השתלת פיגומי מטריצת קולגן תלת מימדית כאסטרטגיית התחדשות הכבד
Summary
מחלות כבד נגרמות על ידי גורמים רבים המקדמים פיברוזיס או שחמת הכבד. השתלה היא האפשרות היחידה להחלים בריאות. עם זאת, בהתחשב במחסור באיברים הניתנים להשתלה, יש לחקור חלופות. המחקר שלנו מציע השתלת פיגומי קולגן ברקמת הכבד ממודל של בעלי חיים.
Abstract
מחלות כבד הן הגורם המוביל למוות ברחבי העולם. צריכת אלכוהול מופרזת, דיאטה עתירת שומן, זיהום וירוס הפטיטיס C לקדם פיברוזיס, שחמת הכבד, ו/או קרצינומה hepatocellular. השתלת כבד היא ההליך המומלץ קלינית כדי לשפר ולהאריך את תוחלת החיים של חולים בשלבי מחלה מתקדמים. עם זאת, רק 10% מההשתלות מצליחות, עם זמינות איברים, הליכים פרהיסטוריים ופוסט-כירורגיים, ועלויות גבוהות מתואמות ישירות עם תוצאה זו. פיגומים מטריצה חוץ תאית (ECM) הופיעו כחלופה לשיקום רקמות. תאימות ביולוגית וקבלת שתל הם המאפיינים המועילים העיקריים של אותם ביו-חומרים. למרות היכולת לשחזר את הגודל ואת הפונקציה הנכונה של הכבד כבר מוערך במודלים hepatectomy הכבד, השימוש פיגומים או איזה תמיכה כדי להחליף את נפח מסת הכבד extirpated לא הוערך.
כריתת חזה חלקית בוצעה בכבד חולדה עם קסנוימפלנטייה של פיגום מטריצת קולגן (CMS) מקונדיל בקר. רקמת האונה השמאלית של הכבד הוסרה (כ-40%), וחלק שווה של CMS הושתל בניתוח. בדיקות תפקודי כבד הוערכו לפני ואחרי ההליך הכירורגי. לאחר ימים 3, 14 ו – 21, בעלי החיים הומתו, והערכות מקרוסקופיות והיסטולוגיות בוצעו. בימים 3 ו -14, רקמת שומן נצפתה סביב CMS, ללא ראיות קליניות של דחייה או זיהום, כמו גם neoformation כלי ו CMS reabsorption ביום 21. היו עדויות היסטולוגיות לתהליך דלקת חסר משמעות ונדידה של תאים סמוכים ל- CMS, שנצפו עם ההמטוקסילין והאאוזין (H&E) והכתמת הטריכרום של מאסון. ה- CMS הוכח כביצועים טובים ברקמת הכבד ויכול להיות חלופה שימושית לחקר התחדשות רקמות ותיקון במחלות כבד כרוניות.
Introduction
הכבד הוא אחד האיברים החשובים ביותר המעורבים בשמירה על הומאוסטזיס וייצור חלבון1. למרבה הצער, מחלת כבד היא הגורם המוביל למוות ברחבי העולם. בשלבים מתקדמים של נזק לכבד, הכוללים שחמת הכבד וקרצינומה hepatocellular, השתלת כבד היא ההליך המומלץ קלינית. עם זאת, בשל המחסור של תורמים ואת השיעור הנמוך של השתלות מוצלחות, טכניקות חדשות בהנדסתרקמות(TE) ורפואה רגנרטיבית (RM) פותחו 2,3.
TE כרוך בשימוש בתאי גזע, פיגומים וגורמי גדילה4 כדי לקדם את השיקום של איברים ובטטות מודלקים, פיברוטיים ובדים1,5,6. הביו-חומרים המשמשים בפיגומים מחקים את ה- ECM המקומי, ומספקים את הרמזים הפיזיים, הכימיים והביולוגיים לשיפוץ תאי מודרך7. קולגן הוא אחד החלבונים הנפוצים ביותר המתקבלים מהדרמיס, הגיד, המעי וקרום הלב8,9. יתר על כן, קולגן ניתן להשיג כמו ביופולימר לייצר פיגומים דו-ממדיים ותלת ממדיים באמצעות ביו הדפסה או electrospinning10,11. קבוצה זו היא הראשונה לדווח על השימוש בקולגן ממקור עצם להתחדשות של רקמת הכבד. מחקר אחר מדווח על שימוש בפיגומים מסונתזים מקולגן בקר, אשר הושג מהעור, עם נקבוביות הומוגניות הממוקמות מקרוב, ללא כל תקשורתביניהם 12.
