Denne protokollen presenterer trinn for å skaffe og analysere fluorescerende kalsiumbilder fra hjernen som omkranser pericytter og blodstrømsdata fra nærliggende blodkar i bedøvede mus. Disse teknikkene er nyttige for studier av veggmalericellefysiologi og kan tilpasses for å undersøke kalsiumtransienter i enhver celletype.
Nylige fremskritt innen proteinbiologi og musegenetikk har gjort det mulig å måle intracellulære kalsiumsvingninger i hjerneceller in vivo og å korrelere dette med lokal hemodynamikk. Denne protokollen bruker transgene mus som er utarbeidet med et kronisk kranialvindu og uttrykker den genetisk kodede kalsiumindikatoren, RCaMP1.07, under den α glatte muskel actin-promotoren for å spesifikt merke veggmalericeller, for eksempel vaskulære glatte muskelceller og omsluttende pericytter. Trinn er skissert om hvordan du lager et hale venekateter for intravenøs injeksjon av fluorescerende fargestoffer for å spore blodstrømmen, samt hvordan du måler hjernen pericyte kalsium og lokale blodkar hemodynamikk (diameter, rød blodcellehastighet, etc.) av to fotonmikroskopi in vivo gjennom kranialvinduet i ketamin / xylazine bedøvede mus. Til slutt er det gitt detaljer for analyse av kalsiumsvingninger og blodstrømsfilmer via bildebehandlingsalgoritmene utviklet av Barrett et al. 2018, med vekt på hvordan disse prosessene kan tilpasses andre cellulære bildedata.
Sentralnervesystemets vaskulatur består av gjennomtrengende arterioler, kapillærer og stigende venules. Innenfor dette nettverket utvider veggmalericeller som vaskulære glatte muskelceller arterioler og pericytter cellulære prosesser langs de første arteriole grenene og kapillærene1. Pericytter ser ut til å ha flere roller i hjernen, inkludert vedlikehold av blod-hjerne-barrieren1,2, migrasjon og motilitet3, potensielle stamcelleegenskaper og regulering av hjerneblodstrømmen4,5,6. Mange av pericytes funksjonelle roller har vært knyttet til svingninger i intracellulært kalsium som kan regulere utvidelse eller sammentrekning av disse cellene4,5,6.
Flere nyere studier har satt kriterier for å identifisere ulike typer hjernepericytter7,8. Veggmalericeller i de første 4 grenene av gjennomtrengende arterioler er omsluttende pericytter basert på deres uttrykk for det kontraktile proteinet α glatt muskel actin (αSMA) og deres fremspringende, ovoid somata med prosesser som vikler seg rundt kar7,8,9. For å visualisere kalsiumsvingninger i omsluttende pericytter, bruker denne protokollen en ny transgen muselinje, Acta2-RCaMP1.07, også kjent som Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J10. Disse musene uttrykker den røde genetisk kodede kalsiumindikatoren, RCaMP1.07, i αSMA som uttrykker celler (vaskulære glatte muskelceller og ensheathing pericytes). Avlskolonier opprettholdes ved å krysse ikke-carrier dyr med hemizygoter. RCaMP1.07 er et rødt fluorescerende protein med et calmodulinbindingsdomene, noe som øker fluorescensen ved binding til det intracellulærekalsiumet 10,11. Denne protokollen skisserer trinnene for kombinert kalsiumavbildning av omsluttende pericytter og blodstrømsmålinger av to fotonmikroskopi, inkludert prosedyrer for haleveneinjeksjon av fluorescerende fargestoffer, oppkjøp av mikroskopbilder i bedøvede mus og dataanalyse med programmeringsplattformer (figur 1). Disse teknikkene er nyttige for å ta opp spørsmål om veggmalericellefysiologi, men kan tilpasses for å studere kalsiumtransienter i enhver celletype i hjernen eller et annet organsystem.
En 10 måneder gammel kvinnelig Acta2-RCaMP1.07-mus ble brukt til eksperimentet som presenteres i denne artikkelen. Musen gjennomgikk kirurgi for kronisk kranialvindu og hodepostimplantasjon to måneder før. Detaljer for den kirurgiske protokollen er diskutert i tidligere studier12,13 og lignende prosedyrer har blitt utført i andre tidligere publiserte protokoller14,15. Vaskulaturen er merket med grønn fluorescein-Dextran (70 000 MW, anionisk oppløsning, 2,5% m/v) injisert intravenøst. Dette fargestoffet er kostnadseffektivt og lett tilgjengelig fra kommersielle kilder, men det har et bredere utslippsspekter som kan overlappe med RCaMP-utslipp og blø gjennom under oppkjøp av mikroskopbilder. Trinn for spektral unmixing er skissert i avsnitt 4 nedenfor for å omgå dette, men andre grønne fargestoffer med smalere utslippsspektra, som de som er basert på EGFP, kan også brukes.
