Et optimalisert O9-1/Hydrogel-system for å studere mekaniske signaler i nevrale kamceller
Summary
Detaljerte trinnvise protokoller er beskrevet her for å studere mekaniske signaler in vitro ved hjelp av multipotente O9-1 nevrale kamceller og polyakrylamidhydrgeler av varierende stivhet.
Abstract
Neural crest celler (NCCs) er virveldyr embryonale multipotente celler som kan migrere og skille seg inn i et bredt utvalg av celletyper som gir opphav til ulike organer og vev. Vevsstivhet produserer mekanisk kraft, et fysisk signal som spiller en kritisk rolle i NCC-differensiering; Mekanismen er imidlertid fortsatt uklar. Metoden beskrevet her gir detaljert informasjon for optimalisert generering av polyakrylamidhydrgeler av varierende stivhet, nøyaktig måling av slik stivhet og evaluering av virkningen av mekaniske signaler i O9-1 celler, en NCC-linje som etterligner in vivo NCCs.
Hydrogelstivhet ble målt ved hjelp av atomkraftmikroskopi (AFM) og indikerte forskjellige stivhetsnivåer tilsvarende. O9-1 NCC dyrket på hydrogeler av varierende stivhet viste forskjellig cellemorfologi og genuttrykk av stressfibre, noe som indikerte varierende biologiske effekter forårsaket av mekaniske signalendringer. Videre slo dette fast at varierende hydrogelstivhet resulterte i et effektivt in vitro-system for å manipulere mekanisk signalering ved å endre gelstivhet og analysere den molekylære og genetiske reguleringen i NCCs. O9-1 NCCs kan skille seg ut i et bredt spekter av celletyper under påvirkning av de tilsvarende differensieringsmediene, og det er praktisk å manipulere kjemiske signaler in vitro. Derfor er dette in vitro-systemet et kraftig verktøy for å studere rollen som mekanisk signalering i NCCer og dets interaksjon med kjemiske signaler, noe som vil hjelpe forskere til å bedre forstå de molekylære og genetiske mekanismene for nevral kamutvikling og sykdommer.
Introduction
Neural crest celler (NCCs) er en gruppe stamceller under virveldyr embryogenese med en bemerkelsesverdig evne til å migrere og bidra til utvikling av ulike organer og vev. NCCer kan skille seg ut i forskjellige celletyper, inkludert sensoriske nevroner, brusk, bein, melanocytter og glatte muskelceller, avhengig av plasseringen av aksial opprinnelse og den lokale miljøveiledningen til NCC1,2. Med evnen til å skille seg ut i et bredt spekter av celletyper, kan genetiske abnormiteter som forårsaker dysregulering på et hvilket som helst stadium av nevral kam (NC) utvikling føre til mange medfødte sykdommer2. For eksempel fører perturbasjoner under dannelsen, migrasjonen og utviklingen av NCCer til utviklingsforstyrrelser kjent samlet som nevrokritiske1,3. Disse sykdommene spenner fra kraniofaciale defekter på grunn av svikt i NCC-dannelse, som Treacher Collins syndrom, til utvikling av ulike kreftformer på grunn av NCC metastatisk migrasjonsevne, sett i melanom3,4,5,6. I løpet av de siste tiårene har forskere gjort bemerkelsesverdige funn om NCCs roller og mekanismer i utvikling og sykdommer, der de fleste funnene er fokusert på kjemiske signaler7,8. Mer nylig har mekaniske signaler blitt indikert for å spille en kritisk, men dårlig forstått rolle i NCC utvikling9,10.
Miljøsignalene til NCCer spiller en kritisk rolle under utviklingen, inkludert regulering av NCC-differensiering i ulike celletyper. Miljøsignaler, for eksempel fysiske signaler, påvirker pivotal atferd og cellulære responser, for eksempel funksjonell diversifisering. Mechanotransduction gjør det mulig for celler å føle og reagere på disse signalene for å opprettholde ulike biologiske prosesser2. NCCer er omgitt av nærliggende celler og forskjellige substrater, for eksempel den ekstracellulære matrisen (ECM), som kan gi opphav til mekaniske stimuli for å opprettholde homeostase og tilpasse seg endringene gjennom skjebnebestemmelse, spredning og apoptose11. Mekanotransduksjon begynner ved plasmamembranen der den sensoriske komponenten av mekaniske ekstracellulære stimuli oppstår, noe som resulterer i intracellulær regulering av celle12. Integrins, fokale vedheft og veikryss i plasmamembranreléet mekaniske signaler, for eksempel skjærekrefter, stress og stivheten til omkringliggende substrater, til kjemiske signaler for å produsere cellulære responser12. Videresending av kjemiske signaler fra plasmamembranen til den endelige cellulære reguleringen utføres via forskjellige signalveier for å fullføre vitale prosesser for organismen, for eksempel differensiering.
