Bioluminescens-lys udsendt af et luciferaseenzym, der oxiderer et lille molekylesubstrat, et luciferin-kan udnyttes til at aktivere fotosensoriske proteiner og derved tilføje en anden dimension til lysstimulering og muliggøre manipulation af en lang række lysmedierede funktioner i celler på tværs af tidsmæssige og rumlige skalaer.
Bioluminescens – lys udsendt af et luciferaseenzym, der oxiderer et lille molekylesubstrat, et luciferin – er blevet brugt in vitro og in vivo til at aktivere lysporterede ionkanaler og pumper i neuroner. Mens denne bioluminescerende optogenetik (BL-OG) tilgang giver en kemogenetisk komponent til optogenetiske værktøjer, er den ikke begrænset til brug i neurovidenskab. Snarere kan bioluminescens udnyttes til at aktivere ethvert fotosensorisk protein, hvilket muliggør manipulation af en lang række lysmedierede funktioner i celler. En række luciferase-luciferinpar kan matches med fotosensoriske proteiner, der kræver forskellige bølgelængder af lys og lysintensiteter.
Afhængigt af den specifikke anvendelse kan effektiv lyslevering opnås ved anvendelse af luciferase-fotoreceptorfusionsproteiner eller ved simpel co-transfektion. Fotosensoriske proteiner baseret på lysafhængig dimerisering eller konformationsændringer kan drives af bioluminescens for at påvirke cellulære processer fra proteinlokalisering, regulering af intracellulære signalveje til transkription. Protokollen nedenfor beskriver den eksperimentelle udførelse af bioluminescensaktivering i celler og organismer og beskriver resultaterne ved hjælp af bioluminescensdrevne rekombinaser og transkriptionsfaktorer. Protokollen giver efterforskerne de grundlæggende procedurer for udførelse af bioluminescerende optogenetik in vitro og in vivo. De beskrevne tilgange kan udvides yderligere og individualiseres til en lang række forskellige eksperimentelle paradigmer.
Fotosensoriske proteiner kan aktiveres af lys fra enten en fysisk lyskilde eller fra et luciferaseenzym i nærværelse af dets substrat, luciferin, for at generere bioluminescens. For applikationer, der kræver milli- eller endda femtosekund-tidsskalaer og / eller rumlig opløsning med en enkelt celle, er fysiske lyskilder (lasere og lysemitterende dioder (LED’er)) de eneste, der kan indstilles til disse skalaer. Eksempler er den rumlige begrænsning af lys, der anvendes til at stimulere modsatte poler i udviklingen af Drosophila larver med millisekund tidsmæssig kontrol1 eller den præcise stimulering af enkelte subcellulære strukturer såsom mitokondrielle tubuli2. Imidlertid har mange andre applikationer til optiske kontakter forskellige prioriteter, herunder udvidet rumlig kontrol og gentagen anvendelse ikke-invasivt og uden lysskader, men med defineret tidsmæssig kontrol i minuttidsskalaer og justerbare intensiteter. Her har det flere fordele at bruge luciferaser som en alternativ lyskilde til at aktivere lysfølende domæner. I modsætning til aktivering af optisk fiberlys når bioluminescens hvert lysfølsomt domæne udtrykt i målcellepopulationen, da lyskilden er genetisk kodet. Brug af bioluminescens lindrer bekymringer over vævs- og celleskader ved fiberoptik og udvidet fysisk lyseksponering. Lyset tændes ved påføring af luciferasesubstratet. Starten er øjeblikkelig in vitro og in vivo afhængigt af administrationsvejen og varer i ~ 15-30 minutter; udvidet tilstedeværelse eller fasisk stimulering af lys kan opnås med forskellige luciferiner og med yderligere eller gentagne anvendelser af substrat3. Endelig kan bioluminescensemission indstilles ved at variere koncentrationen af luciferin.
