ड्यूल-फ्लोरोफोर रेशियोमेट्रिक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पीएच, रेडॉक्स रसायन और मैक्रोपिनोसोम की डिग्रेडिव क्षमता को मापना
Summary
हम जीवित कोशिकाओं में व्यक्तिगत मैक्रोपिनोसोम्स में पीएच, ऑक्सीडेटिव घटनाओं और प्रोटीन पाचन को मापने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। दोहरी फ्लोरोफोर रेशियोमेट्रिक माइक्रोस्कोपी और जनसंख्या आधारित तकनीकों पर यह लाभ प्रदान करने पर जोर दिया जाता है।
Abstract
हाल के वर्षों में मैक्रोपिनोसाइटोसिस का क्षेत्र तेजी से बढ़ा है । मैक्रोपिनोसाइटोसिस एक केंद्रीय तंत्र के रूप में उभरा है जिसके द्वारा जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाएं संगठित होमोस्टेसिस और प्रतिरक्षा को बनाए रखते हैं। साथ ही, और इसकी होम्योस्टेटिक भूमिका के विपरीत, यह कैंसर और वायरल संक्रमण सहित विभिन्न विकृतियों को भी चला सकता है। एंडोसाइटोसिस के अन्य साधनों के विपरीत, मैक्रोपिनोसोम्स की परिपक्वता का अध्ययन करने के लिए विकसित उपकरण अविकसित रहते हैं। यहां प्रोटोकॉल जल्दी और परिपक्व मैक्रोपिनोसोम के ल्यूमेन के भीतर रेडॉक्स वातावरण का अध्ययन करने के लिए नए विकसित उपकरणों का वर्णन करता है। पीएच का आकलन करने में अनुपातमेट्रिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के तरीके, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का उत्पादन, और जीवित कोशिकाओं में व्यक्तिगत मैक्रोपिनोसोम के ल्यूमेन के भीतर डिग्रेडिव क्षमता का वर्णन किया गया है। एकल ऑर्गेनेल माप स्पिटियोटेम्परल विषमता का खुलासा करने का लाभ प्रदान करते हैं, जो अक्सर जनसंख्या आधारित दृष्टिकोणों के साथ खो जाता है। दोहरी फ्लोरोफोर रेशियोमेट्रिक माइक्रोस्कोपी के बुनियादी सिद्धांतों पर जोर दिया जाता है, जिसमें जांच चयन, इंस्ट्रूमेंटेशन, अंशांकन और एकल-कोशिका बनाम जनसंख्या आधारित तरीके शामिल हैं ।
Introduction
मैक्रोपिनोसाइटोसिस झिल्ली से बंधे साइटोप्लाज्मिक ऑर्गेनेल्स में बड़ी मात्रा में एक्स्ट्रासेलुलर तरल पदार्थ को तेज करने को संदर्भित करता है जिसे मैक्रोपिनोसोम्स1,2 कहाजाताहै । यह एक अत्यधिक संरक्षित प्रक्रिया है जो मुक्त रहने वाले एककोशिकीय जीवों द्वारा की जाती है, जैसे कि अमीबा डिक्टियोस्टेलियम स्प्प। 3, साथ ही एंथोज़ोन्स4 और मेटाज़ोन्स2. अधिकांश कोशिकाओं में, मैक्रोपिनोसाइटोसिस एक प्रेरित घटना है। सेल-सरफेस रिसेप्टर्स का लिगेशन ऐक्टिन-चालित प्लाज्मा झिल्ली एक्सटेंशन के फलाव को प्रेरित करता है जिसे रफल्स के रूप में संदर्भित किया जाता है। उन रफल्स का एक अंश, कुछ खराब समझ तंत्र द्वारा, मैक्रोपिनोसोम बनाने के लिए उनके डिस्टल टिप्स पर मुहर (हालांकि इस विधियों के दायरे से बाहर, मैक्रोपिनोसाइटोसिस के यांत्रिकी पर विस्तृत समीक्षा के लिए, कृपया संदर्भ1, 2,5,6,7)का उल्लेख करें। मैक्रोपिनोसाइटोसिस को प्रेरित करने वाला बाह्य कोशिकीय उत्तेजना अक्सर घुलनशील विकास कारक5,8है। तदनुसार, मैक्रोपिनोसाइटिक इवेंट एक्सट्रासेलुलर सामग्री के बोलस के घूस