Dieses Manuskript skizziert die Blot-and-Plunge-Methode zum manuellen Einfrieren biologischer Proben für die kryogene Elektronenmikroskopie mit einem Partikel.
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Methodenartikel
Manuelles Blot-and-Plunge-Einfrieren biologischer Proben für die kryogene Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Abbildung biologischer Proben mit Elektronen zur hochauflösenden Strukturbestimmung durch kryogene Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie (KryoEM) erfordert eine dünne Schicht Glaseis, die die interessierenden Biomoleküle enthält. Trotz zahlreicher technologischer Fortschritte in den letzten Jahren, die die Einzelpartikel-KryoEM an die Spitze der Strukturbiologie gebracht haben, bleiben die Methoden, mit denen Proben für die hochauflösende Bildgebung verglast werden, oft der geschwindigkeitsbegrenzende Schritt. Obwohl zahlreiche neuere Bemühungen Mittel zur Überwindung von Hürden bereitgestellt haben, die häufig bei der Probenverglasung auftreten, einschließlich der Entwicklung neuartiger Probenträger und innovativer Vitrifikationsinstrumente, bleibt der traditionelle manuell betriebene Kolben aufgrund der niedrigen Anschaffungskosten und der einfachen Bedienung ein Grundnahrungsmittel in der KryoEM-Community. Hier stellen wir detaillierte Methoden für den Einsatz eines standardmäßigen, guillotinenartigen, manuell betriebenen Blot-and-Plunge-Geräts zur Vitrifikation biologischer Proben für die hochauflösende Bildgebung mittels Einzelpartikel-KryoEM zur Verfügung. Darüber hinaus werden häufig auftretende Probleme und Empfehlungen zur Fehlerbehebung für den Fall beschrieben, dass ein Standardpräparat keine geeignete Probe liefert.
Einleitung
Die kryogene Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie (KryoEM) ist eine leistungsstarke Strukturtechnik, mit der Strukturen dynamischer biologischer Proben mit nahezu atomarer Auflösung gelöst werden können1,2,3,4. In der Tat, jüngste Fortschritte in der direkten Elektronendetektortechnologien4,5,6,7,8,9,10, Verbesserungen
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Protokoll
1. Vorbereiten der manuellen Tauchumgebung
HINWEIS: Geschätzte Betriebszeit: 5-30 Minuten
- Positionieren Sie den manuellen Kolben in einem 4 °C heißen Kühlraum, in dem ein Luftbefeuchter untergebracht werden kann, um den Raum in der Nähe von 100 % relativer Luftfeuchtigkeit (RH) zu halten (Abbildung 1A).
ACHTUNG: Bitte konsultieren Sie die Umwelt-, Gesundheits- und Sicherheitsrichtlinien der Institution für die sichere Position des manuellen Kolbens und die empfohlenen Operationen. - Schalten Sie vor der Netzvorbereitung den Luftbefeuchter im Kühlraum ein, um sicherzustellen, dass die relati....
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Ergebnisse
Die erfolgreiche Ausführung des hier beschriebenen Blot-and-Plunge-Protokolls führt zu einer dünnen, gleichmäßigen Schicht aus Glaseis, die frei von hexagonalem Eis, Verunreinigungen und großen Gradienten von unbrauchbarem Eis ist, die unter dem Elektronenmikroskop beobachtet werden können (Abbildung 3). Ein inkonsistenter Kontakt des Löschpapiers mit der Gitteroberfläche, das vorzeitige Entfernen des Löschpapiers oder das Bewegen des Löschpapiers während des Gitterkontakts kann die Qualität.......
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Diskussion
Die Vitrifikation biologischer Proben für die Bildgebung mittels Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie (CryoEM) bleibt ein entscheidender Schritt für eine erfolgreiche Strukturbestimmung. Die in diesem Protokoll beschriebene manuelle Blot-and-Plunge-Methode stellt eine kostengünstige, zuverlässige und robuste Methode zum schnellen Einfrieren biologischer Proben in dünnen Glaskörpereisschichten für die KryoEM-Bildgebung dar. Mit den im Manuskript beschriebenen Methoden werden die Forscher in der Lage sein, den manuell.......