Anvendelsen af bioluminescens til at aktivere ionbevægelige fotoreceptorer, dvs. optogenetiske elementer, såsom kanalhodopsiner eller pumper, er blevet påvist i vid udstrækning4,5,6,7,8. Denne BioLuminescerende OptoGenetics (BL-OG) tilgang er blevet anvendt i in vivo-eksperimenter i mus og rotter5,6,7,9,10,11,12. BL-OG-aktivering af opsiner viste sig at kræve en mængde bioluminescens på mindst ~ 33 μW / mm2, hvor effektiviteten af aktiveringen steg med højere lysemission6,9. Ionbevægelige sensoriske fotoreceptorer er en undergruppe af det store kontingent af sensoriske fotoreceptorer, der findes i naturen, og som ikke bevæger sig ion13,14. Udvidelsen af bioluminescens til at aktivere ikke-ion-bevægelige fotoreceptorer, såsom fotosenserende domæner fra planter eller bakterier, tilskyndes af rapporter15,16 om, at fotosensorer, der ikke bevæger sig i ion, er betydeligt mere lysfølsomme end kanaliseringshodopsiner, hvilket sikrer et endnu bedre drev af lyssensorer med bioluminescens end allerede opnået med ionbevægelige optogenetiske elementer. For nylig rapporterede flere publikationer brugen af bioluminescens som lyskilde til aktivering af en række fotoreceptorer, herunder lys-ilt-spænding-sensing (LOV) domæner, blå-lys-using-flavin (BLUF) domæner, og kryptokromer (CRY’er)3,17,18,19,20,21,22 (tabel 1 ). Anvendelser til bioluminescensdrevet aktivering af optiske kontakter målrettede intracellulære processer, der spænder fra reaktiv iltartsinduceret celledød, cAMP-syntese, proteinrekruttering og dissociation til genomisk rekombination og induktion af transkription.
Denne protokol skitserer det generelle design af bioluminescensdrevne optogenetiske værktøjer og beskriver procedurerne for eksperimentel udførelse af bioluminescensaktivering i celler og organismer. Den indeholder beskrivelser af, hvordan man opretter et rum, en vævskulturhætte og inkubator og et mikroskop til arbejde med bioluminescens samt trinene fra forberedelse af luciferin til påføring af det. Denne protokol giver efterforskerne de grundlæggende procedurer for udførelse af bioluminescerende optogenetik (BL-OG) in vitro og in vivo. De beskrevne tilgange kan udvides yderligere og individualiseres til forskellige eksperimentelle paradigmer. Vi forventer, at denne protokol vil lette vedtagelsen af brugen af bioluminescens i optogenetiske biologiske undersøgelser.
Der er en række luciferaser og luciferiner med lysemissionsbølgelængder, der matcher aktiveringsspektrene for fotosensoriske proteiner fra blåt til rødt lys14,29. Bortset fra at justere emissions- og excitationsbølgelængder er der ingen pålidelig måde at bestemme a priori, hvilken parring der fungerer bedst. Således er behovet for eksperimentelt at bestemme, hvordan luciferin-luciferase-par fungerer i celler og organismer i kørsel af fotosensoriske systemer.
Protokollerne skitseret i denne præsentation beskriver, hvordan man forbereder luciferin, og hvordan man anvender det in vitro og in vivo sammen med retningslinjer for opsætning af rum, vævskulturhætter, inkubatorer og mikroskoper til eksperimenter, der anvender bioluminescens. I de repræsentative eksperimenter blev der anvendt forskellige luciferaser (NanoLuc, Gaussia luciferase) med flere fotosensoriske proteiner (CRY / CIB, EL222, VVD, LOV), der demonstrerede virkningerne af bioluminescens versus fysisk lys, co-transfektion versus fusionsproteiner, signal-til-støj-sammenligninger og forskellige udlæsningsassays. Flere anvendelser af bioluminescensaktiverende fotosensoriske proteiner er beskrevet i publikationer fra flere grupper, der er målrettet mod induktion af celledød, cAMP-syntese og proteinbevægelse ud over transkription (tabel 1).
