Denne protokol præsenterer konstruktionen og brugen af et forenklet helkropsplethysmografiapparat til overvågning af bakteriel respiratorisk sygdomsprogression ikke-invasivt.
Surrogatdyrs sygdomsmodeller er underlagt 3R’erne for ansvarlig forskning. Der er en hyppig revision af forbedringer af dyremodeller for at sikre, at både dyrevelfærd og videnskabelig indsigt skrider frem med tilgængeligheden af nye teknologier. Denne artikel demonstrerer brugen af forenklet helkropsplethysmografi (sWBP) til ikke-invasivt at studere respirationssvigt i en model af dødelig respiratorisk melioidose. sWBP har følsomheden til at detektere vejrtrækning hos mus gennem hele sygdomsforløbet, hvilket gør det muligt at måle de døende associerede symptomer (bradypnø og hypopnø) og potentielt bruges til at udvikle humane endepunktskriterier.
Nogle af fordelene ved sWBP i forbindelse med luftvejssygdomme er, at værtsåndedrætsovervågning kommer tættest på enhver fysiologisk måling ved vurdering af dysfunktion af det primære inficerede væv, nemlig lungen. Ud over biologisk betydning er brugen af sWBP hurtig og ikke-invasiv, hvilket minimerer stress hos forsøgsdyr. Dette arbejde demonstrerer brugen af internt sWBP-apparat til overvågning af sygdom i løbet af respirationssvigt i murinemodellen af respiratorisk melioidose.
Respiratoriske bakterielle patogener er ofte forbundet med et inflammatorisk respons i lungen, der fører til lungepatologi 1,2. I den kliniske indstilling omfatter diagnose af lungebetændelse typisk dyrkningsteknikker fra sputum, blod-iltmætningsanalyse og røntgen af brystet. Disse teknikker kan oversættes til smådyrsinfektionsmodeller, men kun iltmætningsanalyse repræsenterer en hurtig realtidsanalyse hos mus for sygdommens sværhedsgrad. Iltmætningen i blodet (SpO2) blev tidligere undersøgt som en metode til at spore sygdomsprogression i respiratoriske sygdomsstudier; døende mus har imidlertid uventet høje SpO2-aflæsninger både i en Pseudomonas aeruginosa model3, som ikke er den forudsigelige eller døende sygdom, sandsynligvis fordi mus kan modulere deres fysiologiske aktivitet. Til dette formål blev diagnostiske niveauer af SpO2 hidtil ikke fundet for bakteriel luftvejssygdom hos mus.
Derfor undersøgte dette arbejde brugen af andre klinisk relevante metoder til at påvise lungesygdommens virkninger på lungefunktionen som en hurtig fysiologisk måling. Simplified Whole Body Plethysmography (sWBP) giver mulighed for at undersøge åndedrætshastighed og dybde som en hurtig, ikke-invasiv biometrisk analyse. Tidligere undersøgelser har vist, hvordan man samler WBP-apparater i et laboratorium4; Flere af de komponenter, der er vist i sådanne undersøgelser, er imidlertid ikke kommercielt tilgængelige i øjeblikket. Desuden kræver traditionel WBP kompleks dataindsamling og databehandling baseret på fugtighed og temperatur 5,6. Derfor blev det besluttet at udvikle et forenklet WBP-apparat, der kalibreres dagligt til stuetemperatur/fugtighed og vurdere, om selve forsøgspersonens temperatur/fugtighedsbidrag har nogen effekt på det målte åndedrætsvolumen. Således er der skabt et modificeret sWBP-apparat, der kilder de aktuelt tilgængelige materialer. Desuden er det blevet undersøgt, om dette laboratoriebaserede apparat kan detektere ændringer i vejrtrækning forbundet med sygdomsprogression under modellen for dødelig respiratorisk melioidose hos mus.
SWBP-apparatet, der blev konstrueret til dette arbejde, brugte kommercielt tilgængeligt udstyr og software til at behandle analoge tryksensordata til en digital udlæsning. Tryksensoren blev monteret på en lufttæt glasbeholder med skotstik. Fordelen ved en glasburk er materialets strukturelle stivhed, som vil modstå ændringer i krukkens indre tryk, hvilket påvirker målinger af volumenændringer under overvågningen af vejrtrækning. Prøveudtagningskammeret er konstrueret til at have to porte på de to flade overflader af den firkantede krukke, den ene for at få adgang til kammeret med et Luer-stik til kalibrering og den anden til at huse tryksensoren. Den valgte trykføler har en meget følsom målertryktransducer med et interval for små trykændringer (25 mbar rækkevidde).
