Yaşayan Bitki Hücrelerinde Förster Rezonans Enerji Transferi Ölçümleri
Summary
In vivo Förster rezonans enerji transferi ölçümleri için standart bir konfokal lazer tarama mikroskobu kurmak ve ardından veri değerlendirmesi için bir protokol sağlanmıştır.
Abstract
Hassaslaştırılmış emisyon bazlı Förster rezonans enerji transferi (FRET) deneyleri kolayca yapılır, ancak mikroskobik kuruluma bağlıdır. Konfokal lazer tarama mikroskopları biyologlar için bir çalışma atı haline gelmiştir. Ticari sistemler lazer güç ayarı ve dedektör hassasiyetinde yüksek esneklik sunar ve genellikle mükemmel görüntüyü elde etmek için farklı dedektörleri birleştirir. Ancak, farklı denemelerden ve kurulumlardan gelen yoğunluğa dayalı verilerin karşılaştırılması genellikle bu esneklik nedeniyle imkansızdır. Biyolog dostu prosedürler avantajlıdır ve lazer ve dedektör ayarlarının basit ve güvenilir bir şekilde ayarlanmasında izin verir.
Ayrıca canlı hücrelerde yapılan FRET deneyleri protein ekspresyosu ve donör-kabul edici oranlarındaki değişkenliklerden etkilendiği için veri değerlendirmesi için protein ekspresyon düzeylerinin göz önünde bulundurulmalıdır. Burada, protein ekspresyonunun tahmini ve lazer yoğunluğunun ve dedektör ayarlarının ayarlanması için rutinler de dahil olmak üzere güvenilir ve tekrarlanabilir FRET ölçümleri için basit bir protokol açıklanmıştır. Veri değerlendirmesi, bilinen FRET verimliliğinin florofor füzyonu ile kalibrasyon ile yapılacaktır. Basitliği artırmak için hücrelerde ve rekombinant floresan proteinlerin ölçülerek elde edilen düzeltme faktörleri karşılaştırılmıştır.
Introduction
Förster rezonans enerji transferi ((F)RET) tipik olarak floresan spektroskopisi ile gözlenir, ancak sürecin kendisi floroforlar arasında meydana gelmekle sınırlı değildir. Alttaki dipol-dipol bağlantısı sadece ışık yayan bir donör molekülü ve ışık emici bir alıcı gerektirir. Bu, normalleştirilmiş donör emisyonu ve alıcı emici absorbans spektrumunun gerekli spektral örtüşümü integral J’den türetilmiştir1. Bununla birlikte, RET floresan ile rekabet ettiği için, enerji transferi floresan emisyonundaki değişikliklerle ölçülebilir hale gelir: RET, donörlerin söndürülmesine ve duyarlı kabul edilebilir emisyona neden olur.
Florofor bazlı RET, biyolüminesans rezonans enerji transferinden (BRET) ayırmak için floresan rezonans enerji transferi (FRET) olarak adlandı. RET, donör ve alıcı arasındaki mesafeye bağlıdır, bu da yaygın olarak 0.5-10 nm2 aralığındadır ve böylece proteinlerin boyutları ve kompleksleri ile aynı aralıktadır. İkinci olarak, RET dipol-dipol oryantasyon kappa kare bağlıdır. Moleküler ağırlık ve yavaş dönme gevşemesi nedeniyle proteine bağlı floroforların dönme özgürlüğünün ihmal edilebildiği gerçeğiyle birleştiğinde, RET konformasyonel değişikliklerin analizine izin verir3.
Förster yarıçapı, spektral örtüşme integraline ve örtüşmenin dalga boyu aralığına dayanır, böylece kırmızı ışık emici kromoforlar mavi ışık emici boyalardan daha uzun Förster yarıçapı ile sonuçlanır. FRET ölçümlerinin dinamik aralığı R0 × 0,5 ve R0 × 1,5 ile sınırlı olduğundan, FRET çifti ECFP-EYFP 4,9 nm4 R0 nedeniyle 2,5-7,3 nm dinamik aralığına sahiptir.