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Offenlegungen
Wir haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Wir danken den Mitgliedern des Herzik-Labors für kritisches Nachdenken und Feedback zu diesem Manuskript und dem Videoinhalt. M.A.H.Jr. wird von NIH R35 GM138206 und als Searle Scholar unterstützt. H.P.M.N wird durch das Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32 GM008326) unterstützt. Wir möchten uns auch bei Bill Anderson, Charles Bowman und Dr. Gabriel Lander vom Scripps Research Institute für die Hilfe beim Entwerfen, Zusammenbauen und Testen des im Video gezeigten manuellen Kolbens bedanken.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Aufbewahrungsbox mit 4 Schlitzen | Ted Pella | 160-40 | |
| 14 Gauge flache Metall-Ausgabespitze | Amazon | B07M7YWWLT | |
| 22x22 mm quadratisches Glasdeckglas | Sigma | C9802-1PAK | |
| 60 mm Petrischale aus Glas zur Aufbewahrung von Gittern | Fisher | 08-747A | |
| 100 mm Petrischale aus Glas zur Aufbewahrung von Whatman-Papier | Fisher | 08-747D | |
| 150 mm Petrischale aus Glas zur Aufbewahrung von Whatman-Papier | Fisher | 08-747F | |
| 250 mL Becherglas | Fisher | 02-555-25B | |
| Blaues Styropor-Dewar | Spear Lab | FD-500 | |
| Ethangefäß aus Messing | Lasco | 17-4075 | |
| Klemmpinzette | Ted Pella | 38825 | |
| Zarte Arbeitstücher | Fisher | 06-666 | |
| Zweistufiger Regler mit Regelventil | Airgas | Y12N245D580-AG | |
| Dewer Gittersockel | UCSD | ||
| Ethanplattform | UCSD | ||
| Ethan Propantank | Praxair | ET PR50ZU-G | Ethan (50%) : Propan (50%) in einem Hochdrucktank |
| Ethantank | Praxair | UN1035 | Ethan (100%) |
| Flexibler Arm Arbeitsleuchte | Amscope | LED-11CR | |
| Gitter (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) | Elektronenmikroskopie Sciences | Q325AR1.3 | |
| Luftbefeuchter | Target | 719438 | |
| Hygrometer | ThermoPro | B01H1R0K68 | |
| Laborkittel | UCSD | ||
| Flüssigstickstoff Dewar | Worthington | LD4 | |
| Handschuhe mit flüssigem Stickstoff | Fisher | 19-059-925 | |
| Manueller Kolbenständer (schwarzer Ständer + Fußpedal) | UCSD | ||
| Mark 5 (Tauchplattform) | UCSD | ||
| Nitrilhandschuhe | VWR | 82026-424 | |
| P20 Pipette | Eppendorf | 13-690-029 | |
| PCR-Röhrchen | Eppendorf | ||
| Pipettenspitzen | ibis scientific | 63300005 | |
| Ringlampe | Amazon | B07HMR4H8G | |
| Schutzbrille | UCSD | ||
| Schere | Amazon | Fiskars 01-004761J | |
| Schraubendreher | Ironside | 354711 | |
| Tape | Fisher | 15-901-10R | |
| Pinzette zum Transfer Gitterbox | Amazon | LTS-3 | |
| Tygon Schlauch | Fisher | 14-171-130 | |
| Whatman Löschpapier | Fisher | 1001-090 |
Referenzen
- Hofmann, S., et al. Conformation Space of a Heterodimeric ABC Exporter under Turnover Conditions. Nature. 571 (7766), 580-583 (2019).
- Fica, S. M., Nagai, K. Cryo-Electron Microscopy Snapshots of....
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Nachdrucke und Genehmigungen
