Microscopie à reconstruction optique stochastique directe de vésicules extracellulaires en trois dimensions
Summary
La microscopie à reconstruction optique stochastique directe (dSTORM) est utilisée pour contourner la limite de diffraction typique de la microscopie optique et pour visualiser les exosomes à l’échelle nanométrique. Il peut être utilisé en deux et trois dimensions pour caractériser les exosomes.
Abstract
Les vésicules extracellulaires (VE) sont libérées par tous les types de cellules et jouent un rôle important dans la signalisation cellulaire et l’homéostasie. La visualisation des véhicules électriques nécessite souvent des méthodes indirectes en raison de leur petit diamètre (40-250 nm), qui est inférieur à la limite de diffraction de la microscopie optique typique. Nous avons développé une visualisation des véhicules électriques basée sur la microscopie à super-résolution pour contourner la limite de diffraction en deux et trois dimensions. En utilisant cette approche, nous pouvons résoudre la forme tridimensionnelle des véhicules électriques à une résolution de +/- 20 nm sur l’axe XY et à une résolution de +/- 50 nm le long de l’axe Z. En conclusion, nous proposons que la microscopie à super-résolution soit considérée comme une méthode de caractérisation des VE, y compris les exosomes, ainsi que des virus enveloppés.
Introduction
Les vésicules extracellulaires (VE) sont des vésicules liées à la membrane libérées par tous les types de cellules. Ils contiennent des lipides, des protéines, des métabolites et des acides nucléiques et transfèrent ces matériaux localement entre les cellules et distalement entre les tissus et les organes. Il existe trois sous-types primaires de VE : les corps apoptotiques, les microvésicules et les exosomes1,2. Ici, nous concentrons notre discussion sur les exosomes et leurs protéines associées.
Les exosomes sont des vésicules sécrétées provenant du bourgeonnement vers l’intérieur des endosomes précoces dans le corps multivésiculeux (MVB). Le MVB fusionne ensuite avec la membrane plasmique, libérant les exosomes dans l’espace extracellulaire pour se déplacer vers d’autres cellules3,4. Les exosomes existent sur un spectre de tailles allant de 40 à 150 nm et sont enrichis de protéines transmembranaires endosomales appelées tétraspanines (CD9, CD63, CD81), de complexe de tri endosomal lié à la membrane nécessaire au transport (ESCRT) et de protéines associées au radeau lipidique1,2,5,6,7.
La caractérisation de la composition biochimique des exosomes est devenue un domaine populaire pour les chercheurs afin de mieux comprendre leur nature fonctionnelle. De nombreuses méthodes existent pour visualiser et caractériser les exosomes, y compris la cytométrie en flux à l’échelle nanométrique, l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA), la microscopie électronique à balayage et à transmission (TEM), la résonance plasmonique de surface, la détection d’impulsions résistives et la microscopie optique traditionnelle, chacune contenant des avantages et des inconvénients intrinsèques8,9. Tem et cryo-EM peuvent atteindre une résolution basée sur le nanomètre, mais nécessitent souvent des étapes de déshydratation et de congélation-rupture, rétrécissant ou lysant ainsi les VÉHICULESélectriques 10,11. NTA repose sur la diffusion de la lumière, permettant la caractérisation de centaines de VE à la fois, mais est une mesure indirecte de la taille des particules et ne peut pas facilement distinguer entre les VE, les virus et les agrégats de protéines12,13,14,15,16. La cytométrie en flux à l’échelle nanométrique utilise la diffusion de la lumière à partir d’un chemin d’excitation, qui peut ensuite être traduite en mesures de taille, mais il s’agit d’une technologie émergente, et il existe peu de consensus sur la taille des particules dans la plage linéaire de détection pour divers instruments12,17,18.
La microscopie optique traditionnelle utilisant des protéines ou des colorants fluorescents a été l’une des techniques les plus utilisées pour visualiser les compartiments subcellulaires, les complexes protéiques et les mécanismes de signalisation au sein d’une cellule. Bien que cette technique s’avère utile pour visualiser la localisation des complexes, la limite de diffraction de la microscopie optique traditionnelle (environ 250-400 nm) empêche la résolution claire des protéines ou des structures dans la gamme de taille typique d’un exosome (40-150 nm)12,19,20.
La microscopie à super-résolution, à savoir la microscopie à reconstruction optique stochastique directe (dSTORM), se distingue de la microscopie optique conventionnelle en utilisant les propriétés photoscommutables de fluorophores spécifiques et en détectant ces événements clignotants pour reconstruire des images jusqu’à une précision nanométrique21. Les événements de commutation de photos sont collectés à l’aide d’une caméra de détection à fréquence d’images élevée au cours de dizaines de milliers d’expositions individuelles, et une fonction d’étalement de points est utilisée pour cartographier avec une grande confiance l’emplacement exact du fluorophore de commutation de photos19,20,22. Cela permet à dSTORM de contourner la limite de diffraction de la microscopie optique. Plusieurs groupes ont signalé l’utilisation de techniques de super-résolution pour visualiser et suivre les exosomes et leurs protéines associées22,23,24,25. La résolution finale dépend des propriétés biophysiques du fluorophore, mais varie souvent de +/-10 à 100 nm le long de l’axe XY, ce qui permet une résolution à molécule unique.
La capacité de résoudre les fluorophores individuels à cette échelle sur l’axe XY a révolutionné la microscopie. Cependant, il existe peu de données sur le dSTORM tridimensionnel (3D) d’un exosome. Par conséquent, nous avons cherché à établir une procédure d’exploitation standard (SOP) pour la visualisation et la caractérisation basées sur dSTORM des véhicules électriques purifiés, y compris les exosomes à la précision nanométrique en 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les VE sont devenus un domaine d’étude populaire en raison de leur rôle important dans de nombreux processus intracellulaires et la signalisation de cellule à cellule1,30. Cependant, leur visualisation s’avère difficile car leur petite taille tombe en dessous de la limite de diffraction de la microscopie optique. La microscopie à reconstruction optique stochastique directe (dSTORM) est une méthode directe de visualisation qui contourne la limite de diff…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Oxford Nanoimaging pour ses commentaires constructifs et ses conseils. Ce travail a été financé par le 5UM1CA121947-10 à R.P.M. et le 1R01DA040394 à D.P.D.
Materials
| 15 µ-Slide 8 well plates | Ibidi | 80827 | |
| 1X PBS | Gibco | 14190-144 | |
| 1X Penicillin Streptomycin solution | Gibco | 15140-122 | |
| 50 mL conical tube | Thermo Fisher | 339652 | |
| 500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus | Genesee | 25-227 | |
| 750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter | Cytiva | 29-0142-95 | |
| AKTA Flux S | Cytiva | 29-0384-37 | |
| AKTA Start | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
| Anti-CD81 magnetic beads | Thermo Fisher | 10616D | |
| B-cubed buffer | ONI | BCA0017 | |
| CellMask Red | Thermo Fisher | C10046 | |
| Dubelco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Frac 30 Fraction collector | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
| Glycine pH=2.0 | Thermo Fisher | BP381-5 | |
| HiTrap CaptoCore 700 Column | Cytiva | 17548151 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 9820003 | |
| Nanoimager | Oxford Nanoimaging | Custom | |
| Paraformaldehhyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyethylene glycol | Thermo Fisher | BP233-1 | |
| RNase A | Promega | A797C | |
| T175 Flasks | Genesee | 25-211 | |
| Tetraspek microspheres | Invitrogen | T7279 | |
| Tris- HCl pH=7.5 | Thermo Fisher | BP153-1 | |
| Unicorn V | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW |
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