JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

المجهر المباشر لإعادة البناء البصري العشوائي للحوالق خارج الخلية في ثلاثة أبعاد

Published: August 26, 2021
doi:
10.3791/62845
, ,
1Department of Microbiology and Immunology, Lineberger Comprehensive Cancer Center,The University of North Carolina at Chapel Hill School of Medicine

Summary

يستخدم المجهر المباشر لإعادة البناء البصري العشوائي (dSTORM) لتجاوز حد الحيود النموذجي للتنظير المجهري للضوء وعرض الاكسوسومات على مقياس النانومتر. ويمكن استخدامه في كل من البعدين وثلاثة لتوصيف exosomes.

Abstract

يتم تحرير الحويصلات خارج الخلية (EVs) من قبل جميع أنواع الخلايا وتلعب دورا هاما في إشارات الخلايا و التوازن. غالبا ما يتطلب تصور المركبات الكهربائية طرقا غير مباشرة بسبب قطرها الصغير (40-250 نانومتر) ، والذي هو تحت حد الحيود للتنظير الضوئي النموذجي. لقد طورنا تصورا فائق الدقة قائم على المجهر للمركبات الكهربائية لتجاوز حد الحيود في بعدين وثلاثة أبعاد على حد سواء. باستخدام هذا النهج، يمكننا حل شكل ثلاثي الأبعاد من المركبات الكهربائية إلى داخل +/- 20 نانومتر القرار على محور س ص و +/- 50 نانومتر القرار على طول المحور Z. في الختام، نقترح أن يعتبر الفحص المجهري فائق الدقة كطريقة توصيف للمركبات الكهربائية، بما في ذلك الإكسوسومات، وكذلك الفيروسات المغلفة.

Introduction

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي الحويصلات المرتبطة بالغشاء الصادرة عن جميع أنواع الخلايا. أنها تحتوي على الدهون والبروتينات والأيض والأحماض النووية ونقل هذه المواد محليا بين الخلايا وdistally بين الأنسجة والأعضاء. هناك ثلاثة أنواع فرعية أساسية من المركبات الكهربائية: الهيئات المبرمج، microvesicles، وإكسوسومات1،2. هنا، نركز مناقشتنا على الإكسوسومات والبروتينات المرتبطة بها.

يتم إفراز الحويصلات الخارجية الناشئة من الداخل الناشئة من الاندوسومات المبكرة في الجسم متعدد المركبات (MVB). ثم يندمج MVB مع غشاء البلازما ، ويطلق الإكسوسومات في الفضاء خارج الخلية للسفر إلى خلايا أخرى3،4. Exosomes موجودة على مجموعة من الأحجام تتراوح بين 40 إلى 150 نانومتر ويتم إثراء مع بروتينات ترانسممبران الاندوسومال المعروفة باسم tetraspanins (CD9، CD63، CD81)، مجمع الفرز الاندوسومالية المرتبطة بالغشاء المطلوبة للنقل (ESCRT)، والبروتينات المرتبطة طوف الدهون1،2،5،6،7.

أصبح توصيف التركيبة الكيميائية الحيوية للإكسوسومات مجالا شائعا للباحثين لفهم طبيعتهم الوظيفية بشكل أفضل. توجد العديد من الطرق لتصور وتميز exosomes ، بما في ذلك قياس التدفق النانوي ، وتحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) ، والمسح الضوئي ونقل المجهر الإلكتروني (TEM) ، وصدى البلازمون السطحي ، واستشعار النبض المقاوم ، والمجهر الخفيف التقليدي ، كل منها يحتوي على إيجابيات وسلبيات جوهرية8،9. TEM و cryo-EM يمكن تحقيق القرار القائم على نانومتر، ولكن غالبا ما تتطلب الجفاف وتجميد كسر الخطوات، وبالتالي تقليص أو lysing المركبات الكهربائية10،11. يعتمد NTA على تشتت الضوء ، مما يسمح بتحديد خصائص مئات المركبات الكهربائية في وقت واحد ، ولكنه قياس غير مباشر لحجم الجسيمات ولا يمكنه التمييز بسهولة بين المركبات الكهربائية والفيروساتومجاميع البروتين12و13و14و15و16. يستخدم قياس التدفق الخلوي النانوي الضوء المتناثر من مسار الإثارة ، والذي يمكن ترجمته بعد ذلك إلى قياسات الحجم ، ولكنه تقنية ناشئة ، وهناك القليل من الإجماع حول حجم الجسيمات ضمن النطاق الخطي للكشف عن الأدوات المختلفة12و17و18.

