Måling af makroinoomers pH-, redoxkemikalier og nedbrydende kapacitet ved hjælp af dual-fluorophore ratiometrisk mikroskopi
Summary
Vi beskriver protokoller til måling af pH, oxidative hændelser og proteinfordøjelse i individuelle makropinoomer i levende celler. Der lægges vægt på dual-fluorophore ratiometrisk mikroskopi og de fordele, det giver i forhold til befolkningsbaserede teknikker.
Abstract
I de senere år er makropinocytose vokset hurtigt. Makropinocytose er opstået som en central mekanisme, hvorved medfødte immunceller opretholder organisme homøostase og immunitet. Samtidig, og i modsætning til sin homøostatiske rolle, det kan også drive forskellige patologier, herunder kræft og virusinfektioner. I modsætning til andre former for endokytose forbliver de værktøjer, der er udviklet til at studere modningen af makropinoomer, underudviklede. Her beskriver protokollen nyudviklede værktøjer til at studere redox miljøet inden for lumen af tidlige og modne makropinoomer. Metoder til brug af ratiometrisk fluorescensmikroskopi ved vurdering af pH, produktion af reaktive iltarter og den nedbrydende kapacitet i lumen af individuelle makropinoomer i levende celler er beskrevet. Enkelt organelle målinger giver den fordel at afsløre spatiotemporal heterogenitet, som ofte går tabt med befolkningsbaserede tilgange. Der lægges vægt på de grundlæggende principper for dobbelt fluorophore ratiometrisk mikroskopi, herunder sondevalg, instrumentering, kalibrering og encellede versus befolkningsbaserede metoder.
Introduction
Makropinocytose refererer til optagelsen af store mængder ekstracellulær væske i membranbundne cytoplasmaorganeller kaldet makrofoinoomer1,2. Det er en meget bevaret proces udført af fritlevende encellede organismer, såsom amøbe Dictyostelium spp. 3, samt anthozoaner4 og metazoer2. I de fleste celler er makropinocytose en induceret begivenhed. Ligationen af celle-overflade receptorer fremkalder fremspring af actin-drevet plasmamembran extensions benævnt flæser. En brøkdel af disse flæser, ved nogle dårligt forstået mekanisme, forsegle på deres distale tips til at danne makropinoomer (men uden for rammerne af denne metode papir, for detaljerede anmeldelser om mekanik makropinocytose, henvises til referencer1,2,5,6,7). Den ekstracellulære stimulus inducerende makropinocytose er oftest en opløselig vækstfaktor5,8. Derfor giver den makropinocytiske begivenhed mulighed for indtagelse af en bolus af ekstracellulært materiale, hvorfra cellen kan udlede nyttige metabolitter for at lette væksten. Desværre kan denne vej til næringsstoflevering også drive patologi. Visse kræftceller havnen mutationer, der resulterer i kontinuerlig eller konstituerende makropinocytose. Den kontinuerlige levering af næringsstoffer letter ukontrolleret spredning af kræftceller og er blevet forbundet med særligt aggressive tumorer9,10,11,12,13. På samme måde kan vira fremkalde makropinocytose for at få adgang til værtsceller og derved køre viral patologi14.
Makropinocytose fungerer også i opretholdelsen af immunitet over for patogener. Visse medfødte immunceller som makrofager og dendritiske celler indgår i konstituerende og aggressiv prøveudtagning af ekstracellulær væske via makropinocytose6,15,16. Denne tilstand af makropinocytose er utrolig aktiv, og en enkelt dendritisk celle kan omformge sig selv med et volumen af ekstracellulær væske svarende til sin egen vægt hver time17. På trods af denne konstituerende prøveudtagning, makrofager og dendritiske celler ikke replikere ukontrollabelt som gør tumorceller, i stedet, de synes at behandle ekstracellulære materiale på en sådan måde, at oplysninger kan udvindes for at informere om tilstedeværelsen, eller endog fravær, af potentielle trusler. Information er udvundet som i) patogen-associerede molekylære mønstre, der kan læses af intracellulære patogen anerkendelse receptorer og ii) korte strækninger af aminosyrer, der kan indlæses på større histokompatibilitet molekyler til screening af celler i adaptive immunsystem16,18,19. Om patogener undergraver denne vej til informationsbehandling af immunceller er på nuværende tidspunkt uklart.
