Misurazione del pH, delle sostanze chimiche redox e della capacità degradativa dei macropinosomi utilizzando la microscopia a doppio fluoroforo

Summary

Descriviamo i protocolli per misurare il pH, gli eventi ossidativi e la digestione delle proteine in singoli macropinosomi in cellule vive. L’accento è posto sulla microscopia a doppio fluoroforo ratiometrico e sui vantaggi che offre rispetto alle tecniche basate sulla popolazione.

Abstract

Negli ultimi anni, il campo della macropinocitosi è cresciuto rapidamente. La macropinocitosi è emersa come un meccanismo centrale attraverso il quale le cellule immunitarie innate mantengono l’omeostasi e l’immunità dell’organismo. Allo stesso tempo, e in contrasto con il suo ruolo omeostatico, può anche guidare varie patologie, tra cui il cancro e le infezioni virali. A differenza di altre modalità di endocitosi, gli strumenti sviluppati per studiare la maturazione dei macropinosomi rimangono sottosviluppati. Qui il protocollo descrive gli strumenti di nuova concezione per studiare l’ambiente redox all’interno del lume dei macropinosomi precoci e in maturazione. Vengono descritte le metodologie per l’utilizzo della microscopia a fluorescenza ratiometrica nella valutazione del pH, della produzione di specie reattive dell’ossigeno e della capacità degradativa all’interno del lume dei singoli macropinosomi nelle cellule vive. Le misurazioni di singoli organelli offrono il vantaggio di rivelare l’eterogeneità spaziotemporale, che spesso viene persa con approcci basati sulla popolazione. L’accento è posto sui principi di base della microscopia a doppio fluoroforo, tra cui la selezione della sonda, la strumentazione, la calibrazione e i metodi a singola cellula rispetto a quelli basati sulla popolazione.

Introduction

La macropinocitosi si riferisce all’assorbimento di grandi quantità di fluido extracellulare in organelli citoplasmatici legati alla membrana chiamati macropinosomi^1,2. È un processo altamente conservato eseguito da organismi unicellulari viventi liberi, come l’ameba Dictyostelium spp. ³, così come antozoi⁴ e metazoi². Nella maggior parte delle cellule, la macropinocitosi è un evento indotto. La legatura dei recettori della superficie cellulare induce la protrusione delle estensioni della membrana plasmatica guidate dall’actina denominate volant. Una frazione di questi volant, da qualche meccanismo poco compreso, sigillano le loro punte distali per formare macropinosomi (anche se al di là dello scopo di questo documento di metodi, per revisioni dettagliate sulla meccanica della macropinocitosi, si prega di fare riferimento ai riferimenti^1,2,5,6,7). Lo stimolo extracellulare che induce la macropinocitosi è più spesso un fattore di crescita solubile^5,8. Di conseguenza, l’evento macropinocitico consente l’ingestione di un bolo di materiale extracellulare da cui la cellula può ricavare metaboliti utili per facilitare la crescita. Sfortunatamente, questo percorso per la consegna dei nutrienti può anche guidare la patologia. Alcune cellule tumorali ospitano mutazioni che provocano macropinocitosi continua o costitutiva. L’erogazione continua di nutrienti facilita la proliferazione incontrollata delle cellule tumorali ed è stata collegata a tumori particolarmente aggressivi^{9,10,11,12,13.} Allo stesso modo, i virus possono indurre macropinocitosi per ottenere l’accesso alle cellule ospiti, guidando così la patologia virale¹⁴.

La macropinocitosi funziona anche nel mantenimento dell’immunità agli agenti patogeni. Alcune cellule immunitarie innate come i macrofagi e le cellule dendritiche si impegnano nel campionamento costitutivo e aggressivo del fluido extracellulare tramite macropinocitosi^6,15,16. Questa modalità di macropinocitosi è incredibilmente attiva e una singola cellula dendritica può inglobarsi con un volume di liquido extracellulare equivalente al proprio peso ogni ora¹⁷. Nonostante questo campionamento costitutivo, i macrofagi e le cellule dendritiche non si replicano in modo incontrollabile come fanno le cellule tumorali, ma sembrano elaborare il materiale extracellulare in modo tale che le informazioni possano essere estratte per informare sulla presenza, o addirittura sull’assenza, di potenziali minacce. Le informazioni vengono estratte come i) modelli molecolari associati ai patogeni che possono essere letti dai recettori di riconoscimento dei patogeni intracellulari e ii) brevi tratti di amminoacidi che possono essere caricati sulle principali molecole di istocompatibilità per lo screening da parte delle cellule del sistema immunitario adattativo^16,18,19. Se i patogeni sovvertono questo percorso per l’elaborazione delle informazioni da parte delle cellule immunitarie non è al momento chiaro.