كان المجهر الخفيف التقليدي باستخدام البروتينات الفلورية أو الأصباغ أحد التقنيات الأكثر توظيفا لتصور المقصورات دون الخلوية ومجمعات البروتين وآلات الإشارات داخل الخلية. في حين أن هذه التقنية تثبت فائدتها في تصور توطين المجمعات ، فإن حد الحيود للتنظير المجهري الخفيف التقليدي (حوالي 250-400 نانومتر) يمنع الدقة الواضحة للبروتينات أو الهياكل في نطاق الحجم النموذجي للإكسوسوم (40-150 نانومتر)12،19،20.

المجهر فائق الدقة ، وهي المجهر المباشر لإعادة البناء البصري العشوائي (dSTORM) ، يميز نفسه عن المجهر الضوئي التقليدي من خلال توظيف الخصائص القابلة للضوء للفلوروفوريس المحددة والكشف عن هذه الأحداث الوامضة لإعادة بناء الصور وصولا إلى الدقة نانومتر21. يتم جمع أحداث Photoswitching باستخدام كاميرا كشف عالية الإطار على مدار عشرات الآلاف من التعرض الفردي ، ويتم استخدام وظيفة انتشار نقطة لرسم خريطة بثقة عالية الموقع الدقيق للفلوروفور الساحرللضوء 19،20،22. وهذا يسمح dSTORM لتجاوز الحد الحيود من المجهر الخفيفة. وأفادت عدة مجموعات استخدام تقنيات فائقة الدقة لتصور وتتبع exosomes والبروتينات المرتبطة بها22،23،24،25. يعتمد القرار النهائي على الخصائص الفيزيائية الحيوية للفلوروفور ، ولكنه يتراوح في كثير من الأحيان من +/-10-100 نانومتر على طول محور XY ، مما يسمح بدقة جزيء واحد.

القدرة على حل الفلوروفوريس الفردية على هذا النطاق على محور XY قد أحدثت ثورة في المجهر. ومع ذلك ، هناك القليل من البيانات عن ثلاثي الأبعاد (3 – D) dSTORM من exosome. لذلك ، سعينا إلى إنشاء إجراء تشغيل قياسي (SOP) للتصور القائم على dSTORM وتوصيف المركبات الكهربائية النقية ، بما في ذلك exosomes إلى الدقة نانومتر في 3-D.

Protocol

1 نشر وصيانة خطوط الخلايا الحصول على خلايا هشاشة العظام البشرية (U2OS) ووضع الخلايا في المتوسط النمو تستكمل مع 10٪ خالية من المصل البقري الجنين و1x البنسلين / Streptomycin الحل.ملاحظة: تم إنشاء مصل الأبقار الجنينية الخالية من Exosome بعد البروتوكول المقدم في مكنمارا وآخرون. آل26. <l…

Representative Results

كان الهدف من هذه الدراسة تقييم فعالية المجهر فائق الدقة في تصور المركبات الكهربائية الفردية بدقة نانومتر في ثلاثة أبعاد (ثلاثي الأبعاد). لتحليل شكل وحجم المركبات الكهربائية الفردية، قمنا بتوظيف صبغة قابلة للسحر الضوئي واحتضان المركبات الكهربائية بصبغة حمراء بعيدة التشفير، وإزالة الصبغ?…

Discussion

أصبحت المركبات الكهربائية مجال الدراسة شعبية نظرا لدورها الهام في العديد من العمليات داخل الخلايا والخلايا إلى الخلية الإشارات1،30. ومع ذلك ، فإن تصورها يثبت أن يكون صعبا كما حجمها الصغير يقع تحت الحد الحيود من المجهر الخفيفة. المباشرة الاستوشاستيك البصرية…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نود أن نشكر أكسفورد Nanoimaging على ردود فعلهم البناءة والتوجيه. تم تمويل هذا العمل من قبل 5UM1CA121947-10 إلى R.P.M و1R01DA040394 إلى D.P.D.