के लिए अनुमति देता है जिसमें से कोशिका विकास को सुविधाजनक बनाने के लिए उपयोगी मेटाबोलाइट्स प्राप्त कर सकती है। दुर्भाग्य से, पोषक तत्व वितरण के लिए यह मार्ग पैथोलॉजी भी चला सकता है। कुछ कैंसर कोशिकाएं उत्परिवर्तनों को आश्रय देती हैं जिसके परिणामस्वरूप निरंतर या संविलियन मैक्रोपिनोसाइटोसिस होता है। पोषक तत्वों के निरंतर वितरण से कैंसर कोशिकाओं के अनियंत्रित प्रसार को सुविधाजनक बनाया जा सकता है और इसे विशेष रूप से आक्रामक ट्यूमर 9 ,10,11,12,13से जोड़ा गया है . इसी तरह, वायरस मैक्रोपिनोसाइटोसिस को होस्ट कोशिकाओं तक पहुंच प्राप्त करने के लिए प्रेरित कर सकते हैं, जिससे वायरल पैथोलॉजी14ड्राइविंग हो सकती है।
मैक्रोपिनोसाइटोसिस रोगजनकों के लिए प्रतिरक्षा के रखरखाव में भी कार्य करता है। मैक्रोफेज और डेंड्रिटिक कोशिकाएं कुछ जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाएं मैक्रोपिनोसाइटोसिस 6,15 ,16के माध्यम से बाह्य कोशिकाओं के संविलियन और आक्रामक नमूने में संलग्न हैं । मैक्रोपिनोसाइटोसिस का यह तरीका अविश्वसनीय रूप से सक्रिय है, और एक एकल डेंड्रिटिक सेल हर घंटे17अपने वजन के बराबर बाह्य तरल पदार्थ की मात्रा के साथ खुद को engorge कर सकता है। इस संविलियन नमूने के बावजूद, मैक्रोफेज और डेंड्रिटिक कोशिकाएं ट्यूमर कोशिकाओं के रूप में बेकाबू रूप से दोहराने नहीं देती हैं, इसके बजाय, वे अतिरिक्त स्तरीय सामग्री को इस तरह से संसाधित करने लगते हैं कि संभावित खतरों की उपस्थिति, या वास्तव में अनुपस्थिति पर सूचित करने के लिए जानकारी निकाली जा सकती है। सूचना को रोगजनक से जुड़े आणविक पैटर्न के रूप में निकाला जाता है जिसे इंट्रासेलुलर रोगजनक मान्यता रिसेप्टर्स द्वारा पढ़ा जा सकता है और ii) अमीनो एसिड के छोटे हिस्सों को अनुकूली प्रतिरक्षाप्रणाली16, 18,19की कोशिकाओं द्वारा स्क्रीनिंग के लिए प्रमुख हिस्टोकंपैटिबिलिटी अणुओं पर लोड किया जा सकता है। क्या रोगजनकों प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा सूचना प्रसंस्करण के लिए इस मार्ग विकृत वर्तमान में अस्पष्ट है ।
प्रतिरक्षा और होमोस्टेसिस के रखरखाव और एंडोसाइटोसिस के अन्य अधिक सामान्य रूप से अध्ययन किए गए तरीकों के विपरीत, मैक्रोपिनोसोस के आंतरिक (चमकदार) कामकाज के बारे में जाना जाता है। मैक्रोपिनोसोम्स के ल्यूमिनल बायोकेमिस्ट्री का अध्ययन करने के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल और उपकरण विकसित करने से न केवल हमें उनके अद्वितीय जीव विज्ञान को बेहतर ढंग से समझने में मदद मिलेगी बल्कि यह अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा जिसे दवा वितरण20सहित उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों के लिए लीवरेज किया जा सकता है। यह विधि पांडुलिपि हाल ही में विकसित उपकरणों पर ध्यान केंद्रित करेगी, एकल ऑर्गेनेल स्तर पर, मैक्रोपिनोसोम्स के ल्यूमिनल बायोकेमिस्ट्री के विभिन्न पहलुओं को विच्छेदन करने के लिए।