Nonostante questi ruoli ben definiti e critici per la macropinocitosi sia nel mantenimento dell’immunità che nell’omeostasi e in contrasto con altre modalità di endocitosi più comunemente studiate, si sa poco del funzionamento interno (luminale) dei macropinosomi. Lo sviluppo di protocolli e strumenti standardizzati per studiare la biochimica luminale dei macropinosomi non solo ci aiuterà a comprendere meglio la loro biologia unica, ma fornirà informazioni che possono essere sfruttate per nuove strategie terapeutiche, tra cui la somministrazione di farmaci²⁰. Questo metodo manoscritto si concentrerà su strumenti recentemente sviluppati per sezionare, a livello di singolo organello, vari aspetti della biochimica luminale dei macropinosomi.

I fluorofori possono essere utilizzati per misurare specifiche biochimiche di organelli se i) si dividono preferenzialmente nel compartimento di interesse e/o ii) subiscono cambiamenti spettrali in risposta al parametro di interesse. Ad esempio, nel caso del pH, le basi deboli fluorescenti, come l’arancio acridina, il viola cresile e i coloranti LysoTracker si accumulano preferenzialmente negli organelli acidi. Pertanto, la loro intensità relativa è un’indicazione approssimativa che l’organello etichettato è acido. Altri fluorofori pH-responsive, come fluoresceina, pHrodo e cypHer5e, subiscono cambiamenti spettrali al momento del legame ai protoni (Figura 1A–C). Le modifiche all’emissione di fluorescenza dei fluorofori sensibili al pH possono quindi fornire un’utile approssimazione del pH. L’uso di singoli fluorofori, tuttavia, presenta una serie di svantaggi. Ad esempio, le modifiche al piano focale, il fotosciviazione e le modifiche al volume dei singoli organelli, un evento comune nei macropinosomi²¹, possono indurre cambiamenti nell’intensità di fluorescenza dei singoli fluorofori e questo non può essere facilmente corretto per²². Le valutazioni a singola lunghezza d’onda, sebbene utili per visualizzare compartimenti acidi, sono quindi puramente qualitative.

Un approccio più quantitativo consiste nell’indirizzare il fluoroforo sensibile ai parametri insieme a un fluoroforo di riferimento all’organello di interesse. Il fluoroforo di riferimento è idealmente insensibile ai cambiamenti biochimici all’interno dell’organello (Figura 1D–F) e può quindi essere utilizzato per correggere i cambiamenti nel piano focale, nel volume organellare e, in una certa misura, nel fotosableaching²³. Utilizzando questo approccio, denominato fluorescenza del doppio fluoroforo, la correzione può essere ottenuta generando un rapporto tra l’emissione di fluorescenza del fluoroforo sensibile ai parametri e il fluoroforo di riferimento.

Qui, il protocollo utilizzerà il principio dell’imaging ratiometrico a doppio fluoroforo per misurare il pH, gli eventi ossidativi e la degradazione delle proteine all’interno dei macropinosomi. In ogni caso, verrà selezionato un fluoroforo sensibile al parametro di interesse e un fluoroforo di riferimento. Al fine di indirizzare i fluorofori specificamente ai macropinosomi, saranno accoppiati covalentemente a 70 kDa destrano, che è preferibilmente incorporato nei macropinosomi²⁴. Tutti i test saranno eseguiti in cellule Raw264.7 ma possono essere adattati ad altri tipi di cellule. Ove possibile, i rapporti di fluorescenza saranno calibrati rispetto a una curva di riferimento per ottenere valori assoluti. È importante sottolineare che tutte le misurazioni saranno eseguite in cellule vive per la valutazione dinamica e quantitativa dell’ambiente luminale dei macropinosomi.

Quando si selezionano fluorofori sensibili al pH, è necessario valutare una serie di considerazioni. Il primo è il pK_a del fluoroforo, che indica l’intervallo di valori di pH a cui la sonda sarà più sensibile. Se si presume che poco dopo la formazione, il pH del macropinosoma sarà vicino a quello del mezzo extracellulare (~pH 7,2) e che si acidificherà progressivamente attraverso interazioni con endosomi e lisosomi tardivi (~pH 5,0), allora dovrebbe essere selezionata una sonda con un pK_a sensibile all’interno di tale intervallo (Figura 2C). La fluoroforo fluoresceina, che ha un pK_a di 6,4, è sensibile in modo ottimale all’interno di tale intervallo. È stato ampiamente utilizzato per misurare altri organelli simili, come i fagosomi, e sarà il fluoroforo di scelta in questo manoscritto^22,25. Come fluoroforo di riferimento, verrà utilizzata la tetrametilrodamina, che è insensibile al pH (Figura 1E). Altri fluorofori, come pHrodo e cypHer5e possono essere sostituiti dalla fluoresceina in cui le proprietà spettrali della fluoresceina corrispondono ad altre variabili sperimentali. Alcuni fluorofori di riferimento suggeriti per pHrodo e cypHer5e sono mostrati nella Figura 1.

Una seconda considerazione è il metodo con cui i due fluorofori saranno mirati specificamente ai macropinosomi. Il destrano della dimensione 70 kDa, che ha un raggio idrodinamico di circa 7 nm, non si attacca in modo non specifico alle cellule ed è incorporato nei macropinosomi, ma non nelle fosse rivestite di clatrina o nelle caveole, e quindi segna i macropinosomi (Figura 2A e Figura 3A, B)^16,24,26. In questo protocollo, il destro di destrano e la tetrametilrodamina (TMR) etichettati con fluoresceina da 70 kDa saranno utilizzati rispettivamente come sonde sensibili al pH e di riferimento.