På trods af disse veldefinerede og kritiske roller for makropinocytose i både opretholdelsen af immunitet og homøostase og i modsætning til andre mere almindeligt studerede former for endokytose, lidt af de indre (lysende) funktioner makropinoomer er kendt. Udvikling af standardiserede protokoller og værktøjer til at studere makropinoomers lysende biokemi vil ikke kun hjælpe os med at forstå deres unikke biologi bedre, men vil give indsigt, der kan udnyttes til nye terapeutiske strategier, herunder lægemiddellevering20. Denne metode manuskript vil fokusere på nyligt udviklede værktøjer til at dissekere, på det enkelte organelle niveau, forskellige aspekter af den lysende biokemi af makropinoomer.
Fluorophorer kan anvendes til at måle specifikke biokemikalier af organeller, hvis i) de fortrinsvis opdeles i interesserummet, og/eller ii) de undergår spektrale ændringer som reaktion på interesseparameteren. For eksempel, i tilfælde af pH, fluorescerende svage baser, såsom acridin orange, cresyl violet, og LysoTracker farvestoffer ophobes fortrinsvis i sure organeller. Derfor er deres relative intensitet en grov indikation af, at den mærkede organelle er sur. Andre pH-responsive fluorophorer, såsom fluorescein, pHrodo og cypHer5e, gennemgår spektrale ændringer ved binding til protoner (Figur 1A–C). Ændringer i fluorescensemissionen af pH-følsomme fluorophorer kan derfor give en nyttig tilnærmelse af pH. Brugen af enkelte fluorophorer udgør imidlertid en række ulemper. For eksempel kan ændringer i fokusplanet, fotobleaching og ændringer i mængden af individuelle organeller, en almindelig forekomst i makropinoomer21, fremkalde ændringer i fluorescensintensiteten af enkelte fluorophorer, og dette kan ikke let korrigeres for22. Enkeltbølgelængdevurderinger er derfor rent kvalitative, selv om de er nyttige til visualisering af sure rum.
En mere kvantitativ tilgang er at målrette den parameterfølsomme fluorhest sammen med en referencefluoriphe til interesseorganelle. Referencefluoriphen er ideelt ufølsom over for biokemiske ændringer i organelle (Figur 1D–F) og kan derfor bruges til at korrigere for ændringer i fokusplanet, organellarvolumen og til en vis grad fotobleaching23. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, benævnt dual-fluorophore ratiometrisk fluorescens, kan korrektion opnås ved at generere et forhold mellem fluorescens emission af parameter-følsomme fluorophore til reference fluorophore.
Her vil protokollen bruge princippet om dual-fluorophore ratiometrisk billeddannelse til at måle pH, oxidative hændelser, og protein nedbrydning inden makropinoomer. I hvert tilfælde vælges en fluorophore, der er følsom over for parameteren af interesse og en referencefluoriphe. For at målrette fluorophores specifikt til makropinoomer, vil de blive kovalent koblet til 70 kDa dextran, som fortrinsvis er indarbejdet i makropinosomer24. Alle analyser vil blive udført i Raw264.7 celler, men kan tilpasses andre celletyper. Fluorescensforholdet kalibreres om muligt i forhold til en referencekurve for at opnå absolutte værdier. Det er vigtigt, at alle målinger udføres i levende celler til dynamisk og kvantitativ vurdering af makropinoomers lysende miljø.