फ्लोरोफोरेस का उपयोग ऑर्गेनेल्स के विशिष्ट जैव रसायनों को मापने के लिए किया जा सकता है यदि मैं) वे ब्याज के डिब्बे में अधिमानतः विभाजन करते हैं और/या ii) वे ब्याज के पैरामीटर के जवाब में स्पेक्ट्रल परिवर्तनों से गुजरते हैं । उदाहरण के लिए, पीएच के मामले में, फ्लोरोसेंट कमजोर कुर्सियां, जैसे कि एक्रिडीन नारंगी, क्रेसिल वायलेट, और लिसोट्रैकर रंग अम्लीय ऑर्गेनेल्स में अधिमानतः जमा होते हैं। इसलिए, उनकी सापेक्ष तीव्रता एक मोटा संकेत है कि लेबल वाले ऑर्गेनेल अम्लीय हैं। अन्य पीएच-उत्तरदायी फ्लोरोफोरस, जैसे फ्लोरोसेइन, प्लरोडो और साइपहर5ई, प्रोटॉन(चित्रा 1A–सी)के लिए बाध्यकारी होने पर स्पेक्ट्रल परिवर्तनों से गुजरते हैं। पीएच-संवेदनशील फ्लोरोफोरस के फ्लोरेसेंस उत्सर्जन में परिवर्तन इसलिए पीएच का एक उपयोगी सन्निकटन प्रदान कर सकते हैं। एकल फ्लोरोफोरस का उपयोग, हालांकि, कई नुकसान प्रस्तुत करता है। उदाहरण के लिए, फोकल प्लेन में परिवर्तन, फोटोब्लैचिंग, और व्यक्तिगत ऑर्गेनेल्स की मात्रा में परिवर्तन, मैक्रोपिनोसोम्स21में एक आम घटना, एकल फ्लोरोफोरस की फ्लोरेसेंस तीव्रता में परिवर्तन को प्रेरित कर सकती है, और इसे आसानी से22के लिए ठीक नहीं किया जा सकता है। एकल तरंगदैर्ध्य आकलन, हालांकि अम्लीय डिब्बों की कल्पना के लिए उपयोगी है, इसलिए विशुद्ध रूप से गुणात्मक हैं ।
अधिक मात्रात्मक दृष्टिकोण पैरामीटर-संवेदनशील फ्लोरोफोर को लक्षित करना है और साथ ही ब्याज के ऑर्गेनेल के संदर्भ फ्लोरोफोर के साथ। संदर्भ फ्लोरोफोर ऑर्गेनेल(चित्रा 1D-F)के भीतर जैव रासायनिक परिवर्तनों के प्रति आदर्श रूप से असंवेदनशील है और इसलिए इसका उपयोग फोकल प्लेन, ऑर्गेनेलर वॉल्यूम में परिवर्तनों के लिए सही करने के लिए किया जा सकता है, और कुछ हद तक, फोटोब्लैचिंग23। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, जिसे दोहरी-फ्लोरोफोर अनुपातमेट्रिक फ्लोरेसेंस कहा जाता है, संदर्भ फ्लोरोफोर के पैरामीटर-संवेदनशील फ्लोरोफोर के फ्लोरेसेंस उत्सर्जन का अनुपात पैदा करके सुधार प्राप्त किया जा सकता है।
यहां, प्रोटोकॉल मैक्रोपिनोसोम्स के भीतर पीएच, ऑक्सीडेटिव घटनाओं और प्रोटीन क्षरण को मापने के लिए ड्यूल-फ्लोरोफोर रेशियोमेट्रिक इमेजिंग के सिद्धांत का उपयोग करेगा। प्रत्येक मामले में, एक फ्लोरोफोर का चयन किया जाएगा जो ब्याज के पैरामीटर और संदर्भ फ्लोरोफोर के प्रति संवेदनशील है। फ्लोरोफोरेस को विशेष रूप से मैक्रोपिनोसोम्स तक लक्षित करने के लिए, उन्हें 70 केडीए डेक्सट्रान के साथ मिलकर बनाया जाएगा, जिसे अधिमानत मैक्रोपिनोसोम्स24में शामिल किया गया है। सभी परख Raw264.7 कोशिकाओं में किया जाएगा, लेकिन अन्य सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। जहां संभव हो, पूर्ण मूल्यों को हासिल करने के लिए एक संदर्भ वक्र के खिलाफ फ्लोरेसेंस अनुपात को कैलिब्रेट किया जाएगा। महत्वपूर्ण बात, सभी माप मैक्रोपिनोसोम के चमकदार वातावरण के गतिशील और मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए जीवित कोशिकाओं में किया जाएगा।
