허혈성 심장에서 유전자 치료의 효능을 평가하기 위한 거대 동물 모델

요약

허혈성 심장 질환에 대한 심근 유전자 치료는 미래 치료법에 대한 큰 가능성을 가지고 있습니다. 여기에서는 허혈성 심장에서 유전자 치료의 효능을 평가하기 위한 거대 동물 모델을 소개합니다.

초록

관상 동맥 질환은 전 세계적으로 사망률과 이환율의 중요한 원인 중 하나입니다. 현재 치료법의 진행에도 불구하고 관상 동맥 질환 환자의 상당 부분이 증상을 유지하고 있습니다. 유전자 요법 매개 치료 혈관신생은 심근 관류를 개선하고 증상을 완화하기 위한 새로운 치료 방법을 제공합니다. 다양한 혈관신생 인자를 이용한 유전자 요법은 몇 가지 임상 시험에서 연구되었습니다. 이 방법의 참신함으로 인해 심근 유전자 치료의 진행은 벤치에서 침대 옆으로 이어지는 연속적인 경로입니다. 따라서 안전성 및 효능을 평가하기 위해서는 대형 동물모델이 필요하다. 대형 동물 모델이 원래 질병과 클리닉에서 사용되는 종점을 더 많이 식별할수록 임상 시험에서 더 예측 가능한 결과를 얻을 수 있습니다. 여기에서는 허혈성 돼지 심장에서 유전자 치료의 효능을 평가하기 위한 거대 동물 모델을 소개합니다. 우리는 초음파 영상 및 ¹⁵H₂O-PET와 같은 임상 적으로 관련된 영상 방법을 사용합니다. 원하는 영역으로의 유전자 전달을 표적화하기 위해 전기해부학적 매핑이 사용됩니다. 이 방법의 목적은 (1) 만성 관상 동맥 질환을 모방하고, (2) 심장의 저산소 영역에서 치료 혈관신생을 유도하고, (3) 관련 종점을 사용하여 유전자 요법의 안전성과 효능을 평가하는 것입니다.

서론

관상동맥 질환은 전 세계적으로 사망률과 질병 부담의 막대한 부분을 차지합니다¹. 현재 치료 전략은 경피적 중재, 약리학적 치료, 우회 수술²이다. 그러나 이러한 현재 치료법의 발전에도 불구하고 많은 환자들이 소위 불응성 협심증을 앓고 있으며, 이는 새로운 치료법에 대한 충족되지 않은 필요성을 강조한다³. 유전자 치료 매개 치료 혈관신생은 이 환자 그룹을 표적으로 할 수 있습니다.

심근 유전자 치료는 가장 일반적으로 다른 바이러스 벡터, 가장 일반적으로 복제 결핍 아데노바이러스⁴를 사용하여 전달됩니다. 치료 유전자로서, 다양한 혈관신생 성장 인자들이 사용된다. 가장 실질적으로 연구된 혈관신생 성장인자는 혈관 내피 성장인자 수용체(VEGFRs)와 그 보조수용체를 통해 혈관신생 신호전달을 매개하는 혈관 내피 성장인자(VEGF)이다⁵. 여러 임상 시험에서 심장 유전자 치료의 이점과 안전성이 입증되었으며 이 새로운 치료 방법을 허혈성 심장 질환 치료를 위한 현실적인 옵션으로 만들었습니다 ^6....

프로토콜

여기에 제시된 실험은 약 10 주 된 암컷 국내 돼지를 사용하여 수행되며 핀란드 동물 실험위원회의 승인을 받았습니다. 프로토콜이 시작될 때 동물의 무게는 30-40kg이므로 인간과 동일한 절차 장비 및 이미징 방식을 허용합니다. 만성 허혈은 유전자 전달 14일 전에 유도되며, 유전자 전달 후 추적 관찰 시간은 사용된 바이러스 벡터에 따라 다릅니다. 연구 프로토콜은 그림 1에 나와 있습니다. 이 프로토콜은 아데노바이러스 또는 AAV 매개 유전자 요법 주사를 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 샘플 수집 시간은 사용된 바이러스 벡터에 따라 달라지는 이식유전자 발현 피크에 맞게 조정되어야 합니다. 예를 들어, 아데노바이러스 유전자 전달을 수행할 때 샘플 수집 시간은 유전자 전달 후 6일로 설정됩니다.