Ved valg af pH-følsomme fluorophorer skal en række overvejelser vejes. Den første er pKa af fluorophoren, hvilket angiver det interval af pH-værdier, hvor sonden vil være mest følsom. Hvis det antages, at makropinosomets pH kort efter dannelsen vil være tæt på det ekstracellulære medium (~ pH 7.2), og at det gradvist vil forsuring gennem interaktioner med sene endosomes og lysosomer (~ pH 5.0), skal der vælges en sonde med en pKa, der er følsom inden for dette område (Figur 2C). Fluorophor fluorescein, som har en pKa på 6,4, er optimalt følsom inden for dette område. Det er blevet brugt i vid udstrækning til at måle andre lignende organeller, såsom fagocomer, og vil være fluorophore valg i dette manuskript22,25. Som referencefluoriphe anvendes tetramethylrhodamin, som er ufølsomt over for pH (figur 1E). Andre fluorophorer, såsom pHrodo og cypHer5e, kan erstatte fluorescein, hvor fluoresceins spektrale egenskaber svarer til andre eksperimentelle variabler. Nogle foreslåede referenceflufluoripher til pHrodo og cypHer5e er vist i figur 1.
En anden overvejelse er den metode, hvormed de to fluorophorer vil blive målrettet specifikt til makropinoomer. Dextran af størrelsen 70 kDa, som har en hydrodynamisk radius på ca. 7 nm, klæber ikke specifikt til celler og er indarbejdet i makropinoomer, men ikke clathrinbelagte gruber eller hule, og markerer derfor makropinoomer (Figur 2A og figur 3A, B)16,24,26. I denne protokol vil fluorescein-mærket 70 kDa dextran og tetramethylrhodamin (TMR)-mærket 70 kDa dextran blive brugt som henholdsvis pH-følsomme og referencesonder.
Innat immunceller, makropinocytose og fagocytose repræsenterer de to vigtigste veje til internalisering af eksogent materiale til behandling og efterfølgende præsentation til celler af det adaptive immunrespons27. Den omhyggelige og koordinerede kontrol af redoxkemien hos lumen af phagosomes og makropinoomer er afgørende for den kontekstspecifikke behandling af eksogent materiale. Måske er den mest velundersøgte regulator af oxidative hændelser i phagoomer NADPH-oxidase, et stort multi-subunit kompleks, der producerer store mængder reaktive iltarter (ROS) inden for lumen af phagosomes28. Dens aktivitet er faktisk central for passende antigenbehandling inden for fagocosomer29,30. Men aktiviteten af NADPH-oxidase på makropinosomale membraner er ikke blevet udforsket.
I denne protokol bruges H2DCFDA succinimidyl ester til måling af oxidative hændelser i makropinosomet. Dette er en modificeret form for fluorescein (2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate), som er minimalt fluorescerende i sin reducerede form. Ved oxidation øges dens fluorescensemission betydeligt. Det er dog værd at bemærke en betydelig advarsel af H2DCFDA – da det er baseret på fluorophor fluorescein, slukkes dets fluorescens også i sure rum, og man skal sørge for at kontrollere for denne variabel ved design af eksperimenter28. I lighed med tilgangen til måling af pH vil H2DCFDA succinimidyl ester blive kovalent fastgjort til 70 kDa dextran og TMR-mærket 70 kDa dextran vil blive brugt som referencefluoriphe (figur 3A).
Fluorescerende ovalbumin vil blive brugt til at måle protein nedbrydning inden makropinoomer. Den ovalbumin, der anvendes her, er tæt mærket med et 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) FL farvestof, der er selvlukket. Ved fordøjelsen frigøres stærkt fluorescerende farvestofmærkede peptider. Da ovalbumin ikke let kan bøjes til 70 kDa dextran, vil celler med TMR-mærket 70 kDa dextran og fluid-phase ovalbumin blive inkuberet. TMR-signalet vil blive brugt til at generere en makropinosommaske under analyse efter billeddannelse, og signalet, der frigøres fra det fordøjede ovalbumin, måles i masken (Figur 3B).
