoorbeeld tot ontwikkelingsstoornissen die gezamenlijk bekend staan als neurocristopathieën1,3. Deze ziekten variëren van craniofaciale defecten als gevolg van falen in NCC-vorming, zoals het Treacher Collins-syndroom, tot de ontwikkeling van verschillende kankers als gevolg van NCC-gemetastaseerd migratievermogen, zoals te zien bij melanoom3,4,5,6. In de afgelopen decennia hebben onderzoekers opmerkelijke ontdekkingen gedaan over de rollen en mechanismen van NCC’s in ontwikkeling en ziekten, waarbij de meeste bevindingen gericht zijn op chemische signalen7,8. Meer recent is aangegeven dat mechanische signalen een kritische maar slecht begrepen rol spelen in de ontwikkeling van NCC9,10.
De omgevingsfactoren van NCC’s spelen een cruciale rol tijdens hun ontwikkeling, inclusief de regulering van NCC-differentiatie in verschillende celtypen. Omgevingssignalen, bijvoorbeeld fysieke signalen, beïnvloeden cruciaal gedrag en cellulaire reacties, zoals functionele diversificatie. Mechanotransductie stelt cellen in staat om die signalen te detecteren en erop te reageren om verschillende biologische processen in stand te houden2. NCC’s zijn omgeven door naburige cellen en verschillende substraten, zoals de extracellulaire matrix (ECM), die aanleiding kan geven tot mechanische stimuli om de homeostase te behouden en zich aan te passen aan de veranderingen door lotbepaling, proliferatie en apoptose11. Mechanotransductie begint bij het plasmamembraan waar de sensorische component van mechanische extracellulaire stimuli optreedt, wat resulteert in de intracellulaire regulatie van de cel12. Integrinen, focale verklevingen en juncties van het plasmamembraan geven mechanische signalen, zoals schuifkrachten, spanning en de stijfheid van omliggende substraten, in chemische signalen om cellulaire reacties te produceren12. Het doorgeven van chemische signalen van het plasmamembraan naar de uiteindelijke cellulaire regulatie wordt uitgevoerd via verschillende signaalroutes om vitale processen voor het organisme, zoals differentiatie, af te ronden.
Verschillende studies hebben gesuggereerd dat mechanische signalering van substraatstijfheid een rol speelt bij celdifferentiatie13,14. Eerdere studies hebben bijvoorbeeld aangetoond dat mesenchymale stamcellen (MSC’s) gekweekt op zachte substraten met een stijfheid vergelijkbaar met die van hersenweefsel (in het bereik van 0,1-1,0 kPa) resulteerden in neuronale celdifferentiatie15,16. Meer MSC’s differentiëren echter in myocytachtige cellen wanneer ze worden gekweekt op 8-17 kPa-substraten die de stijfheid van spieren nabootsen, terwijl osteoblastachtige differentiatie werd waargenomen wanneer MSC’s werden gekweekt op stijve substraten (25-40 kPa)15,16. Het belang van mechanotransductie wordt benadrukt door de onregelmatigheden en afwijkingen in de mechanische signaleringsroute die mogelijk leiden tot ernstige ontwikkelingsstoornissen en ziekten, waaronder kanker, hart- en vaatziekten en osteoporose17,18,19. Bij kankers is normaal borstweefsel zacht en neemt het risico op borstkanker toe in stijf en dicht borstweefsel, een omgeving die meer lijkt op borsttumoren15. Met deze kennis kunnen de effecten van mechanische signalering op de ontwikkeling van NCC worden bestudeerd door eenvoudige manipulatie van substraatstijfheid door middel van een in vitro systeem, wat verdere voordelen en mogelijkheden biedt bij het begrijpen van de fundamenten van NC-gerelateerde ziekteprogressie en etiologie.
Om de impact van mechanische signalen in NCC’s te bestuderen, hebben we een efficiënt in vitro systeem voor NCC’s opgezet op basis van de optimalisatie van eerder gepubliceerde methoden en evaluatie van de reacties van NCC’s op verschillende mechanischesignalen 20,21. Er werd een gedetailleerd protocol verstrekt voor de voorbereiding van de variërende hydrogelstijfheid en evaluatie van de impact van mechanische signalering in NCC’s. Om dit te bereiken, worden O9-1 NCC’s gebruikt als het NC-model om de effecten en veranderingen in reactie op stijve versus zachte hydrogels te bestuderen. O9-1 NCC’s zijn een stabiele NC-cellijn geïsoleerd uit muizenembryo (E) op dag 8,5. O9-1 NCC’s bootsen NCC’s in vivo na omdat ze kunnen differentiëren in verschillende NC-afgeleide celtypen in gedefinieerde differentiatiemedia22. Om de mechanische signalering van NCC’s te bestuderen, werd een matrixsubstraat vervaardigd met instelbare elasticiteit van verschillende concentraties acrylamide en bis-acrylamide-oplossingen om de gewenste stijfheid te bereiken, correlerend met de biologische substraatstijfheid20,21,23. Om de omstandigheden van matrixsubstraat voor NCC’s, met name O9-1-cellen, te optimaliseren, werden wijzigingen aangebracht in het eerder gepubliceerde protocol20. Een verandering in dit protocol was het incuberen van hydrogels in collageen I, verdund in 0,2% azijnzuur in plaats van 50 mM HEPES, bij 37 °C gedurende de nacht. De lage pH van azijnzuur leidt tot een homogene verdeling en een hogere collageen I-opname, waardoor een meer uniforme aanhechting van het ECM-eiwit mogelijk is24. Daarnaast werd een combinatie van paardenserum en foetaal runderserum (FBS) gebruikt in concentraties van respectievelijk 10% en 5% in fosfaatbufferzoutoplossing (PBS), voordat de hydrogels in de couveuse werden bewaard. Paardenserum werd gebruikt als een extra aanvulling op FBS vanwege het vermogen om celproliferatie en differentiatie te bevorderen bij een concentratie van 10%25.