Denne protokol er demonstreret ved hjælp af en murine model af respiratorisk melioidose. Burkholderia pseudomallei (Bp) er bakteriemidlet til melioidose – en sygdom forbundet med tropiske regioner i verden7. Bp findes i miljøet, specifikt i våde miljøer med stående vand og fugtig jord, hvorfra det typisk forårsager subkutane infektioner af nedskæringer / ridser af modtagelige værter. Bp er dog også smitsom ved indånding og er en potentiel trussel til brug i bioterrorisme ved aerosolspredning. Mens fuldt virulent Bp kræver håndtering i et BSL-3-laboratorium, blev der tidligere konstrueret en acapsular mutant stamme, som sikkert kan håndteres ved BSL-2 og udelukkes fra udvælgelsesmiddelkriterierne8. Endvidere er der udviklet en intubationsmedieret intratracheal (IMIT) infektionsmodel af respiratorisk melioidose til at studere respiratorisk sygdomsprogression på Bp 5,9. Vi har brugt denne infektionsmodel til at karakterisere den ændring i vejrtrækning, der opstår under sygdomsprogression gennem det døende endepunkt.
sWBP er en attraktiv tilgang til at øge forståelsen af luftvejsinfektion i smådyrsmodeller. Det er vigtigt, at det er en ikke-invasiv tilgang, og som sådan udgør det ikke en væsentlig risiko for at forårsage unødig stress for forsøgsdyr under en infektionsudfordring. Faktisk er proceduren for overvågning af forsøgsånding en hurtig test, der kræver flere minutter og minimal emnehåndtering. Den videnskabelige fordel er den højopløselige forståelse af, hvordan mikrobielle patogener påvirker lungefunktionen under sygdom. Denne tilgang vil være til gavn for grundforskningen, lette forståelsen af, hvordan et patogen forårsager sygdom, samt give et translationelt værktøj til at forstå, hvordan en ny terapeutisk genopretter en forskning, der er underlagt en respiratorisk sundhedstilstand.
I dette manuskript gives repræsentative resultater for patogenet B. pseudomallei, hvilket forårsager en tidlig sløv reaktion. Ikke alle bakterielle lungeinfektioner findes på samme måde i museinfektionsmodeller. Tidligere erfaringer med andre infektionsmodeller har vist, at bakteriepatogenet Klebsiella pneumoniae præsenterer sig som en asymptomatisk infektion indtil det punkt, hvor mus bukker under for infektion, også ca. dag 3 efter infektion11. Det antages, at værtsbehovet efter inspireret luft (dvs. minutvolumen) kan være tæt forbundet med graden af sløvhed, som en given sygdom præsenterer. Fremtidige undersøgelser vil være nødvendige for at undersøge, hvordan forskellige bakterielle patogener påvirker lungefunktionen under luftvejssygdomme. Det forstås, at forskellige patogener har unikke tilgange til at undgå værtsforsvar, herunder forskelle i, (1) tilbøjelighed til at være intracellulære eller ekstracellulære patogener, (2) evnen til at forårsage tidlig / sen hypotermisk respons og (3) brug af forskellige repertoirer af virulensdeterminanter 3,12,13. Derfor er det sandsynligt, at forskellige sygdomsstrategier vil resultere i unikke virkninger på lungefunktion og vejrtrækning under infektion.
De anbefalede indstillinger, der er beskrevet i denne protokol, kan ændres for at imødekomme unikke udfordringer, der er til stede under sWBP. Et af de almindelige problemer, der opleves under en sWBP-optagelsessession, er emnets bevægelse i prøvekammeret. Som nævnt ændrer denne bevægelse basislinjen og kan påvirke nøjagtigheden af vejrtrækningsmålinger. Et digitalt filter blev brugt til at normalisere den skiftende basislinje, hvilket muliggør levedygtige åndedrætsmålinger på trods af små bevægelser. Overdreven bevægelse kan skubbe en baselinemåling ud af området for et nulstillet input. Optagelser anbefales ved 1 mV-rækkevidde (kanal 1-indstilling), hvilket giver et kompromis med stadig at observere toppen af plethysmografien, samtidig med at man undgår tab af data uden for rækkevidde. For usædvanligt aktive forsøgspersoner kan det være nødvendigt at udvide optagelsesområdet >1 mV for at undgå vedvarende signaler uden for rækkevidde.
