Etablering av en elektrofysiologisk plattform för modellering av ALS med regionalt specifika humana pluripotenta stamcellshärledda astrocyter och neuroner
Summary
Vi beskriver en metod för att differentiera ryggmärgsinducerade pluripotenta härledda astrocyter och neuroner och deras samkultur för elektrofysiologisk registrering.
Abstract
Humana pluripotenta stamcellshärledda astrocyter (hiPSC-A) och neuroner (hiPSC-N) ger ett kraftfullt verktyg för modellering av amyotrofisk lateral skleros (ALS) patofysiologi in vitro. Multi-electrode array (MEA) inspelningar är ett sätt att registrera elektriska fältpotentialer från stora populationer av neuroner och analysera nätverksaktivitet över tiden. Det har tidigare visats att närvaron av hiPSC-A som differentieras med hjälp av tekniker för att främja en ryggmärgs astrocytfenotyp förbättrade mognad och elektrofysiologisk aktivitet hos regionalt specifika ryggmärgs hiPSC-motorneuroner (MN) jämfört med de som odlades utan hiPSC-A eller i närvaro av gnagarastrocyter. Här beskrivs en metod för att samodla ryggmärgen hiPSC-A med hiPSC-MN och registrera elektrofysiologisk aktivitet med hjälp av MEA-inspelningar. Medan differentieringsprotokollen som beskrivs här är specifika för astrocyter och neuroner som är regionalt specifika för ryggmärgen, kan samodlingsplattformen tillämpas på astrocyter och neuroner differentierade med tekniker som är specifika för andra öden, inklusive kortikala hiPSC-A och hiPSC-N. Dessa protokoll syftar till att tillhandahålla en elektrofysiologisk analys för att informera om glia-neuroninteraktioner och tillhandahålla en plattform för att testa läkemedel med terapeutisk potential vid ALS.
Introduction
Humana pluripotenta stamcellshärledda astrocyter (hiPSC-A) och neuroner (hiPSC-N) är kraftfulla verktyg för modellering av patofysiologi för amyotrofisk lateral skleros (ALS) in vitro och ger ett translationellt paradigm för strategier för läkemedelsupptäckt1. Forskare har visat att samkulturen av hiPSC-A med hiPSC-N förbättrar den morfologiska, molekylära, elektrofysiologiska och farmakologiska mognaden av båda celltyperna, vilket genererar komplexa neuronala nätverk och astrocyt-neuroninteraktioner som liknar deras in vivo-motsvarigheter 2,3. Liknande samodlingsexperiment kan rekapitulera kännetecken för ALS-patobiologi såsom astrocytmedierad neurotoxicitet 4,5 och neuronal hyperexcitabilitet6. Dessutom, med framsteg i differentieringsprotokoll, kan humant inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) differentieras till regionalt specifika neurala subtyper, inklusive kortikala och ryggmärgs hiPSC-A och hiPSC-N 7,8. Dessa strategier ger potential för modellering av kortikal och spinal motorneuronpatologi vid ALS såväl som det astrocytiska inflytandet på båda. Detta kräver dock att det finns en reproducerbar funktionell analys för att bestämma dessa effekter.
Nyligen visades att multielektrodmatris (MEA) inspelning är särskilt lämplig för elektrofysiologisk karakterisering av neuron-astrocyt-samkulturer2. I motsats till encelliga elektrofysiologiska analyser registrerar dessa elektroduppsättningar med hög densitet passivt extracellulära fältpotentialer från stora populationer av neuroner utan att störa odlingsförhållandena och bevara cellmembranens integritet. Dessa plattformar är särskilt användbara för att registrera kulturernas cellulära och nätverksaktivitet över tid och som svar på farmakologisk manipulation. Slutligen, när närvaron av astrocyter är en kulturvariabel, kan MEA-inspelningar ge funktionella insikter i dubbelriktade interaktioner mellan astrocyt-neuron 2,9.
Här presenteras ett optimerat protokoll för differentiering av hiPSC till ryggmärgs hiPSC-A och hiPSC-motorneuroner (MN) som tidigare har validerats2. Ryggmärgs hiPSC-A-differentieringsprotokoll resulterar konsekvent i astrocytkulturer, som är positiva för S100 kalciumbindande protein B (S100β), glialt fibrillärt surt protein (GFAP) och Homeobox B4 (HOXB4) i upp till 80%, 50% respektive 90% av cellerna, vilket indikerar en mognad glial och ryggmärgsspecifikation 2,10 . HiPSC-MN-differentieringsprotokollet genererar neuroner som är >90% positiva för kolinacetyltransferas (ChAT), vilket tyder på en mogen alfa-motorisk neuronidentitet2. Dessutom beskriver protokollet tekniker för generering av hiPSC-A/MN-samkulturer som tidigare visat sig resultera i neuroner med förbättrad morfologisk komplexitet genom Scholl-analys och immunofluorescerande mikroskopi jämfört med neuronala kulturer utan astrocyter eller med gnagarastrocyter2. Även om dessa beskrivningar är specifika för ryggmärgs hiPSC-A och hiPSC-N, är en unik fördel att den initiala oberoende kulturen av astrocyter och neuroner följt av steg till samodling vid senare tidpunkter kan översättas för att studera effekterna av neuron-astrocytinteraktioner från andra specifika regioner såväl som sjukdomsspecifika celler 7,8 . Slutligen beskriver protokollet hur man odlar dessa kulturer på MEA-plattor så att funktionell aktivitet som en faktor för samkulturkomposition kan studeras över tid med förmågan att manipulera cellulär sammansättning såväl som odlingsförhållanden.