Met deze methode werd een biologische omgeving nagebootst door de ECM-eiwitcoating (bijv. Collageen I) om een nauwkeurige in vitro omgeving te creëren voor NCC’s om te groeien en te overleven20,21. De stijfheid van de bereide hydrogels werd kwantitatief geanalyseerd via atomic force microscopy (AFM), een bekende techniek om de elastische modulus weer te geven26. Om het effect van verschillende stijfheidsniveaus op NCC’s te bestuderen, werden wild-type O9-1-cellen gekweekt en bereid op hydrogels voor immunofluorescentie (IF) kleuring tegen filamenteuze actine (F-actine) om de verschillen in celadhesie en morfologieën aan te tonen als reactie op veranderingen in substraatstijfheid. Met behulp van dit in vitro systeem zullen onderzoekers in staat zijn om de rol van mechanische signalering in NCC’s en de interactie met andere chemische signalen te bestuderen om een dieper inzicht te krijgen in de relatie tussen NCC’s en mechanische signalering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het doel van de huidige studie is om een effectief en efficiënt in vitro systeem te bieden om de impact van mechanische signalen in NCC’s beter te begrijpen. Naast het volgen van het hierboven genoemde stapsgewijze protocol, moeten onderzoekers in gedachten houden dat de celcultuur van O9-1 NCC’s wordt beïnvloed door het type glazen afdekkingsplaten dat wordt gebruikt om hydrogels te bereiden. Er werd bijvoorbeeld opgemerkt dat cellen gezaaid op een specifiek type glazen afdekplaat (zie de tabel met ma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Dr. Ana-Maria Zaske, exploitant van Atomic Force Microscope-UT Core-faciliteit aan het University of Texas Health Sciences Center, voor de bijgedragen expertise in AFM in dit project. We danken ook de financieringsbronnen van de National Institutes of Health (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 en R01HL142704 aan J. Wang).
Materials
| 12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-012 | |
| 2% Bis-Acrylamide | Sigma Aldrich | M1533 | |
| 24-well plate | Greiner Bio-one | 662165 | |
| 25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-025 | |
| 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) | Sigma Aldrich | A3648 | |
| 4-well cell culture plate | Thermo Scientific | 179830 | |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | J61899-AP | |
| 40% Acrylamide | Sigma Aldrich | A4058 | |
| 50% glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G7651 | |
| 6-well cell culture plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| AFM cantilever (spherical bead) | Novascan | ||
| AFM software | Catalyst NanoScope | Model: 8.15 SR3R1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher | A12379 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 248614 | Powder |
| anti-AP-2α Antibody | Santa Cruz | sc-12726 | |
| anti-Vinculin antibody | Abcam | ab129002 | |
| Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst | Bruker Corporation | ||
| Collagen type I (100mg) | Corning | 354236 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dichloromethylsilane (DCMS) | Sigma Aldrich | 440272 | |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fluorescence microscope | Leica | Model DMi8 | |
| Fluoromount-G mounting medium | SouthernBiotech | 0100-35 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Powder |
| Horse serum | Corning | 35-030-CI | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad | 1708841 | |
| Penicillin-Streptomycin antibiotic | Thermo Fisher | 15140148 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| Sterile 1x PBS | Hyclone | SH30256.02 | |
| Sterile deionized water | Hardy Diagnostics | U284 | |
| sulfo-SANPAH | Thermo Fisher | 22589 | |
| SYBR green | Applied Biosystems | 4472908 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |
References
- Mehrotra, P., Tseropoulos, G., Bronner, M. E., Andreadis, S. T. Adult tissue-derived neural crest-like stem cells: Sources, regulatory networks, and translational potential. Stem Cells Translational Medicine. 9 (3), 328-341 (2020).
- Liu, J. A., Cheung, M. Neural crest stem cells and their potential therapeutic applications. Developmental Biology. 419 (2), 199-216 (2016).
- Watt, K. E. N., Trainor, P. A., Trainor, P. A. Neurocristopathies: the etiology and pathogenesis of disorders arising from defects in neural crest cell development. Neural Crest Cells-Evolution, Development and Disease. , 361-394 (2014).