Bir floroforun parlaklığı, azı dişi yok olma katsayısının ve kuantum veriminin ürünü ile verilir. FRET ölçümleri için, neredeyse benzer parlaklığa sahip floroforları seçmek avantajlıdır. Bu, donör söndürme ve duyarlı kabul eden emisyonun tespitini artırır. Ayrıca mikroskopi sisteminin kalibrasyonunu da tercih eder. Sık kullanılan FRET siyan ve floresan protein çiftlerine bakıldığında, siyan floresan proteinlerin daha düşük parlaklığı belirgin hale gelir (Şekil 1A).
Bununla birlikte, alıcının ömrü, bağışçının enerji transferi için kullanılabilirliğini sağlamak için donörün ömründen daha düşük olmalıdır. Kabul edenin ömrü donörün ömrünü aşarsa, bağışçı tekrar heyecanlandığında kabul eden kişi hala heyecanlı durumda olabilir. mTurquoise gibi gelişmiş siyan floresan proteinler uzun bir ömür gösterir ve böylece FRET olasılığının artmasına katkıda bulunur (Şekil1B). FRET olasılığı da kabul edenin azı dişi yok olma katsayısına bağlıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Donör söndürme ve duyarlı kabul eden emisyon, donör veya alıcı tabanlı FRET hesaplamasına izin veren doğrusal bir ilişki ile karakterize edilir. Karşılık gelen doğrusallık faktörlerine, karşılıklı değerler olan G faktörü (bağışçıdan alıcıya) veya xi (donöre kabul eden) denir4. Floresan proteinler arasındaki FRET’in floresan mikroskopi ile ölçülmesi, floresan proteinlerin geniş emilimi ve emisyon spektrumu nedeniyle genellikle DSBT ve ASBT için düzeltmeler ger…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deneyler, Bielefeld Üniversitesi Biyoloji Fakültesi Işık Mikroskopi Teknolojisi Platformu’nda (LiMiTec) gerçekleştirildi. Bu çalışma Bielefeld Üniversitesi tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 8-well slides | Ibidi | 80821 | |
| Immersion oil Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | refraction index of water |
| LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss |
References
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescent Spectroscopy. Third Edition. , (2006).
- Clegg, R. M. Förster resonance energy transfer- FRET what it is, why do it, and how it’s done. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. 33, 1-57 (2009).
- Vogel, S. S., Nguyen, T. A., vander Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS ONE. 7, 49593 (2012).
- Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Science. 4, 413 (2013).
- Gadella, T. W. J., vander Krogt, G. N., Bisseling, T. GFP-based FRET-microscopy in living plant cells. Trends in Plant Science. 4, 287-291 (1999).
- Van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86, 2517-2529 (2004).
- Seidel, T., Golldack, D., Dietz, K. J. Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements. FEBS Letters. 579, 4374-4382 (2005).
- Seidel, T., Schnitzer, D., Golldack, D., Sauer, M., Dietz, K. J. Organelle-specific iso-enzymes of plant V-ATPase as revealed by in vivo-FRET. BMC Cell Biology. 9, 28 (2008).
- Schnitzer, D., Seidel, T., Sander, T., Golldack, D., Dietz, K. J. The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H+-ATPase and impairs vacuolar acidification. Plant Cell Physiology. 52, 946-956 (2011).
- Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 124672 (2012).
- Holtorf, S., Apel, K., Bohlmann, H. Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 29, 637-646 (1995).
- Seidel, T., et al. Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar H+-ATPase in living plant cells. Journal of Biotechnology. 112 (1-2), 165-175 (2004).
- Beemiller, P., Hoppe, A. D., Swanson, J. A. A phosphatidylinositol-3-kinase-dependent signal transition regulates ARF1 and ARF6 during FCγ receptor-mediated phagocytosis. PLoS Biology. 4, 162 (2006).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16, 277-278 (2019).