Målet med dessa protokoll är att tillhandahålla en funktionell analys för att undersöka astrocyt-neuroninteraktioner, undersöka sjukdomsspecifika förändringar och testa läkemedel med terapeutisk potential inom ALS-området. Videoinstruktioner tillhandahålls för de mest utmanande stegen i detta protokoll.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hittills har hiPSC- och MEA-baserade metoder för elektrofysiologiska registreringar av astrocyt-neuron-samkulturer funnit begränsad tillämpning inom ALS6-området och fortfarande inte i helt mänskliga plattformar, i motsats till deras mer utbredda användning för in vitro-modellering av epilepsi9. Denna plattform har dock potential att ta itu med patofysiologiskt relevanta frågor i ALS-forskning, såsom mekanismerna för neuronal hyperexcitabilitet, astrocytb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta manuskript stöddes av följande: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH/NINDS (CWH), 2020 Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Career Development Award (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). Vi tackar Dr. Raha Dastgheyb och Dr. Norman Haughey för att ha tillhandahållit MEA-plattformen och dataanalysprogramvaran som vi har använt för att validera den beskrivna elektrofysiologiska plattformen. Vi vill tacka Khalil Rust för deras hjälp med protokolldemonstration och filmning.
Materials
| 10 cm sterile culture plates | Falcon | 353003 | |
| 25 cm2 sterile culture flasks | Falcon | 353136 | |
| 2-Mercaptoethanol (β-ME) | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 110 µM |
| 500 mL 0.2 µm CA Filter System | Corning | 430769 | |
| 5 mL pipette | Falcon | 357543 | |
| 6 well sterile culture plates | Falcon | 3046 | |
| Amphotericine B | Gibco | 15290018 | Working concentration 2.0 μg/mL |
| Anionic detergent with protease enzyme – Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Working concentration 1% m/v |
| Ascorbic acid (ASAC) | Sigma | A4403 | Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL). |
| Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W) | Axion | OPT-24 | |
| Axion Edge MEA platform | Axion | Maestro Edge | |
| Basement Membrane matrix – Matrigel | Corning | 354277 | Details in the protocol |
| Benchtop microscope (sterile under cell culture hood) | Zeiss | 415510-1100-000 | Primo Vert |
| Bicuculline | Sigma Aldrich | 14340 | Working concentration10 μM |
| Ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| CO2 tanks and regulator for Axion Edge | AirGas/Harris | 9296NC | |
| Compound E | Abcam | ab142164 | Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM). |
| Cyanquixaline (CNQX) | Sigma Aldrich | C239 | Working concentration 50 μM |
| Dihydrokainic acid (DHK) | Tocris | 111 | Working concentration 50 μM and 300 μM |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 113300 | Working concentration 1x |
| Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement | Thermofisher | A1517001 | Combine 10 mL of Essential 8 (10x) supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermofisher | 16140071 | Working concentration 1x |
| Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) | Peprotech | 450-10 | Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Hemocytometer | Election Microscopy Sciences | 63510-20 | |
| Heparin | Millipore-sigma | H3149-100KU | Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL). |
| Humidity controlled Cell culture incubator | ThermoFisher | 370 | set to 37 ºC, 5 % CO2 |
| Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) | R&D systems | 291-G1-200 | Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Kainc acid | Abcam | ab144490 | Working concentration 5 μM |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Thermofisher | 10828 | Working concentration 1x |
| Laminin | Thermofisher | 23017-015 | Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media) |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution |
| L-Glutamine | Thermofisher | 25030 | Working concentration 100x |
| MEA glass plates | MultiChannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti-gr | |
| Multichannel Pipet P200 | Gilson | PJ22224 | |
| Neurobasal | Thermofisher | 21103049 | Working concentration 1x |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermofisher | 11140050 | Working concentration 100x |
| Pencillin/Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | Working concentration 100x |
| Polyornithine (PLO) | Sigma-Aldrich | P3655 | Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL) |
| Potassium chloride (KCl) | NA | NA | Working concentration100 mM |
| Purmorphamine (PMN) | Millipore-Sigma | 540223 | Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM). |
| Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM). |
| ROCK-I nhibitor | Peprotech | 1293823 | Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM). |
| SB431542 | Sigma | S4317 | Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM) |
| Sterile cell culture hoods | Baker Company | SG-600 | |
| Supplement B – B27 Supplement | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 50x |
| Supplement N – N2 Supplement | Thermofisher | 17502048 | Working concentration 100x |
| Table top cell culture centrifuge | ThermoFisher | 75004261 | Sorvall Legend X1R |
| Thermoplastic film – Parafilm | PARAFILM | P7793 | |
| Tissue dissociation protease – Dispase | StemCell Technologies | 7923 | Working concentration 1x |
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL). |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher | 2530054 | Working concentration 1x |
| Waterbath | ThermoFisher | 2332 | Isotemp |
References
- Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets. Neuroscience Letters. 755, 135911 (2021).
- Taga, A., et al. Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system. Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).
- Klapper, S. D., et al. Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks. Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).
- Zhao, C., et al. Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology. Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).
- Almad, A. A., et al. Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).
- Wainger, B. J., et al. Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons. Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).
- Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders. Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).
- Imaizumi, K., et al. Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).
- Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system. Scientific Reports. 8 (1), 10416 (2018).
- Haidet-Phillips, A. M., et al. Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment. Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).
- Roybon, L., et al. Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes. Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).
- Shimojo, D., et al. simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
- Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).
- Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
- Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
- Liu, H., Zhang, S. C. Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).
- Borghese, L., et al. Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo. Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).
