Denne protokol beskriver to følsomme assays til kræsning blandt mild, moderat, og svær motorisk svækkelse i C. elegans modeller af amyotrofisk lateral sklerose, med generelle nytte for C. elegans stammer, med ændret motilitet.
Den neurodegenerative sygdom amyotrofisk lateral sklerose (ALS) har progressivt tab af motoriske neuroner ledsaget af muskelsvaghed og motorisk svækkelse, der forværres med tiden. Mens der er gjort betydelige fremskridt med hensyn til at bestemme genetiske drivkræfter for ALS for en delmængde af patienter, har de fleste tilfælde en ukendt ætiologi. Endvidere er de mekanismer, der ligger til grund for motor neuron dysfunktion og degeneration ikke godt forstået; derfor er der et vedvarende behov for at udvikle og karakterisere repræsentative modeller for at studere disse processer. Caenorhabditis elegans kan tilpasse deres bevægelse til de fysiske begrænsninger i deres omgivelser, med to primære bevægelse paradigmer undersøgt i et laboratorium miljø-kravle på en fast overflade og svømning i væske. Disse repræsenterer et komplekst samspil mellem sensation, motoriske neuroner og muskler. C. elegans modeller af ALS kan udvise svækkelse i en eller begge af disse bevægelse paradigmer. Denne protokol beskriver to følsomme analyser til evaluering af motilitet i C. elegans: en optimeret radial bevægelsesanalyse, der måler krybe på en fast overflade og en automatiseret metode til sporing og analyse af svømning i væske (prygl). Ud over karakterisering af baseline motorisk svækkelse af ALS-modeller, disse analyser kan opdage undertrykkelse eller forbedring af fænotyper fra genetiske eller små molekyle interventioner. Således har disse metoder nytte til at studere ALS-modeller og enhver C. elegans stamme, der udviser ændret motilitet.
Amyotrofisk Lateral Sklerose (ALS) er en invaliderende, aldringsrelateret neurodegenerativ sygdom med en særlig indvirkning på motoriske neuroner. Sygdommen har tab af motoriske neuroner i hjernen og rygmarven og progressiv motorisk svækkelse. Dette resulterer i større funktionelt handicap og for tidlig død, typisk inden for 3-5 år efter diagnose1. Mutationer i mindst 38 gener kan forårsage ALS; De fleste patienter med ALS akkumulerer dog allestedsnærværende indeslutninger af proteinet TDP-43 som deres primære patologi i neuroner og gliaceller2,3,4. Der er udviklet en række dyremodeller til undersøgelse af de underliggende mekanismer, der forårsager eller bidrager til ALS in vivo (revideret i5). I C. elegans omfatter disse modeller genetiske tab-af-funktion mutationer i homolog af ALS-forårsager gener eller transgen udtryk for menneskelige ALS gener. Der er mange fordele ved modellering ALS i C. elegans. C. elegans er et let kantbart dyr med et differentieret nervesystem, velkarakteriseret adfærdsparadigmer og betydelig genetisk hyldest til mennesker6,7. Mange værktøjer findes til at arbejde med C. elegans, herunder robust genom redigering kapaciteter, in vivo fluorescerende reportere af neurodegeneration, RNAi screening paradigmer, tractable genetik, og etablerede adfærdsmæssige og fænotypiske assays. C. elegans modeller af ALS rekapitulere aspekter af menneskers sygdom, herunder ophobning af uopløseligt protein, neurodegeneration, og tidlig død8,9. Desuden, motorisk dysfunktion byder forstyrrelse af både kravle og svømning adfærd er til stede i mange C. elegans ALS modeller.
Denne protokol beskriver to metoder til at karakterisere C. elegans motorfænotyper: radial bevægelse assay til evaluering kravle på en fast overflade og vurdering af svømning i væske (prygl) ved hjælp af WormLab automatiseret sporing og analyse. Disse følsomme metoder til karakterisering af motoriske underskud tillader sammenligninger af sværhedsgrad og tilbyder værktøjer til måling undertrykkelse og forbedringer af motorfænotyper. Den radiale bevægelse assay kvantificerer forskelle i kravle motilitet (sinusformet bevægelse på en solid overflade) blandt populationer af orme. Denne analyse udnytter C. elegans naturlige unstimulerede udforskning adfærd ved at placere orme i et enkelt sted på en plade og markerer deres endelige placering efter en given periode10. Alternativt, svømning i flydende (prygl) assays tælle kroppen bøjninger af de enkelte orme over en bestemt periode. Den manuelle optælling af kroppen bøjer ved det menneskelige øje er tidskrævende og udviser typisk betydelig variation mellem forsøgspersonerne. Brugen af computerassisteret automatiseret sporing og analyse kan eliminere meget af denne variation. Ud over karakterisering af baseline motorisk svækkelse af ALS-modeller, både radial bevægelse og svømning assays kan opdage graduering af forskellige locomotoriske fænotyper fra genetiske eller små molekyle interventioner. Disse metoder har nytte til at studere ALS-modeller og enhver C. elegans stamme, der udviser ændret motilitet.