Materials

15 µ-Slide 8 well plates Ibidi 80827
1X PBS Gibco 14190-144
1X Penicillin Streptomycin solution Gibco 15140-122
50 mL conical tube Thermo Fisher 339652
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus Genesee 25-227
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter Cytiva 29-0142-95
AKTA Flux S Cytiva 29-0384-37
AKTA Start Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetic beads Thermo Fisher 10616D
B-cubed buffer ONI  BCA0017
CellMask Red Thermo Fisher C10046
Dubelco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher 10566016
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
Frac 30 Fraction collector Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0 Thermo Fisher BP381-5
HiTrap CaptoCore 700 Column Cytiva 17548151
Molecular Biology Grade Water Corning 9820003
Nanoimager Oxford Nanoimaging Custom
Paraformaldehhyde Electron Microscopy Sciences 15710
Polyethylene glycol Thermo Fisher BP233-1
RNase A Promega A797C
T175 Flasks Genesee 25-211
Tetraspek microspheres Invitrogen T7279
Tris- HCl pH=7.5 Thermo Fisher BP153-1
Unicorn V Cytiva 29022094-ECOMINSSW
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annual Review of Biochemistry. 88, 487-514 (2019).
  2. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  3. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  4. Cocozza, F., Grisard, E., Martin-Jaular, L., Mathieu, M., Théry, C. SnapShot: Extracellular vesicles. Cell. 182 (1), 262 (2020).
  5. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  6. McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Extracellular vesicles in virus infection and pathogenesis. Current Opinion in Virology. 44, 129-138 (2020).
  7. Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
  8. Akers, J. C., et al. Comparative analysis of technologies for quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF). PLoS One. 11 (2), 0149866 (2016).
  9. Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
  10. Emelyanov, A., et al. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles from cerebrospinal fluid. PLoS One. 15 (1), 0227949 (2020).
  11. Noble, J. M., et al. Direct comparison of optical and electron microscopy methods for structural characterization of extracellular vesicles. Journal of Structural Biology. 210 (1), 107474 (2020).
  12. Panagopoulou, M. S., Wark, A. W., Birch, D. J. S., Gregory, C. D. Phenotypic analysis of extracellular vesicles: a review on the applications of fluorescence. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1710020 (2020).
  13. Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
  14. Carnell-Morris, P., Tannetta, D., Siupa, A., Hole, P., Dragovic, R. Analysis of extracellular vesicles using fluorescence nanoparticle tracking analysis. Methods in Molecular Biology. 1660, 153-173 (2017).
  15. Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
  16. Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis – An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016 (2019).
  17. Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming limitations of microparticle measurement by flow cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (8), 807-818 (2010).
  18. Lannigan, J., Erdbruegger, U. Imaging flow cytometry for the characterization of extracellular vesicles. Methods. 112, 55-67 (2017).
  19. Magenau, A., Gaus, K. 3D super-resolution imaging by localization microscopy. Methods in Molecular Biology. 1232, 123-136 (2015).
  20. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  21. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
  22. Chen, C., et al. Imaging and intracellular tracking of cancer-derived exosomes using single-molecule localization-based super-resolution microscope. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (39), 25825-25833 (2016).
  23. Grant, M. J., Loftus, M. S., Stoja, A. P., Kedes, D. H., Smith, M. M. Superresolution microscopy reveals structural mechanisms driving the nanoarchitecture of a viral chromatin tether. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4992-4997 (2018).
  24. Nizamudeen, Z., et al. Rapid and accurate analysis of stem cell-derived extracellular vesicles with super resolution microscopy and live imaging. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865 (12), 1891-1900 (2018).
  25. Shen, X., et al. 3D dSTORM imaging reveals novel detail of ryanodine receptor localization in rat cardiac myocytes. The Journal of Physiology. 597 (2), 399-418 (2019).
  26. McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).
  27. Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Swartzendruber, J. A., Kaminski, A. Anaerobic growth and maintenance of mammalian cell lines. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).
  28. Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Science Reports. 7 (1), 11561 (2017).
  29. Mönkemöller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 16 (24), 12576-12581 (2014).