Nelle cellule immunitarie innate, la macropinocitosi e la fagocitosi rappresentano le due principali vie per l’internalizzazione del materiale esogeno per l’elaborazione e la successiva presentazione alle cellule della risposta immunitaria adattativa²⁷. Il controllo attento e coordinato della chimica redox del lume di fagosomi e macropinosomi è fondamentale per l’elaborazione specifica del contesto del materiale esogeno. Forse il regolatore più studiato degli eventi ossidativi nei fagosomi è la NADPH ossidasi, un grande complesso multi-subunità che produce grandi quantità di specie reattive dell’ossigeno (ROS) all’interno del lume dei fagosomi²⁸. Infatti, la sua attività è fondamentale per l’appropriata elaborazione dell’antigene all’interno dei fagosomi^29,30. Tuttavia, l’attività della NADPH ossidasi sulle membrane macropinosomiali non è stata esplorata.

In questo protocollo, l’estere succinimidilico H2DCFDA viene utilizzato per misurare gli eventi ossidativi all’interno del macropinosoma. Questa è una forma modificata di fluoresceina (2′,7′-dicloroidoidrofluoresceina diacetato), che è minimamente fluorescente nella sua forma ridotta. Dopo l’ossidazione, la sua emissione di fluorescenza aumenta in modo significativo. Vale tuttavia la pena notare un avvertimento significativo di H2DCFDA – poiché si basa sulla fluorofora fluoresceina, la sua fluorescenza è anche spenta in compartimenti acidi e bisogna fare attenzione a controllare questa variabile quando si progettano esperimenti²⁸. Simile all’approccio per la misurazione del pH, l’estere succinimidilico H2DCFDA sarà fissato covalentemente a 70 kDa destrano e il destrano da 70 kDa con etichetta TMR sarà usato come fluoroforo di riferimento (Figura 3A).

L’ovalbumina fluorescente sarà utilizzata per misurare la degradazione delle proteine all’interno dei macropinosomi. L’ovalbumina utilizzata qui è densamente etichettata con un colorante FL 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) FL auto-spento. Dopo la digestione, i peptidi fortemente fluorescenti etichettati con coloranti vengono liberati. Poiché l’ovoalbumina non può essere facilmente coniugata a 70 kDa destrano, le cellule con destrano da 70 kDa e ovalbumina in fase fluida etichettati con TMR saranno co-incubate. Il segnale TMR verrà utilizzato per generare una maschera macropinosomica durante l’analisi post-imaging e il segnale liberato dall’ovoalbumina digerita sarà misurato all’interno della maschera (Figura 3B).

Protocol

1. Preparazione delle cellule Coltiva cellule Raw264.7 a 37 °C e dal 5% di CO2 al 70% di confluenza in RPMI integrato con il 10% di siero inattivato dal calore. Un giorno prima del test, seminare raw264,7 cellule ad una densità di 5 x 104 cellule per pozzetti in una piastra a 96 pozzetti. Assicurarsi che ogni pozzo contenga 100 μL di terreno di coltura. Assicurarsi che la piastra a 96 pozzetti abbia lati neri e un fondo di vetro per l’imaging.NOTA: Qui, le piastre a 96 poz…

Representative Results

Quando si misura il pH dei macropinosomi, c’è un periodo di tempo per il quale la dinamica dell’acidificazione non può essere misurata. Questo periodo corrisponde alla fase di carico destro (riquadro grigio in Figura 2C e Figura 3C,D)e varierà a seconda del tipo di cella utilizzata. La durata della fase di carico varierà con (i) l’attività macropinocitica delle cellule e (ii) la sensibilità dello strumento utilizzato. Si raccomanda di rego…

Discussion

Sebbene esistano numerosi protocolli per misurazioni sia a basso che ad alto rendimento dell’assorbimento macropinocitico in macrofagi, fibroblasti e persino Dictyostelium spp. ^{3,7,31,32,33,}pochissimi tentativi sono stati fatti per misurare la biochimica luminale di questi compartimenti dinamici. Ciò è probabilmente dovuto a una scarsità di sonde c…

Materials

Black-walled 96 well plate	PerkinElmer	6005430
CypHer5e, NHS ester	Cytiva	PA15401
Dextran-amino 70 kDa	Invitrogen	D1862
DQ-ovalbumin	Invitrogen	D12053
FITC-dextran 70 kDa	Invitrogen	D1823
HBSS	Gibco	14287
Nigericin	Sigma Aldrich	N7143
OxyBurst Green-SE	Invitrogen	D2935
pHrodo Red, SE	Invitrogen	P36600
Raw264.7 cells	ATCC	TIB-71
RPMI medium	Gibco	11875093
SP5 Confocal Microscope	Leica	–
TRITC-dextran 70 kDa	Invitrogen	D1819
u-Dish	Ibidi	81156