Radial bevægelse:
Opløsningen af denne analyse styres let ved at ændre tidsvariablen. At øge længden af tid gør det lettere at observere forskelle mellem dyr med alvorlige fænotyper og derved identificere subtile forskelle. Men fordi denne analyse måler forskydning, hvis analysen tid forlænges for længe, dyr med normal motilitet, såsom N2, vil rejse til kanterne af pladen, og fouragering adfærd vil føre til backtracking. Dette vil kunstigt reducere målingen af tilbagelagt afstand. Tidsperioder, der er for lange, kan resultere i, at forskellene mellem stammer, især mellem dyr med mindre alvorlige motorfænotyper, forsvinder, efterhånden som dyrene bliver jævnt spredt over pladen. Afkortning af tidsvariablen forhindrer mere aktive orme i at finde pladens kanter. Denne metode sporer ikke den samlede tilbagelagte afstand for hver orm, men komprimerer den tilbagelagte afstand for hver orm til en lineær afstand fra midten af pladen. Som sådan er det i sagens natur mindre robust end en metode, der registrerer den samlede sporlængde for individuelle orme. Men, radial bevægelse assay kræver meget lidt forsker uddannelse, bruger relativt overkommelige reagenser, der er almindeligt tilgængelige i de fleste orm labs, og er følsom nok til at producere betydelige og reproducerbare resultater. For laboratorier, der foretrækker automatiseret video tracking, flere metoder er tidligere blevet etableret for at spore og analysere gennemsøgning bevægelser12, eller software parametre, der anvendes til svømning assay i dette papir kan ændres for at tillade crawling afsløring og analyse.
Dette eksperiment er normalt gjort i tredominere uafhængige replikerer, med et sæt af 30-40 orme pr replika. Hver replikation er opdelt på to forskellige 100 mm eller 150 mm plader, med 15-20 orme pr plade. Brug af flere orme end anbefalet pr plade kan gøre det svært at score effektivt. Et samlet antal scorede på 90 + er tilstrækkeligt drevet til at etablere betydning for mild, moderat eller svær motilitet værdiforringelse. At være i overensstemmelse med timingen mellem de scorede stammer er afgørende for nøjagtighed og reproducerbarhed. 30 minutter er generelt lang nok til at fastslå forskelle mellem moderate til alvorlige fænotyper såsom transgene stammer, der udtrykker human mutant TDP-43 i forhold til vilde orme (Figur 4). Hvis tidsvariablen forlænges, er det tilrådeligt også at øge pladens størrelse fra 100 mm til 150 mm. Miljømæssige faktorer såsom temperatur og fugtighed kan påvirke denne analyse, som typisk udføres ved omgivende stuetemperatur, så det er vigtigt altid at bruge en wild-type (N2) kontrol, når man sammenligner på tværs af replikater. Derudover kan denne analyse måle motiliteten af nogle stammer, der ikke udviser normal svømning adfærd i væske (prygl), hvilket gør det til et nyttigt supplement til svømning assay.