Den nåværende metoden gir detaljer om mus hale vene injeksjon med et kateter, to-foton mikroskop bildeoppkjøp for dybde stabler, celle kalsium signalfilmer, opprettelse av hemodynamiske kymografier, og kalsium og hemodynamisk analyse med våre bildebehandlingsalgoritmer17 (Figur 1). Det er flere fordeler med disse teknikkene som forbedrer in vivo-bildebehandlingsresultatet og reduserer tid, ressurser og dyrestress i løpet av økten. For det første gir bruk av et kateter for hale veneinjeksjon mer kontroll over nålen, sprøyten og mengden stoff som injiseres i musens sirkulasjon. I tillegg forhindrer det fargeinjeksjon i halevevet, og sparer dyre reagenser. For det andre bruker vi transgene mus som uttrykker genetisk kodede kalsiumsensorer i å omslutte pericytter og demonstrere hvordan man lokaliserer dem i hjernens vaskulære nettverk med en dybde z-stack, noe som letter celleidentifikasjon og flytting i påfølgende bildebehandlingsøkter på lang sikt. Dette er en viktig faktor i pericyte studier og sikrer riktig celleklassifisering6,7. For det tredje gir vi våre parametere for innsamling av kalsiumfilmer og hemodynamiske linjeskanningsdata som er et godt utgangspunkt for måling av dynamiske cellulære signaler. Til slutt presenterer vi våre bildebehandlingsalgoritmer17, en omfattende verktøykasse for bildebehandling som inneholder flere tilnærminger for forhåndsbehandling av bilder (for eksempel spektral unmixing), kalsiumbildeanalyse og hemodynamisk analyse (diameter, hastighet, etc.). Disse algoritmene kan generere plott for en rask og enkel visualisering av dataene, samtidig som nivået på brukerkompetansen som kreves for å analysere resultatene, minimeres. Videre kan den automatiseres med noen få kodelinjer for raskt å batchbehandle flere datasett med de samme parametrene. Dette kan potensielt forbedre datavisualiseringen og tidsinvesteringen til forskeren.
Nøkkelen til å samle inn gode kalsiumavbildningsdata er å justere lasereffekten og PMT-innstillingene for klar fluorescenssignalinnsamling, men også å samle inn data med tilstrekkelig bildefrekvens for å fange opp hele kalsiumhendelsen. Dataene i denne protokollen ble samlet inn med 10-11 bilder per sekund, noe som fanger opp de langsommere kalsiumoscillasjonene i omsluttende pericytter. Det er også flere trinn under analysen som kan forbedre analyseresultatet. For det første er spektral unmixing gunstig hvis det er betydelig overlapping mellom utslippsspektraet av fluoroforer (figur 2). Fluorescein-dextran ble brukt i denne protokollen fordi det er en kostnadseffektiv og kommersielt tilgjengelig dextran konjugat som ofte brukes til hemodynamiskemålinger 5. Spektral unmixing bidrar til å rydde opp i dataene for forbedret deteksjon av kalsiumsignaler, men alternative fluoroforer med smalere utslippsspektra kan også brukes. For det andre er håndvalg av cellulære strukturer som ROIer (figur 3) nyttig for klassifisering av kalsiumhendelser i forskjellige sub-cellulære regioner, for eksempel soma- eller prosessgrenene. Aktivitetsbasert avkastningsvalg (figur 4)16 gir mer romlig og tidsmessig informasjon om individuelle kalsiumhendelser. Dette kan være nyttig når du bestemmer frekvensen av kalsiumhendelser i et gitt område eller forplantning av hendelser til andre cellulære områder. Bruk av programmeringsprogramvare for å analysere bildedata kan spare forskere for timer når data batchbehandles, men det krever noen innledende tidsinvesteringer for å justere parametrene for optimale resultater. De viktigste faktorene er forventet størrelse (i μm2) i den aktive regionen, samt varigheten av signalet (minimum signaltid og maksimal signaltid må defineres). Forskere må først undersøke noen eksempelfilmer i T-serien for å finne ut hvilke parametere som passer til dataene deres. Til slutt kan data av dårlig kvalitet som er samlet inn på mikroskopet i stor grad hindre analysen av kalsium og hemodynamikk (figur 6). Derfor bør det tas hensyn til å optimalisere mikroskopets oppkjøpsinnstillinger i begynnelsen. Med disse faktorene i tankene, denne protokollen som kan tilpasses for å passe kalsiumavbildning eller analyse av andre dynamiske cellulære signaler (f.eks. fluorescerende natrium, kalium, metabolitt eller spenningssvingninger) i andre vev eller celletyper.
Det er flere begrensninger i denne protokollen. For det første samles dataene inn under anestesi, noe som påvirker hjerneaktiviteten og kan påvirke blodstrømmen. Lignende avbildning kan gjøres i våken mus som er opplært til å akseptere hodefiksering for mer fysiologiske resultater. I tillegg er det viktig å huske at vi samler 2-dimensjonale bilder av en 3-dimensjonal celle og blodkar in vivo. Derfor kan vi bare fange en fraksjon av kalsiumhendelsene i disse cellene eller blodstrømmen i en enkelt del av blodkaret om gangen.