Blot at co-transfektere lysemitterende og lysfølende komponenter er en god start. Variabler er de molære forhold mellem emitter og sensor; ukendte er baggrundsniveauer for sensoraktivitet i mørke, sensoraktivitet i forhold til lysintensitet og varighed og effektiviteten af sensoraktivering, der sammenligner fysisk og biologisk lys. Mens fusionskonstruktioner har den fordel, at de holder det molære forhold mellem emitter og sensor på 1:1 og bringer lysemitteren tæt på lyssensordomænet, spiller andre overvejelser ind, såsom hvor man skal binde (N- eller C-terminus), og hvordan man forbinder (linkerlængde og sammensætning) uden at påvirke den fotosensoriske aktuators ydeevne.
For forsøg både in vitro og in vivo er der flere muligheder for at indstille bioluminescerende lysemission, enten ved at variere koncentrationen af luciferinein og/eller ved at variere den tid, luciferinen stilles til rådighed for den respektive sensor. Minimumsmængden og -tiden bestemmes af tilstedeværelsen eller fraværet af den forventede effekt med lysaktivering. I modsætning hertil bestemmes de respektive maks.um hovedsageligt af cellernes tolerance over for høje koncentrationer af luciferin over længere tid. Koncentrationen af CTZ valgt i ovenstående eksempler, 100 μM, er tæt på den øvre grænse for forskellige celletyper, fra HEK293-celler til neuroner. Målet er at bruge så lav en koncentration som muligt i kortest mulig tid for at opnå aktivering af det målrettede fotosensingdomæne. Dette vil blive opnået lettere ved hjælp af luciferaser med høj lysemission og fotoreceptorer med høj lysfølsomhed.
Bioluminescens til kørsel af fotoreceptorer er blevet anvendt i gnavere (mus, rotter) med fotosenserende proteiner udtrykt i leveren, musklen, rygmarven og hjernen samt via fotoreceptorekspressorceller transplanteret subkutant eller intraperitonealt. I princippet er der ingen grænser, der forhindrer tilgangen i at blive anvendt på forskellige arter, fra ikke-menneskelige primater til fisk eller fluer. Afhængigt af organismens permeabilitet for luciferin kan anvendelsen være lige så let som at påføre luciferinen på det omgivende vand (f.eks. i fiskelarver30). Før BL-OG anvendes i en ny organisme, skal der udføres pilotforsøg for at sikre, at luciferinen når sine mål via den valgte anvendelsesvej.
Kritiske aspekter af det eksperimentelle design er de forskellige kontroller, der er vigtige for fortolkningen af resultaterne. Celler, der udtrykker en reporter drevet af en luciferase, der virker på et fotosensorisk protein, bør sammenlignes med celler, der mangler luciferase eller mangler det fotosensoriske protein. Desuden bør der foretages sammenligninger mellem celler, der udsættes for luciferin, køretøj eller holdes i mørke. Det er også vigtigt at indse begrænsningerne ved forskellige assays til vurdering af virkningerne af bioluminescensdrevet fotoreceptoraktivering. For eksempel kan effekten af bioluminescensaktiveret transkription testes på forskellige måder, afhængigt af om reportergenet er en ortogonal luciferase (luminometer, IVIS) eller et fluorescerende protein (fluorescensaktiveret cellesortering, mikroskopi billedanalyse). Selv om de grundlæggende virkninger bør kunne reproduceres på tværs af testplatforme, kan de kvantitative aspekter af virkningerne variere betydeligt.