Flere studier har antydet at mekanisk signalering fra substratstivhet spiller en rolle i celledifferensiering13,14. For eksempel har tidligere studier vist at mesenchymale stamceller (MSC) vokst på myke substrater med en stivhet som ligner på hjernevev (i området 0,1-1,0 kPa) resulterte i nevronal celledifferensiering15,16. Imidlertid skiller flere MSCer seg inn i myokyttlignende celler når de vokser på 8-17 kPa-substrater som etterligner muskelens stivhet, mens osteoblastlignende differensiering ble observert når MSCer ble dyrket på stive substrater (25-40 kPa)15,16. Betydningen av mekanotransduksjon fremheves av uregelmessigheter og abnormiteter i den mekaniske signalveien som potensielt fører til alvorlige utviklingsfeil og sykdommer, inkludert kreft, kardiovaskulære sykdommer og osteoporose17,18,19. I kreft er normalt brystvev mykt, og risikoen for brystkreft øker i stivt og tett brystvev, et miljø som er mer lik brystsvulster15. Med denne kunnskapen kan effekten av mekanisk signalering på NCC-utvikling studeres gjennom enkel manipulering av substratstivhet gjennom et in vitro-system, noe som gir ytterligere fordeler og muligheter til å forstå det grunnleggende om NC-relatert sykdomsprogresjon og etiologi.
For å studere effekten av mekaniske signaler i NCCer etablerte vi et effektivt in vitro-system for NCCer basert på optimalisering av tidligere publiserte metoder og evaluering av NCCs respons på ulike mekaniske signaler20,21. Det ble gitt en detaljert protokoll for varierende hydrogelstivhetsforberedelse og evaluering av virkningen av mekanisk signalering i NCCer. For å oppnå dette benyttes O9-1 NCC som NC-modell for å studere effekter og endringer som følge av stive kontra myke hydrogeler. O9-1 NCCs er en stabil NC celle linje isolert fra musen embryo (E) på dag 8.5. O9-1 NCCer etterligner NCCer in vivo fordi de kan skille seg ut i ulike NC-avledede celletyper i definert differensieringsmedie22. For å studere mekanisk signalering av NCCer ble et matrisesubstrat fremstilt med justerbar elastisitet fra varierende konsentrasjoner av akrylamid- og bisakrylamidløsninger for å oppnå ønsket stivhet, korrelert med den biologiske substratstivheten20,21,23. For å optimalisere betingelsene for matriseunderlag for NCCer, spesielt O9-1-celler, ble det gjort endringer fra den tidligere publiserte protokollen20. En endring i denne protokollen var å inkubere hydrogeler i kollagen I, fortynnet i 0,2% eddiksyre i stedet for 50 mM HEPES, ved 37 °C over natten. Den lave pH av eddiksyre fører til en homogen fordeling og høyere kollagen I inkorporering, og dermed muliggjør en mer jevn vedlegg av ECM protein24. I tillegg ble en kombinasjon av hesteserum og fostal bovin serum (FBS) brukt i konsentrasjonene på henholdsvis 10% og 5% i fosfatbuffersalt (PBS), før de lagret hydrogelene i inkubatoren. Hesteserum ble brukt som et ekstra supplement til FBS på grunn av sin evne til å fremme celleproliferasjon og differensiering ved konsentrasjonen på 10%25.