En annen begrensning å merke seg er at to-foton kalsiumavbildning er følsom for bevegelsesartefakter, hvor bevegelse inn og ut av fokusplanet kan forveksles med kalsiumsvingninger. Denne protokollen ble utført under anestesi, noe som begrenser bevegelsen av dyret; Imidlertid kan bevegelsesartefakter innføres av musens pustehastighet, hjertefrekvens, mulig vevs hevelse, og i tilfelle av ensheathing pericytter, karkontraksjon eller vasomotion 4,6,18,19. Bevegelsesartefakter kan reduseres av flere strategier. Bildebehandlingspakkene som brukes i denne protokollen, inkluderer et valgfritt trinn for bevegelseskorrigering, som bruker en 2D-konvolusjonsmotor til å justere bildene i T-serien basert på den synlige vaskulaturen13,17. Rammer med betydelige endringer i fokusplanet identifiseres av denne algoritmen og kan utelukkes fra analyse. I tillegg er det mulig å bruke statistiske strategier i bildebehandlingspakkene, for eksempel en Z-skår når du genererer fluorescenssporene for å normalisere bevegelsen induserte kalsiumsvingninger20. Den mest robuste tilnærmingen til å gjøre rede for bevegelsesartefakter i tofotoavbildning er å kombinere uttrykk for to fluorescerende indikatorer i samme celle, for eksempel en kalsiumindikator (f.eks. GCaMP) og en fluorescerende reporter (f.eks. mCherry) som er kalsiumuavhengig. Svingninger i fluorescerende reporter kan deretter tilskrives bevegelse og trekkes fra kalsiumindikatorsignalet for å normalisere bevegelsesartefakter.
Formålet med denne protokollen er å gi en klar forståelse av hvordan man samler inn optimal kalsiumavbildning og blodstrømsdata in vivo og presenterer nye metoder og analyseverktøy som forskere kan implementere for å forbedre resultatene. Disse teknikkene kan brukes til å studere rollen til forskjellige pericytterpopulasjoner i blodstrømskontroll eller i forskjellige hjernesykdomstilstander. Disse bildeparameterne kan også brukes til å studere kalsium og blodstrøm i andre celletyper og organsystemer, og lignende prinsipper gjelder for andre dynamiske avbildningsteknikker som er muliggjort av andre genetisk kodede sensorer, utover kalsium.
The authors have nothing to disclose.
J. Meza støttes av stipendiater fra Mitacs og Research Manitoba. Støtten til dette arbeidet ble gitt av Canadian Institutes for Health Research, Research Manitoba, Manitoba Medical Service Foundation, oppstartsfinansiering fra University of Manitoba og Brain Canada gjennom Canada Brain Research Fund, med økonomisk støtte fra Health Canada og Azrieli Foundation. Synspunktene som uttrykkes her, representerer ikke nødvendigvis synspunktene til helseministeren eller regjeringen i Canada.
Acta2-RCaMP1.07 | The Jackson Laboratory | 28345 | In the video protocol the animal model used is a female mouse of 10 months, 1 day old. |
Applicators (Regular) | Bisco | X-80250P | |
BioFormats package for MATLAB | NA | NA | Denominated in this protocol as "image processing packages". Available in: https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/ |
CHIPS MATLAB toolbox | NA | NA | Denomitaded in this protocol as "image processing algorithms". Barrett MJP, Ferrari KD, Stobart JL, Holub M, Weber B. CHIPS: an Extensible Toolbox for Cellular and Hemodynamic Two-Photon Image Analysis. Neuroinformatics. 2018;16(1):145-147. doi:10.1007/s12021-017-9344-y. Available in: https://github.com/EIN-lab/CHIPS |
Clear Ultrasound Gel, Medium viscosity | HealthCare Plus | UGC250 | |
Dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
Dextran, Texas Red, 70,000 MW, neutral | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
Eye Lube Plus | Optixcare | NA | |
FIJI | Image J | NA | Denominated in this protocol as "image processor software". Available in: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
GCaMP6sfl/fl | The Jackson Laboratory | ||
Head Post fixing platform | University of Zurich | NA | |
Ketamine (Narketan 100 mg/mL) | Vetoquinol | 440893 | |
MATLAB R2020b | NA | Denominated in this protocol as "programming platform ". Available in: https://www.mathworks.com/downloads/ | |
Needle 0.3mmx25mm | BD PrecisionGlide | 305128 | |
Objective XLUMPLFLN20XW | Olympus | NA | https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/lumplfln-w/ |
PDGFRβ-CreERT2 | The Jackson Laboratory | 30201 | |
Polyethylene Tubing, PE10 I.D. 28mm (0.11”) O.D. 61mm (.024”) | BD Intramedic | 427401 | |
Prairie View | Bruker Fluorescence Microscopy | NA | https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html |
Ultima In Vitro Multiphoton Microscope | Bruker Fluorescence Microscopy | NA | https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html |
Under Tank Heater | Reptitherm U.T.H | E169064 | |
Xylazine (Rompun 20 mg/mL) | Bayer HealthCare | 2169592 |