Den anbefalede procedure kræver daglig kalibrering (eller ved hver session) for at imødekomme udsving i luftfugtigheden/temperaturen. Traditionel WBP bruger komplekse beregninger, der tager højde for temperatur / fugtighed i både miljø og emne 5,6. Det er blevet påvist, at i det nuværende sWBP-apparat ændrer virkningerne af værtstemperaturen/fugtigheden ikke væsentligt den målte åndedrætsvolumen for en kalibreringskilde. Derfor adskiller denne tilgang i sWBP sig fundamentalt fra Drorbaughs og Fenns >50 år gamle tilgang. Her relaterer sWBP direkte trykændringer til et målt åndedrætsvolumen uden yderligere korrektion fra værten.
Det er vigtigt at kontrastere forskningsdyr WBP med klinisk WBP. De typer biometriske data, der blev forsøgt indsamlet af sWBP, er åndedrætsvolumen og frekvens. Sådanne målinger indsamles klinisk ved hjælp af simpelt spirometriudstyr, hvor en patient holder en åndedrætsmonitor for munden og trækker vejret normalt ind i en enhed, der overvåger luftstrømmen. Lignende spirometri hos forsøgsdyr kræver tilbageholdenhed og bidrager dermed til stress og en iboende forstyrrelse i vejrtrækningen. Derfor er simpel spirometri funktionel klinisk, men ikke for forsøgsdyr. WBP tjener et væsentligt formål i klinikken til at indsamle avancerede data, herunder sådanne målinger som resterende lungevolumen. Sådanne data kan kun indeholdes i forbindelse med, at et emne kan følge instruktioner om, hvordan de trækker vejret, herunder tvungen udløb (tømning af deres lunge ved en dyb udånding). Forsøgsdyr kan ikke stole på at følge vejrtrækningsinstruktioner fra en forsker. Mange af de avancerede målinger, der indsamles klinisk under WBP, kan ikke gengives i forsøgsdyr. WBP i forsøgsdyr er fundamentalt forskellig fra klinisk WBP. Animal WBP søger at indsamle enkle ventilationsdata (åndedrætshastighed og volumen) på en ikke-tilbageholdt måde for at undgå dyrestress og vejrtrækningsforstyrrelser. Indtil videre synes brugen af WBP i forsøgsdyr at replikere de teknikker, der anvendes i klinisk WBP, herunder komplekse beregninger baseret på miljø og emne temperatur og fugtighed, men uden evnen til at indsamle de avancerede data fra et emne, der kan følge instruktioner om, hvordan man udfører en tvungen udløb. Med dette i tankerne blev det søgt at demonstrere, om en forenklet version af WBP ville være tilstrækkelig til at indsamle den relevante vejrtrækningsfrekvens og volumen, der er relevant for respiratoriske sygdomsundersøgelser. Der blev anvendt en kalibreringssession, som kompenserede for enhver variation i miljøtemperatur og fugtighed. Desuden blev det demonstreret med en kunstig mus, at udsættelse af temperatur og fugtighed til et målt åndedrætsvolumen ikke har nogen signifikant effekt på nøjagtig måling af åndedrætsvolumen. Det blev konkluderet, at sWBP har fremragende anvendelse til dyreforsøg uden brugerens krav om at anvende besværlig matematisk behandling af data.
The authors have nothing to disclose.
Disse undersøgelser blev støttet af National Institutes of Health COBRE-bevilling P20GM125504-01 Delprojekt 8246.
1/8" NPT Luer adaptor | Amazon | B07DH9MY8W | Calibration port |
1/8" NPT to 1/4" NPT adaptor | Amazon | B07T6CR6FS | Bulkhead to luer adaptor |
150 kohm resistor | Amazon | B07GPRYL81 | Pressure transducer excitation voltage selection |
3/4" diamond drill bit | Drilax | DRILAX100425 | To drill bulkhead mounts in glass jar |
Bridge Amp | AD Instruments | FE221 | One channel option |
Bulkhead fitting | Legines | 3000L-B | 1/4" NPT, 3/4-16 UNF brass bulkhead coupling |
Chaney adaptor | Hamilton | 14725 | Gas tight syringe adaptor for set volume |
DIN connector | AD Instruments | SP0104 | To connect pressure sensor to Bridge Amp |
Gastight syringe, 25 uL | Hamilton | 80201 | Calibration syringe |
LabChart | AD Instruments | Life Science Data Acquisition Software | |
Luer plug | Cole Parmer | 45513-56 | Calibration port closure |
PowerLab 4/26 | AD Instruments | PL2604 | Digital interface to computer |
Pressure transducer | Omega Engineering | PX409-10WGV | High accuracy oil filed gage pressure sensor |
Rubber gasket | Amazon | B07LH4C8LS | To mount bulkheads (4 required per chamber) |
Square glass jar | Amazon | B07VNSPR8P | 600 ml with 95 mm silicone gasket |