1. 약물 치료

1. 치명적인 심실 부정맥을 예방하기 위해 아미오다론 200mg과 비소프롤롤 2.5mg을 매일 투여하십시오. 약물은 허혈 수술 1주일 전에 시작하여 추적 관찰까지 매일 계속됩니다.
2. 또한, 스텐트 삽입 후 급성 스텐트 내 혈전증을 예방하기 위해 허혈 수술 1일 전에 동물에게 클로피도그렐(300mg)과 아세틸살리실산(300mg)을 경구 투여한다.
....

결과

허혈 수술의 성공 여부는 관상 동맥 조영술에 의해이 프로토콜과 유전자 전달을 진행하기 전에 경흉부 초음파 (그림 1)에 의해 저 운동 영역을 결정함으로써 확인할 수 있습니다. 관상동맥 폐색의 상태는 관상동맥 조영술로 평가할 수 있으며, 전기해부학적 매핑은 허혈성 및 동면 영역을 보장합니다.

유전자 치료의 효능은 15H2O-PET에 의한 원주 변형률, 박출률 및 심근 관류를 측정하여 분석할 수 있습니다(그림 3). 조직 샘플은 심장을 전기 해부학적 지도와 비교하여 유전자 전달 영역에서 직접 수집할 수 있습니다. 이식유전자 발현 및 치료적 혈관신생(도 4)은 베타-갈락토시다아제 염색 후 양성 세포 수를 분석하고, CD31 염색 후 심근모세혈관 면적을 분석하여 면역조직학적 분석을 통해 평.......

토론

이 프로토콜의 시점은 사용된 바이러스 벡터에 따라 수정될 수 있습니다. 또한, 면역조직학적 분석은 치료 유전자에 따라 선택될 수 있다. 필요한 경우 프로토콜에 더 많은 시점과 끝점을 추가할 수도 있습니다.

이 프로토콜은 성공에 필수적이며 나중에 수정할 수 없는 단계로 구성됩니다. 첫째, 적절한 허혈을 유도하지 못하면 동물을 추가 절차 및 분석에서 제외해야 합니다. 방법과 이미징의 표준화는 시점과 동물 간에 결과를 비교할 수 있도록 하는 데 중요합니다. 둘째, 정확한 유전자 전달 영역에서 샘플을 수집하고 추가 분석을 수행하기 위해 성공적으로 처리해야 합니다. 또한 이 프로토콜은 혈관 조영술 절차와 다양한 영상 양식에 대한 깊은 지식이 필요합니다. 예를 들어, 관상 동맥 조영술 및 박동 심장에 대한 바이러스 주사는 정확한 경흉부 심 초음파 검사뿐만 아니라 광범위한 훈련이 필요합니다. 그럼에도 불구하고 이러한 이미징 양식은 심근 기능과 관류를 측정하여 추가 연구를 위한 필수 정보를 제.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1 % PFA	VWR	VWRC28794.295	파라 포름 알데히드 분말로 준비
15 % 자당	VWR	VWRC27480.294	고체 자당으로 준비
4 % PFA	VWR	VWRC28794.295	파라 포름 알데히드 분말로 준비
5 F 땋은 머리 카테터	Cordis	534-550S
6 F 카테터 AR2	Cordis	670-112-00
6 F 도입 칼집	Cordis	504-606X
8 F 도입 칼집	Cordis	504-608X
아세틸 살리실산			다양한 생산자
Amiodarone			다양한 생산자
혈관 조영 스테이션	GE Healthcare
Angiolaboratory 세트	M ö lnlycke		우리의 angiolaboratory의 요구를 위해 설계, 멸균 커튼, 컵 및 면봉
포함 Bisoprolol			다양한 생산자
Cefuroxime			다양한 생산자
Clopidogrel			다양한 생산자
Coroflex 블루 스텐트	B.Braun Medical	5029012	카탈로그 번호는 스텐트 크기에 따라 다릅니다
Crile 겸자
Cyclotron	GE 헬스케어
도부타민			다양한 생산자
전기 해부학 매핑 시스템	생물제제 전달 시스템, Johnson & Johnson company
Enoxaparin			다양한 생산자
Fentanyl			다양한 생산자
심근 주사 카테터	Johnson &
요오드 조영제	Iomeron
부엌칼			다양한 생산자
리도카인			다양한 생산기
액체 질소			다양한 생산자
MgSO4			Varying 생산자
바늘 18 G	Cordis	12-004943
관류 펌프
PET-CT 스캐너	Siemens Healthcare
폴리테트라플루오로에틸렌 튜브
프로포폴			다양한 생산자
메스 no 11	VWR	SWAN0503
설하 이질산	Takeda
초음파 기계	Philips

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