पीएच-संवेदनशील फ्लोरोफोरस का चयन करते समय, कई विचारों को तौला जाना चाहिए। पहला फ्लोरोफोर का पीकेए है, जो पीएच मूल्यों की सीमा को इंगित करता है जिस पर जांच सबसे अधिक संवेदनशील होगी। यदि यह माना जाता है कि गठन के तुरंत बाद, मैक्रोपिनोसोम का पीएच बाहूश माध्यम (~ पीएच 7.2) के करीब होगा और यह उत्तरोत्तर देर से एंडोसोम्स और लाइसोसोम्स (~ पीएच 5.0) के साथ बातचीत के माध्यम से अम्लीय होगा, तो एक पीके के साथजांच की जाएगी जो उस सीमा के भीतर संवेदनशील है(चित्र 2 सी)का चयन किया जाना चाहिए। फ्लोरोफोर फ्लोरोसीन, जिसमें 6.4 का पीकेए है, उस सीमा के भीतर बेहतर रूप से संवेदनशील है। इसका उपयोग अन्य समान ऑर्गेनेल्स, जैसे फागोसोम्स को मापने के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है, और इस पांडुलिपि22, 25में पसंद का फ्लोरोफोर होगा। एक संदर्भ फ्लोरोफोर के रूप में, टेट्रामेथिलरोडमाइन का उपयोग किया जाएगा, जो पीएच(चित्रा 1E)के प्रति असंवेदनशील है। अन्य फ्लोरोफोरस, जैसे कि फ्लोरोडो और सिपहर5ई को फ्लोरोसिन के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है जहां फ्लोरोसीन के स्पेक्ट्रल गुण अन्य प्रयोगात्मक चरों से मेल खाते हैं। कुछ सुझाए गए संदर्भ फ्लोरोफोरस फॉर फ़्रोडो और साइपहर5ई को चित्र 1में दिखाया गया है .
दूसरा विचार वह विधि है जिसके द्वारा दो फ्लोरोफोरस को विशेष रूप से मैक्रोपिनोसोम्स के लिए लक्षित किया जाएगा । आकार 70 केडीए का डेक्सट्रान, जिसमें लगभग 7 एनएम का हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या होता है, कोशिकाओं के लिए विशेष रूप से नहीं चिपकता है और इसे मैक्रोपिनोसोम्स में शामिल किया जाता है, लेकिन क्लैथ्रिन-लेपित गड्ढों या कैवियोल में शामिल नहीं किया जाता है, और इसलिए मैक्रोपिनोसोम्स(चित्रा 2 ए और चित्रा 3ए, बी)16,24,26को चिह्नित करता है। इस प्रोटोकॉल में फ्लोरोसीन-लेबल 70 केडीए डेक्सट्रान और टेट्रामेथाइलरोडमाइन (टीएमआर) लेबल वाले 70 केडीए डेक्सट्रान का उपयोग क्रमशः पीएच-सेंसिटिव और रेफरेंस प्रोब के रूप में किया जाएगा।
जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं में, मैक्रोपिनोसाइटोसिस और फागोसिटोसिस अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया27की कोशिकाओं के प्रसंस्करण और बाद में प्रस्तुति के लिए एक्सोजेनस सामग्री के आंतरिककरण के लिए दो प्रमुख मार्गों का प्रतिनिधित्व करते हैं। फागोसोम्स और मैक्रोपिनोसोम्स के ल्यूमेन के रेडॉक्स रसायन का सावधानीपूर्वक और समन्वित नियंत्रण बहिर्जात सामग्री के संदर्भ-विशिष्ट प्रसंस्करण के लिए महत्वपूर्ण है। शायद फागोसोम्स में ऑक्सीडेटिव घटनाओं का सबसे अच्छी तरह से अध्ययन किया गया नियामक एनएडीपीएच ऑक्सीडेस है, जो एक बड़ा बहु-उपइका परिसर है जो फागोसोम्स28के ल्यूमेन के भीतर बड़ी मात्रा में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का उत्पादन करता है। दरअसल, इसकी गतिविधि29,30के भीतर उपयुक्त एंटीजन प्रसंस्करण के लिए केंद्रीय है । फिर भी, मैक्रोपिनोसोमल झिल्ली पर एनएडीपीएच ऑक्सीडेस की गतिविधि का पता नहीं लगाया गया है।