  30. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  31. Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
  32. Hu, Y. S., Cang, H., Lillemeier, B. F. Superresolution imaging reveals nanometer- and micrometer-scale spatial distributions of T-cell receptors in lymph nodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7201-7206 (2016).
  33. Jayasinghe, I., et al. True molecular scale visualization of variable clustering properties of ryanodine receptors. Cell Reports. 22 (2), 557-567 (2018).
  34. Eggert, D., Rösch, K., Reimer, R., Herker, E. Visualization and analysis of hepatitis C virus structural proteins at lipid droplets by super-resolution microscopy. PLoS One. 9 (7), 102511 (2014).
  35. Mazloom-Farsibaf, H., et al. Comparing lifeact and phalloidin for super-resolution imaging of actin in fixed cells. PLoS One. 16 (1), 02246138 (2021).
  36. Huang, B., Jones, S. A., Brandenburg, B., Zhuang, X. Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution. Nature Methods. 5 (12), 1047-1052 (2008).
  37. McNamara, R. P., et al. Nef secretion into extracellular vesicles or exosomes is conserved across human and simian immunodeficiency viruses. mBio. 9 (1), 02344 (2018).
  38. Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
  39. Kalies, S., Kuetemeyer, K., Heisterkamp, A. Mechanisms of high-order photobleaching and its relationship to intracellular ablation. Biomedical Optics Express. 2 (4), 805-816 (2011).
  40. Mönkemöller, V., Øie, C., Hübner, W., Huser, T., McCourt, P. Multimodal super-resolution optical microscopy visualizes the close connection between membrane and the cytoskeleton in liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. Scientific Reports. 5, 16279 (2015).
  41. Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81, 1-27 (2017).
  42. Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution microscopy approaches for live cell imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
  43. Azuma, T., Kei, T. Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment. Optics Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).
  44. Hurwitz, S. N., et al. CD63 regulates Epstein-Barr Virus LMP1 exosomal packaging, enhancement of vesicle production, and noncanonical NF-κB signaling. Journal of Virology. 91 (5), 02251 (2017).
  45. Hurwitz, S. N., Cheerathodi, M. R., Nkosi, D., York, S. B., Meckes, D. G. Tetraspanin CD63 bridges autophagic and endosomal processes to regulate exosomal secretion and intracellular signaling of Epstein-Barr Virus LMP1. Journal of Virology. 92 (5), 01969 (2018).
  46. Bukong, T. N., Momen-Heravi, F., Kodys, K., Bala, S., Szabo, G. Exosomes from hepatitis C infected patients transmit HCV infection and contain replication competent viral RNA in complex with Ago2-miR122-HSP90. PLoS Pathogens. 10 (10), 1004424 (2014).
  47. Khan, M. B., et al. Nef exosomes isolated from the plasma of individuals with HIV-associated dementia (HAD) can induce Aβ(1-42) secretion in SH-SY5Y neural cells. J Neurovirology. 22 (2), 179-190 (2016).
  48. Lee, J. H., et al. HIV-Nef and ADAM17-containing plasma extracellular vesicles induce and correlate with immune pathogenesis in chronic HIV infection. EBioMedicine. 6, 103-113 (2016).
  49. Meckes, D. G., et al. Modulation of B-cell exosome proteins by gamma herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2925-2933 (2013).
  50. Raymond, A. D., et al. Microglia-derived HIV Nef+ exosome impairment of the blood-brain barrier is treatable by nanomedicine-based delivery of Nef peptides. Journal of Neurovirology. 22 (2), 129-139 (2016).
  51. Raab-Traub, N., Dittmer, D. P. Viral effects on the content and function of extracellular vesicles. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 559-572 (2017).
  52. Feng, Z., et al. A pathogenic picornavirus acquires an envelope by hijacking cellular membranes. Nature. 496 (7445), 367-371 (2013).
  53. Bandopadhyay, M., Bharadwaj, M. Exosomal miRNAs in hepatitis B virus related liver disease: a new hope for biomarker. Gut Pathogens. 12, 23 (2020).
  54. Hurwitz, S. N., et al. Proteomic profiling of NCI-60 extracellular vesicles uncovers common protein cargo and cancer type-specific biomarkers. Oncotarget. 7 (52), 86999-87015 (2016).
  55. Rodrigues, M., Fan, J., Lyon, C., Wan, M., Hu, Y. Role of extracellular vesicles in viral and bacterial infections: Pathogenesis, diagnostics, and therapeutics. Theranostics. 8 (10), 2709-2721 (2018).

Tags

Keywords: Extracellular VesiclesDSTORMSuper-resolution MicroscopyThree-dimensional VisualizationVirus ParticlesDisease BiomarkersAffinity PurificationParaformaldehyde FixationImaging BufferCalibration Beads
check_url/62845?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Chambers, M. G., McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions. J. Vis. Exp. (174), e62845, doi:10.3791/62845 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image