Decellularization משמר את ECM המקורי, המאפשר שילוב הבא של תאים עם פוטנציאל לתאי גזע13,14. עם זאת, הליך זה הוא עדיין בשלב הניסוי בכבד, בלב, בכליות, המעי הדק, ושלפוחית השתן מעכברים, חולדות, ארנבות, חזירים, כבשים, בקר, וסוסים3,14. נכון לעכשיו, נפח מסת הכבד שנקטף אינו מוחלף באף אחד מהדגמים של כריתת הפטקטומיה של בעלי חיים. עם זאת, השימוש בתמיכה נוספת או ברשת (ביו-חומרים) המאפשרת התפשטות תאים ואנגיוגנזה יכול להיות חיוני לשיקום מהיר של פונקציות פרנשימאליות בכבד. לכן, פיגומים יכולים להיות מועסקים כגישות חלופיות כדי לחדש או לתקן רקמה במחלות כבד כרוניות, בתורו, ביטול מגבלות עקב תרומה ואת הסיבוכים הקליניים של השתלת כבד.
Protocol
Representative Results
Discussion
השתלת איברים היא עמוד התווך של הטיפול בחולים עם פיברוזיס בכבד או שחמת הכבד. כמה חולים נהנים מהליך זה, מה שהופך את הצורך לספק חלופות טיפוליות עבור חולים ברשימת ההמתנה. הנדסת רקמות היא אסטרטגיה מבטיחה המעסיקה פיגומים ותאים עם פוטנציאל התחדשות2,4,<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לאנשי מתקן חיות המעבדה של היחידה לרפואה ניסיונית, האחות קרולינה באניוס G. על תמיכה טכנית וניתוחית, מרקו א Gudiño Z. על תמיכה מיקרופוטוגרפים, ואריק אפו לתמיכה היסתולוגיה בכבד. המועצה הלאומית תמכה במחקר זה למדע וטכנולוגיה (CONACyT), מספר המענק SALUD-2016-272579 ו- PAPIIT-UNAM TA200515.
Materials
| Anionic detergent | Alconox | Z273228 | |
| Biopsy cassettes | Leica | 3802453 | |
| Camera DMX | Nikon | DXM1200F | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | BD | 372412 | |
| Cover glasses 25 mm x 40 mm | Corning | 2980-224 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 200-M | CAS 17372-87-1 |
| Ethyl alcohol, pure | Sigma-Aldrich | 459836 | CAS 64-17-5 |
| Flunixine meglumide | MSD | Q-0273-035 | |
| Glass slides 75 mm x 25 mm | Corning | 101081022 | |
| Hematoxylin | Merck | H9627 | CAS 571-28-2 |
| Hydrochloric acid 37% | Merck | 339253 | CAS 7647-01-0 |
| Ketamine | Pisa agropecuaria | Q-7833-028 | |
| Light microscopy | Nikon | Microphoto-FXA | |
| Microtainer yellow cape | Beckton Dickinson | 365967 | |
| Microtome | Leica | RM2125 | |
| Model animal: Wistar rats | Universidad Nacional Autónoma de México | ||
| Nylon 3-0 (Dermalon) | Covidien | 1750-41 | |
| Polypropylene 7-0 | Atramat | SE867/2-60 | |
| Povidone-iodine10% cutaneous solution | Diafra SA de CV | 1.37E+86 | |
| Scaning electronic microscopy | Zeiss | DSM-950 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J. T. Baker | 3722-01 | CAS 1310-73-2 |
| Software ACT-1 | Nikon | Ver 2.70 | |
| Stereoscopy macroscopy | Leica | EZ4Stereo 8X-35X | |
| Sterrad 100S | Johnson and Johnson | 99970 | |
| Surgipath paraplast | Leica | 39601006 | |
| Synringe of 1 mL with needle (27G x 13 mm) | SensiMedical | LAN-078-077 | |
| Tissue Processor (Histokinette) | Leica | TP1020 | |
| Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder) | Sakura Finetek USA | 5229 | |
| Trichrome stain kit | Sigma-Aldrich | HT15 | |
| Unicell DxC600 Analyzer | Beckman Coulter | BC 200-10 | |
| Xylazine | Pisa agropecuaria | Q-7833-099 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | CAS 1330-20-7 |
References
- Li, N., Hua, J. Immune cells in liver regeneration. Oncotarget. 8 (2), 3628-3639 (2017).