- Lavelle, C. L. B. . Applied oral physiology. , (1988).
- Chin, L. The genetics of malignant melanoma: lessons from mouse and man. Nature Reviews Cancer. 3 (8), 559-570 (2003).
- Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Wang, Q., et al. Perturbed development of cranial neural crest cells in association with reduced sonic hedgehog signaling underlies the pathogenesis of retinoic-acid-induced cleft palate. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
- Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
- Barriga, E. H., Franze, K., Charras, G., Mayor, R. Tissue stiffening coordinates morphogenesis by triggering collective cell migration in vivo. Nature. 554 (7693), 523-527 (2018).
- Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
- Mason, D. E., et al. YAP and TAZ limit cytoskeletal and focal adhesion maturation to enable persistent cell motility. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1369-1389 (2019).
- Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
- Lu, Y. -. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Georges, P. C., Miller, W. J., Meaney, D. F., Sawyer, E. S., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
- Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
- Engler, A., Sweeney, H., Discher, D., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 7 (4), 335 (2007).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. Journal of Cell Science. 121 (22), 3794-3802 (2008).
- Robling, A. G., Turner, C. H. Mechanical signaling for bone modeling and remodeling. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 19 (4), 319-338 (2009).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , (2010).
- Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2089 (2010).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
- Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Varying solvent type modulates collagen coating and stem cell mechanotransduction on hydrogel substrates. APL Bioengineering. 3 (3), 036108 (2019).
- Fedoroff, S., Hall, C. Effect of horse serum on neural cell differentiation in tissue culture. In vitro. 15 (8), 641-648 (1979).
- Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young’s modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).
- Mitchell, P. J., Timmons, P. M., Hébert, J. M., Rigby, P., Tjian, R. Transcription factor AP-2 is expressed in neural crest cell lineages during mouse embryogenesis. Genes & Development. 5 (1), 105-119 (1991).
- Wegner, M. Neural crest diversification and specification: transcriptional control of Schwann Cell differentiation. Encyclopedia of Neuroscience. , 153-158 (2010).
- Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-β. Biomaterials. 32 (16), 3921-3930 (2011).
- Sun, M., et al. Effects of matrix stiffness on the morphology, adhesion, proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (3), 257 (2018).
- Burridge, K., Guilluy, C. Focal adhesions, stress fibers and mechanical tension. Experimental Cell Research. 343 (1), 14-20 (2016).
- Burridge, K. Focal adhesions: a personal perspective on a half century of progress. The FEBS Journal. 284 (20), 3355-3361 (2017).
- Zhou, C., et al. Compliant substratum modulates vinculin expression in focal adhesion plaques in skeletal cells. International Journal of Oral Science. 11 (2), 1-9 (2019).
- Fernández, J. L. R., Geiger, B., Salomon, D., Ben-Ze’ev, A. Overexpression of vinculin suppresses cell motility in BALB/c 3T3 cells. Cell Motility and the Cytoskeleton. 22 (2), 127-134 (1992).
- Coll, J., et al. Targeted disruption of vinculin genes in F9 and embryonic stem cells changes cell morphology, adhesion, and locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9161-9165 (1995).
- Saunders, R. M., et al. Role of vinculin in regulating focal adhesion turnover. European Journal of Cell Biology. 85 (6), 487-500 (2006).
- Kuo, J. -. C. Focal adhesions function as a mechanosensor. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 126, 55-73 (2014).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58346 (2018).
- Kolewe, K. W., Zhu, J., Mako, N. R., Nonnenmann, S. S., Schiffman, J. D. Bacterial adhesion is affected by the thickness and stiffness of poly (ethylene glycol) hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (3), 2275-2281 (2018).
- Lin, Y. -. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review E. 82 (4), 041918 (2010).
- Mullen, C. A., Vaughan, T. J., Billiar, K. L., McNamara, L. M. The effect of substrate stiffness, thickness, and cross-linking density on osteogenic cell behavior. Biophysical Journal. 108 (7), 1604-1612 (2015).
- Tusan, C. G., et al. Collective cell behavior in mechanosensing of substrate thickness. Biophysical Journal. 114 (11), 2743-2755 (2018).
- McBurney, M. W., Jones-Villeneuve, E. M., Edwards, M. K., Anderson, P. J. Control of muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature. 299 (5879), 165-167 (1982).
- Hasegawa, A., Shirayoshi, Y. P19 cells overexpressing Lhx1 differentiate into the definitive endoderm by recapitulating an embryonic developmental pathway. Yonago Acta Medica. 58 (1), 15 (2015).
- Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
- Gavara, N. A beginner’s guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
- Butler, J. P., Tolic-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Leong, W. S., et al. Thickness sensing of hMSCs on collagen gel directs stem cell fate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (2), 287-292 (2010).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Funaki, M., Janmey, P. A. Technologies to engineer cell substrate mechanics in hydrogels. Biology and Engineering of Stem Cell Niches. , 363-373 (2017).