Med denne metoden ble et biologisk miljø etterlignet av ECM-proteinbelegget (f.eks. kollagen I) for å skape et nøyaktig in vitro-miljø for NCCer å vokse og overleve20,21. Stivheten til de forberedte hydrogelene ble kvantitativt analysert via atomkraftmikroskopi (AFM), en kjent teknikk for å skildre den elastiske modulus26. For å studere effekten av ulike stivhetsnivåer på NCCer ble ville O9-1-celler dyrket og forberedt på hydrogeler for immunfluorescens (IF) farging mot filamentøs aktin (F-aktin) for å vise forskjellene i celleadhesjon og morfologier som svar på endringer i substratstivhet. Ved hjelp av dette in vitro-systemet vil forskerne kunne studere rollene til mekanisk signalering i NCCer og dets interaksjon med andre kjemiske signaler for å få en dypere forståelse av forholdet mellom NCCer og mekanisk signalering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Målet med den nåværende studien er å gi et effektivt in vitro-system for bedre å forstå effekten av mekaniske signaler i NCC. I tillegg til å følge den trinnvise protokollen nevnt ovenfor, må forskerne huske på at cellekulturen til O9-1 NCCs påvirkes av typen glassdeksler som brukes til å forberede hydrogeler. For eksempel ble det bemerket at celler frøet på en bestemt type glassdekslerlip (se materialtabellen) overlevde og spredte seg godt, mens dyrkede celler frøet på andre typ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Ana-Maria Zaske, operatør for Atomic Force Microscope-UT Core-anlegget ved University of Texas Health Sciences Center, for den medvirkende ekspertisen i AFM i dette prosjektet. Vi takker også finansieringskildene fra National Institutes of Health (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 og R01HL142704 til J. Wang).
Materials
| 12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-012 | |
| 2% Bis-Acrylamide | Sigma Aldrich | M1533 | |
| 24-well plate | Greiner Bio-one | 662165 | |
| 25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-025 | |
| 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) | Sigma Aldrich | A3648 | |
| 4-well cell culture plate | Thermo Scientific | 179830 | |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | J61899-AP | |
| 40% Acrylamide | Sigma Aldrich | A4058 | |
| 50% glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G7651 | |
| 6-well cell culture plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| AFM cantilever (spherical bead) | Novascan | ||
| AFM software | Catalyst NanoScope | Model: 8.15 SR3R1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher | A12379 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 248614 | Powder |
| anti-AP-2α Antibody | Santa Cruz | sc-12726 | |
| anti-Vinculin antibody | Abcam | ab129002 | |
| Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst | Bruker Corporation | ||
| Collagen type I (100mg) | Corning | 354236 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dichloromethylsilane (DCMS) | Sigma Aldrich | 440272 | |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fluorescence microscope | Leica | Model DMi8 | |
| Fluoromount-G mounting medium | SouthernBiotech | 0100-35 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Powder |
| Horse serum | Corning | 35-030-CI | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad | 1708841 | |
| Penicillin-Streptomycin antibiotic | Thermo Fisher | 15140148 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| Sterile 1x PBS | Hyclone | SH30256.02 | |
| Sterile deionized water | Hardy Diagnostics | U284 | |
| sulfo-SANPAH | Thermo Fisher | 22589 | |
| SYBR green | Applied Biosystems | 4472908 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |
References
- Mehrotra, P., Tseropoulos, G., Bronner, M. E., Andreadis, S. T. Adult tissue-derived neural crest-like stem cells: Sources, regulatory networks, and translational potential. Stem Cells Translational Medicine. 9 (3), 328-341 (2020).
- Liu, J. A., Cheung, M. Neural crest stem cells and their potential therapeutic applications. Developmental Biology. 419 (2), 199-216 (2016).
- Watt, K. E. N., Trainor, P. A., Trainor, P. A. Neurocristopathies: the etiology and pathogenesis of disorders arising from defects in neural crest cell development. Neural Crest Cells-Evolution, Development and Disease. , 361-394 (2014).
- Lavelle, C. L. B. . Applied oral physiology. , (1988).
- Chin, L. The genetics of malignant melanoma: lessons from mouse and man. Nature Reviews Cancer. 3 (8), 559-570 (2003).
- Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Wang, Q., et al. Perturbed development of cranial neural crest cells in association with reduced sonic hedgehog signaling underlies the pathogenesis of retinoic-acid-induced cleft palate. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
- Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
- Barriga, E. H., Franze, K., Charras, G., Mayor, R. Tissue stiffening coordinates morphogenesis by triggering collective cell migration in vivo. Nature. 554 (7693), 523-527 (2018).
- Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
- Mason, D. E., et al. YAP and TAZ limit cytoskeletal and focal adhesion maturation to enable persistent cell motility. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1369-1389 (2019).
- Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
- Lu, Y. -. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Georges, P. C., Miller, W. J., Meaney, D. F., Sawyer, E. S., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
- Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
- Engler, A., Sweeney, H., Discher, D., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 7 (4), 335 (2007).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. Journal of Cell Science. 121 (22), 3794-3802 (2008).
- Robling, A. G., Turner, C. H. Mechanical signaling for bone modeling and remodeling. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 19 (4), 319-338 (2009).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , (2010).
- Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2089 (2010).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
- Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Varying solvent type modulates collagen coating and stem cell mechanotransduction on hydrogel substrates. APL Bioengineering. 3 (3), 036108 (2019).
- Fedoroff, S., Hall, C. Effect of horse serum on neural cell differentiation in tissue culture. In vitro. 15 (8), 641-648 (1979).
- Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young’s modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).
- Mitchell, P. J., Timmons, P. M., Hébert, J. M., Rigby, P., Tjian, R. Transcription factor AP-2 is expressed in neural crest cell lineages during mouse embryogenesis. Genes & Development. 5 (1), 105-119 (1991).
- Wegner, M. Neural crest diversification and specification: transcriptional control of Schwann Cell differentiation. Encyclopedia of Neuroscience. , 153-158 (2010).
- Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-β. Biomaterials. 32 (16), 3921-3930 (2011).
- Sun, M., et al. Effects of matrix stiffness on the morphology, adhesion, proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (3), 257 (2018).
- Burridge, K., Guilluy, C. Focal adhesions, stress fibers and mechanical tension. Experimental Cell Research. 343 (1), 14-20 (2016).
- Burridge, K. Focal adhesions: a personal perspective on a half century of progress. The FEBS Journal. 284 (20), 3355-3361 (2017).
- Zhou, C., et al. Compliant substratum modulates vinculin expression in focal adhesion plaques in skeletal cells. International Journal of Oral Science. 11 (2), 1-9 (2019).
- Fernández, J. L. R., Geiger, B., Salomon, D., Ben-Ze’ev, A. Overexpression of vinculin suppresses cell motility in BALB/c 3T3 cells. Cell Motility and the Cytoskeleton. 22 (2), 127-134 (1992).
- Coll, J., et al. Targeted disruption of vinculin genes in F9 and embryonic stem cells changes cell morphology, adhesion, and locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9161-9165 (1995).
- Saunders, R. M., et al. Role of vinculin in regulating focal adhesion turnover. European Journal of Cell Biology. 85 (6), 487-500 (2006).
- Kuo, J. -. C. Focal adhesions function as a mechanosensor. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 126, 55-73 (2014).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58346 (2018).
- Kolewe, K. W., Zhu, J., Mako, N. R., Nonnenmann, S. S., Schiffman, J. D. Bacterial adhesion is affected by the thickness and stiffness of poly (ethylene glycol) hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (3), 2275-2281 (2018).
- Lin, Y. -. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review E. 82 (4), 041918 (2010).
- Mullen, C. A., Vaughan, T. J., Billiar, K. L., McNamara, L. M. The effect of substrate stiffness, thickness, and cross-linking density on osteogenic cell behavior. Biophysical Journal. 108 (7), 1604-1612 (2015).
- Tusan, C. G., et al. Collective cell behavior in mechanosensing of substrate thickness. Biophysical Journal. 114 (11), 2743-2755 (2018).
- McBurney, M. W., Jones-Villeneuve, E. M., Edwards, M. K., Anderson, P. J. Control of muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature. 299 (5879), 165-167 (1982).
- Hasegawa, A., Shirayoshi, Y. P19 cells overexpressing Lhx1 differentiate into the definitive endoderm by recapitulating an embryonic developmental pathway. Yonago Acta Medica. 58 (1), 15 (2015).
- Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
- Gavara, N. A beginner’s guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
- Butler, J. P., Tolic-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Leong, W. S., et al. Thickness sensing of hMSCs on collagen gel directs stem cell fate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (2), 287-292 (2010).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Funaki, M., Janmey, P. A. Technologies to engineer cell substrate mechanics in hydrogels. Biology and Engineering of Stem Cell Niches. , 363-373 (2017).
