Produção rápida, acessível e descomplicada de lysate sem células bacterianas

Robert M. Cooper; Taishi Tonooka; Andriy Didovyk; Jeff Hasty

doi:10.3791/62753

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Artigo de método

Produção rápida, acessível e descomplicada de lysate sem células bacterianas

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DOI:

10.3791/62753

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29 de outubro de 2021

Robert M. Cooper^*¹ , Taishi Tonooka^*¹^,² , Andriy Didovyk^*¹^,³ , Jeff Hasty¹^,⁴^,⁵

¹Biocircuits Institute, University of California, San Diego, ²Present address, Kyoto Institute of Technology, ³Present address, Vertex Pharmaceuticals, ⁴Department of Bioengineering, University of California, San Diego, ⁵Molecular Biology Section, University of California, San Diego

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método rápido e simples para produzir lisenato bacteriano para expressão genética livre de células, usando uma cepa projetada de Escherichia coli e exigindo apenas equipamentos de laboratório padrão.

Resumo

A expressão genética livre de células oferece o poder da biologia sem as complicações de um organismo vivo. Embora existam muitos desses sistemas de expressão genética, a maioria é bastante cara para comprar e/ou requer equipamentos especiais e experiência finamente aprimorada para produzir efetivamente. Este protocolo descreve um método para produzir lisesato bacteriano livre de células que suporta altos níveis de expressão genética, utilizando apenas equipamentos de laboratório padrão e exigindo processamento mínimo. O método utiliza uma cepa Escherichia coli produzindo uma endolise que não afeta o crescimento, mas que lises eficientemente uma pelota celular colhida após um simples ciclo de congelamento. O único processamento adicional necessário é uma breve incubação seguida de centrifugação para limpar o autolise de detritos celulares. Circuitos genéticos dinâmicos podem ser alcançados através da expressão heteróloga da protease ClpX nas células antes da colheita. Uma cepa de E. coli sem o gene lacZ pode ser usada para aplicações de biossensão de alta sensibilidade e livre de células usando uma leitura colorimétrica ou fluorescente. Todo o protocolo requer apenas 8-9 horas, com apenas 1-2 horas de trabalho prático desde a inoculação até a conclusão. Ao reduzir o custo e o tempo para obter o lise livre de células, este método deve aumentar a acessibilidade da expressão genética livre de células para várias aplicações.

Introdução

A expressão genética em lises livres de células tem várias vantagens sobre o uso de células vivas^1,^2,³^,⁴. Os lysatos podem ser facilmente modificados bioquimicamente e usados em condições que podem ser prejudiciais ou impossíveis de alcançar em células vivas. Circuitos de expressão genética não têm que lutar ou competir com processos biológicos hospedeiros, e testar novos circuitos genéticos é tão simples quanto adicionar DNA. Por essas razões, a expressão genética livre de células encontrou várias aplicações, desde biosensores