इस प्रोटोकॉल में, एच2डीसीएफडीए एस्सिनीमिडिल एस्टर का उपयोग मैक्रोपिनोसोम के भीतर ऑक्सीडेटिव घटनाओं को मापने के लिए किया जाता है। यह फ्लोरोसेसिन (2′, 7′-डाइक्लोरोहाइड्रोफ्लोफोरेसिन डायसेटेट) का एक संशोधित रूप है, जो इसके कम रूप में न्यूनतम फ्लोरोसेंट है। ऑक्सीकरण पर, इसका फ्लोरेसेंस उत्सर्जन काफी बढ़ जाता है। हालांकि, यह H2DCFDA की एक महत्वपूर्ण चेतावनी को ध्यान में रखते हुए है – क्योंकि यह फ्लोरोफोर फ्लोरोसीन पर आधारित है, इसका फ्लोरेसेंस अम्लीय डिब्बों में भी बुझाया जाता है, और प्रयोग28को डिजाइन करते समय इस चर के लिए नियंत्रण के लिए देखभाल की जानी चाहिए। पीएच को मापने के लिए दृष्टिकोण के समान, एच2डीसीएफडीए succinimidyl एस्टर को सहसंयोजक रूप से 70 केडीए डेक्सट्रान से जोड़ा जाएगा और टीएमआर-लेबल 70 केडीए डेक्सट्रान का उपयोग संदर्भ फ्लोरोफोर(चित्रा 3 ए)के रूप में किया जाएगा।
फ्लोरोसेंट ओवलबुमिन का उपयोग मैक्रोपिनोसोम्स के भीतर प्रोटीन क्षरण को मापने के लिए किया जाएगा। यहां इस्तेमाल होने वाले ओवलबुमिन को 4,4-डिफ्लोरो-4-बोरा-3ए, 4ए-डियाज-एस-इंडैसेन (BODIPY) FL डाई के साथ घनी लेबल किया गया है जो स्वयं-शमन है। पाचन पर, दृढ़ता से फ्लोरोसेंट डाई-लेबल पेप्टाइड्स मुक्त होते हैं। चूंकि ओवलबमिन को आसानी से 70 केडीए डेक्सट्रान में संयुग्मित नहीं किया जा सकता है, इसलिए टीएमआर-लेबल वाली कोशिकाएं 70 केडीए डेक्सट्रान और द्रव-चरण ओवलबुमिन को सह-इनक्यूबेटेड किया जाएगा। टीएमआर सिग्नल का उपयोग पोस्ट-इमेजिंग विश्लेषण के दौरान मैक्रोपिनोसोम मास्क उत्पन्न करने के लिए किया जाएगा, और पचाए गए अंडाकारबुमिन से मुक्त सिग्नल को मास्क(चित्रा 3 बी)के भीतर मापा जाएगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
यद्यपि मैक्रोफेज, फाइब्रोब्लास्ट और यहां तक कि डिक्टियोस्टियम स्पीप में मैक्रोपिनोसाइटिक तेज के कम और उच्च थ्रूपुट दोनों मापों के लिए कई प्रोटोकॉल हैं। 3,7,31,</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इसके समर्थन के लिए कैलगरी विश्वविद्यालय का शुक्रिया अदा करते हैं । हम डॉ रॉबिन येट्स को भी अभिकर् स, उपकरण और उपयोगी चर्चाओं तक पहुंच के लिए धन्यवाद देना चाहेंगे ।
Materials
| Black-walled 96 well plate | PerkinElmer | 6005430 | |
| CypHer5e, NHS ester | Cytiva | PA15401 | |
| Dextran-amino 70 kDa | Invitrogen | D1862 | |
| DQ-ovalbumin | Invitrogen | D12053 | |
| FITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1823 | |
| HBSS | Gibco | 14287 | |
| Nigericin | Sigma Aldrich | N7143 | |
| OxyBurst Green-SE | Invitrogen | D2935 | |
| pHrodo Red, SE | Invitrogen | P36600 | |
| Raw264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI medium | Gibco | 11875093 | |
| SP5 Confocal Microscope | Leica | – | |
| TRITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1819 | |
| u-Dish | Ibidi | 81156 |
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