Protocol
Representative Results
Discussion
Selv om der er en række protokoller for både lav og høj-throughput målinger af makropinocytiske optagelse i makrofager, fibroblaster, og endda Dictyostelium spp. 3,7,31,32,33, meget få forsøg er gjort for at måle den lysende biokemi af disse dynamiske rum. Dette skyldes sandsynligvis en mangel på sonder, der effektivt kan målrettes til makrop…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker University of Calgary for dets støtte. Vi vil også gerne takke Dr. Robin Yates for adgang til reagenser, udstyr og nyttige diskussioner.
Materials
| Black-walled 96 well plate | PerkinElmer | 6005430 | |
| CypHer5e, NHS ester | Cytiva | PA15401 | |
| Dextran-amino 70 kDa | Invitrogen | D1862 | |
| DQ-ovalbumin | Invitrogen | D12053 | |
| FITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1823 | |
| HBSS | Gibco | 14287 | |
| Nigericin | Sigma Aldrich | N7143 | |
| OxyBurst Green-SE | Invitrogen | D2935 | |
| pHrodo Red, SE | Invitrogen | P36600 | |
| Raw264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI medium | Gibco | 11875093 | |
| SP5 Confocal Microscope | Leica | – | |
| TRITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1819 | |
| u-Dish | Ibidi | 81156 |
References
- Canton, J. Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. SnapShot: Macropinocytosis. Cell. 169, 766 (2017).
- Williams, T., Kay, R. R. High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).
- Ganot, P., et al. Ubiquitous macropinocytosis in anthozoans. eLife. 50022, (2020).
- Charpentier, J. C., et al. Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1. Nature Communications. 11, 180 (2020).
- Bohdanowicz, M., et al. Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes. Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).
- Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).
- Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131, (2018).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
- Commisso, C. The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153 (2019).
- Zhang, Y., et al. Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness. Cancer Discovery. , (2021).
- Lee, S. -. W., et al. EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis. Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).
- Michalopoulou, E., et al. Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition. Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).
- Mercer, J., Helenius, A. Virus entry by macropinocytosis. Nature Cell Biology. 11, 510-520 (2009).
- West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305, 1153-1157 (2004).
- Canton, J., et al. Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages. Nature Communications. 7, 11284 (2016).
- Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).
- Bhosle, V. K., et al. SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling. Nature Communications. 11, 4112 (2020).
- Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
- Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180156 (2019).
- Freeman, S. A., et al. Lipid-gated monovalent ion fluxes regulate endocytic traffic and support immune surveillance. Science. 367, 301-305 (2020).
- Canton, J., Grinstein, S. Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1519, 185-199 (2017).
- Cheung, S., Greene, C., Yates, R. M. Simultaneous analysis of multiple lumenal parameters of individual phagosomes using high-content imaging. Methods Molecular Biology. 1519, 227-239 (2017).
- Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
- Canton, J., Grinstein, S. Measuring lysosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 126, 85-99 (2015).
- Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation. Biophysical Journal. 87, 4259-4270 (2004).
- Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual Reviews of Immunology. 31, 443-473 (2013).
- Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25, 3330-3341 (2014).
- Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112, 4712-4722 (2008).
- Canton, J., et al. The receptor DNGR-1 signals for phagosomal rupture to promote cross-presentation of dead-cell-associated antigens. Nature Immunology. 22, 140-153 (2021).
- Mishra, R., Bhowmick, N. A. Visualization of macropinocytosis in prostate fibroblasts. Bio-Protocol. 9, (2019).
- Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. Quantitation of macropinocytosis in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1928, 113-123 (2019).
- Lee, S. -. W., Alas, B., Commisso, C. Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, 171-181 (2019).
- Swanson, J. A., King, J. S. The breadth of macropinocytosis research. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180146 (2019).