- Langer, R., Vacanti, J. Tissue Engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Shafiee, A., Atla, A. Tissue engineering: Toward a new era of medicine. Annual Review of Medicine. 68, 29-40 (2017).
- Hu, C., Zhao, L., Wu, Z., Li, L. Transplantation of mesenchymal stem cells and their derivatives effectively promotes liver regeneration to attenuate acetaminophen-induced liver injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 88 (2020).
- Sancho-Bru, P. Therapeutic possibilities of stem cells in the treatment of liver diseases. Gastroenterologia y Hepatologia. 34 (10), 701-710 (2011).
- Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
- Freedman, B. R., Mooney, D. J. Biomaterials to mimic and heal connective tissues. Advanced Materials. 31 (19), 1806695 (2019).
- Meyer, M. Processing of collagen based biomaterials and the resulting materials properties. Biomedical Engineering Online. 18 (1), 24 (2019).
- El Baz, H., et al. Transplant of hepatocytes, undifferentiated mesenchymal stem cells, and in vitro hepatocyte-differentiated mesenchymal stem cells in a chronic lver failure experimental model: a comparative study. Experimental and Clinical Transplantation. 16 (1), 81-89 (2018).
- Nedjari, S., Awaja, F., Guarino, R., Gugutkov, D., Altankov, G. Establishing multiple osteogenic differentiation pathways of mesenchymal stem cells through different scaffold configurations. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (10), 1428-1437 (2020).
- Chan, E. C., et al. Three dimensional collagen scaffold promotes intrinsic vascularisation for tissue engineering applications. PLoS One. 11 (2), 0149799 (2016).
- Arenas-Herrera, J. E., Ko, I. K., Atala, A., Yoo, J. J. Decellularization for whole organ bioengineering. Biomedical Materials. 8 (1), 014106 (2013).
- Parmaksiz, M., Dogan, A., Odabas, S., Elçin, A. E., Elçin, Y. M. Clinical applications of decellularized extracellular matrices for tissue engineering and regenerative medicine. Biomedical Materials. 11 (2), 022003 (2016).
- Gacek, G. Stereo microscope, neglected tool. Postepy Biochemii. 63 (1), 68-73 (2017).
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130 (2019).
- The University of Texas at Austin Institutional Animal Care and Use Committee. . Guidelines for the Use of Chemical Depilatory Agents on Laboratory Animals. , (2021).
- Sivridis, L., Kotini, A., Anninos, P. The process of learning in neural net models with Poisson and Gauss connectivities. Neural Networks. 21 (1), 28-35 (2008).
- León-Mancilla, B. H., Araiza-Téllez, M. A., Flores-Flores, J. O., Piña-Barba, M. C. Physico-chemical characterization of collagen scaffolds for tissue engineering. Journal of Applied Research and Technology. 14 (1), 77-85 (2016).
- León, A., et al. Hematological and biochemical parameters in Sprague Dawley laboratory rats breed in CENPALAB, Cenp:SPRD. Revista Electronica de Veterinaria. 12, 1-10 (2011).
- Tsuchiya, A., et al. Mesenchymal stem cell therapies for liver cirrhosis: MSCs as “conducting cells” for improvement of liver fibrosis and regeneration. Inflammation and Regeneration. 39, 18 (2019).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
- Acevedo, G. C. Xenoimplante de colágena en uretra de perro. Universidad Nacional Autónoma de México. , (2011).
- Montalvo-Jave, E. E., et al. Absorbable bioprosthesis for the treatment of bile duct injury in an experimental model. International Journal of Surgery. 20, 163-169 (2015).