Svømning assay:
Brugen af billed- og anskaffelsessystemet til at automatisere sporing og analyse af ormsvømning giver mulighed for strenge og upartiske data. Der er dog flere faktorer under den indledende opsætning af eksperimentet, der skal kontrolleres mellem prøverne. Disse omfatter tid til at akklimatificere sig til væske, før du begynder optagelse, omgivende forhold (dvs. temperatur, fugtighed) og konsekvente lys- og optagelsesindstillinger. På optagelsesstadiet er der flere funktioner, der hjælper med at reducere variationen mellem plader. Disse omfatter et integreret spormonteret kamera og lysfeltsstadie, der gør optagelse af video konsistent mellem plader, afskærmning rundt på scenen, der forhindrer refleksioner, blænding og luftbevægelser under optagelse, og en robust softwarepakke, der pålideligt registrerer orme og giver mulighed for manuel korrektion af spor i video efterbehandling. I denne protokol optages videoer af en 35 mm plade med orme i 1 minut og behandles derefter ved hjælp af softwarepakken. Efter behandling sikrer manuel korrektion af spor, at ormadfærd registreres nøjagtigt uden forvirrende sporingsfejl. Slå antal og spor varighedsdata bruges til at bestemme sving pr. minut som en endelig udlæsning. For at sikre reproducerbarhed indsamles data over mindst 3 uafhængige replikeringsforsøg, hver med 40-50 dyr scoret, for at opnå et samlet endeligt antal dyr 120-150. Dette tal er tilstrækkeligt til at diskriminere små forskelle i svømning adfærd fra kontrol orme. Nogle orme har motoriske underskud for alvorlige til at blive fanget af svømning assays. For eksempel, hvis dyrene placeres i en flydende medium krølle i stedet for at udføre den forventede prygl svar, vil denne analyse ikke registrere disse bevægelser præcist og en anden bevægelse assay, såsom radial bevægelse, kan bedre fange disse motilitet fejl. Den angivne protokol bruger et kommercielt tilgængeligt billedsystem (se Materialetabel for at få flere oplysninger), men andre ormsporingssystemer kan give et lignende værktøj, hvor nogle er open source12. Tidligere offentliggjorte metoder beskriver manuel scoring af orm thrashing13. Mens den automatiserede analyse producerer en række målinger for hver enkelt orm, detektering af kroppen bøjninger, som måles i thrashes per minut, giver ensartede resultater mellem eksperimenter og spor godt med konventionelle scoring af orm thrashes af øjet.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker korrekturlæserne for nyttige kommentarer og forslag. Vi takker Aleen Saxton, Brandon Henderson og Jade Stair for fremragende teknisk assistance. Vi takker Brian Kraemer og Rebecca Kow for hjælp til at udvikle disse analyser. Dette materiale er resultatet af arbejde, der understøttes med ressourcer og brug af faciliteter på VA Puget Sound Health Care System. Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra USA (USA) Department of Veterans Affairs (VA) Biomedical Laboratory Research and Development Service [Merit Review Grant #I01BX004044 til N.F.L.]
C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | – | Aquire your strains as desired, N2 is a useful control strain |
Disposable pasteur pipets, borosilicate glass | VWR | 14673-010 | Glass pipet used to create worm pick – hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join. |
Disposable petri dishes, 35x10mm | VWR | 10799-192 | Assay plates for WormLab Imaging System |
Disposable petri dishes, 60x15mm | VWR | 25384-090 | Stock plates for worms |
Disposable petri dishes, 100x15mm | VWR | 25384-302 | Standard radial locomotion assay plate |
Disposable petri dishes, 150x15mm | VWR | 25384-326 | Longer time frame radial locomotion assay plate |
Dissecting microscope | Leica | M80 | Scope for maintaining worms and setting up radial locomotion assays |
Fine-tipped markers | VWR | 52877-810 | Need at least 2 colors for radial locomotion assays. Fine tips required for accuracy. |
Flatbed Scanner | Amazon | Epson Perfection V850 | Optional for radial locomotion assay. Protocol assumes a resolution of 300dpi, most scanners would work fine |
ImageJ | NIH | – | Optional free software provided by the NIH – https://imagej.nih.gov/ij/ |
M9 buffer | VWR | IC113037012 | Medium used for swimming assay. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans |
NGM (Nematode Growth Medium) | VWR | 76347-412 | Medium used to cultivate C. elegans. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans |
OP50 bacteria | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Primary food source for C. elegans |
p1000 pipettor | VWR | 76207-552 | Pipettor, used in swimming assay |
p1000 tips | VWR | 83007-384 | Tips for pipettor, used in swimming assay |
Platinum wire, 0.2032mm diameter | VWR | BT136585-5M | Fine gauge platinum wire used to create worm pick – hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join. |
Ruler | VWR | 56510-001 | Need to score radial locomotion assays |
WormLab Imaging System | MBF Bioscience | WormLab | The Imaging System includes WormLab hardware (bright field stage, camera, and housing) and WormLab software. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system |