Bioluminescensaktiveringen af fotoreceptorer er hidtil blevet påvist for et begrænset antal luciferaser og fotosensoriske proteiner, både in vitro og in vivo. Det kan udvides til den store klasse af fotoreceptorer til aktivering af mange flere biologiske processer. En sådan udvidelse af tilgangen fremmes yderligere af den kontinuerlige udvikling af nye luciferaser og luciferase-fluorescensproteinpar med meget højere lysemission end naturligt forekommende luciferaser og med kinetiske træk, der kan indstilles til forskellige anvendelser. Disse fremskridt er parallelle med generationen af nye luciferiner, hvilket yderligere øger lysstyrken og farvepaletterne29. Denne værktøjsplatform tilbyder applikationer til at manipulere og undersøge intracellulær dynamik og celleinteraktioner inde i levende celler, væv og organismer.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker vores kolleger for konstruktioner, specifikt A. Ting for Ca-FLARE-proteasen, transkriptionsfaktoren og reporteren (Addgene # 92214, 92213, 92202), H. Kwon for TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16 og NES-CRY2PHR-TevC (Addgene # 89878, 89877), C. Tucker for CRY-GalΔDD (B1013) og CIB-VP64 (B1016) (Addgene # 92035, 92037), M. Walsh for pGL2-GAL4-UAS-Luc (Addgene #33020), K. Gardner for VP-EL222 og C120-Fluc og A. Cetin og H. Zeng for at gøre iCreV tilgængelig inden offentliggørelsen. Dette arbejde blev støttet af bevillinger fra NSF (NeuroNex 1707352), NIH (U01NS099709), W.M. Keck Foundation og det svenske forskningsråd til A.B. (2016-06760).
ABI 25W Deep Red 660 nm LED Light Bulb | Amazon | to be used with any lamp stand | |
Black Microcentrifuge Tubes, 0.5 mL, Argos Technologies | Fisher Scientific | 03-391-166 | |
Black Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL, Argos Technologies | Fisher Scientific | 03-391-161 | |
Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric (1.5 m x 2.7 m) x 0.12 mm (thick) | THOR LABS | BK-5 | |
C120-Fluc | K. Gardner | ||
CaCl2 | Sigma | C8106; CAS: 10035-04-8 | |
Ca-FLARE protease, transcription factor and reporter | Addgene # 92214, 92213, 92202 | A. Ting | |
CIB-VP64 (B1016) | Addgene # 92037 | C. Tucker | |
CRY-GalΔDD (B1013) | Addgene # 92035 | C. Tucker | |
CTZ | Prolume Inc. (NanoLight) | 303 | formulation for in vitro applications with Gaussia luciferases |
CTZ (Water soluble native coelenterazine) | Prolume Inc. (NanoLight) | 3031 | formulation for in vivo applications with Gaussia luciferases |
D-(+)-Glucose | Sigma | G8270; CAS: 50-99-7 | |
D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechnology | LUCK | |
DMEM | Thermo Fisher | 11960044 | |
D-PBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher | 14190144 | |
hCTZ | Prolume Inc. (NanoLight) | 301 | formulation for in vitro applications with Oplophorus luciferases |
HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
HeLa | ATCC | CCL-2 | |
HEPES | Sigma | H3375; CAS: 7365-45-9 | |
iCreV | A. Cetin and H. Zeng | ||
In Vivo Imaging System (IVIS) | Perkin-Elmer | Lumina LT | |
KCl | Sigma | P5405; CAS: 7447-40-7 | |
LED Array Driver | Amuza | LAD-1 | |
LED Array for Multiwell Plates | Amuza | LEDA-x | |
Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent |
Luminometer | Molecular Devices | SpectraMax L | |
MgCl2 Hexahydrate | Sigma | M2670; CAS: 7791-18-6 | |
NaCl | Sigma | S7653; CAS: 7647-14-5 | |
NanoFuel Solvent | Prolume Inc. (NanoLight) | 399 | for dissolving CTZ preparations for in vitro use |
NaOH | Sigma | 221465; CAS: 1310-73-2 | |
NES-CRY2PHR-TevC | Addgene # 89877 | H. Kwon | |
Opti-MEM | Thermo Fisher | 11058021 | transfection medium |
PDL coated coverslips (12 mm, 15 mm, 18 mm) | Neuvitro Corporation | GG-12-PDL, GG-15-PDL , GG-18-PDL | |
pGL2-GAL4-UAS-Luc | Addgene #33020 | M. Walsh | |
Prizmatix USB Pulser TTL Generator for Optogenetics | Goldstone Scientific | ||
TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16 | Addgene # 89878 | H. Kwon | |
TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
Vehicle (Water-soluble carrier without CTZ) | Prolume Inc. (NanoLight) | 3031C | control for in vivo applications with CTZ |
VP-EL222 | K. Gardner |