Vi udviklede en praktisk protokol og analytisk tilgang til evaluering af mitokondrieoxidativ fosforylering og elektronoverførselskapacitet i friske tumor homogenater. Denne protokol kan let tilpasses til at undersøge forskellige mitokondrie funktioner, der bidrager til kræft indledning, progression, og behandling respons.
Mitokondrier er afgørende for udbrud og progression af kræft gennem energiproduktion, reaktiv ilt arter regulering, og makromolekyle syntese. Genetiske og funktionelle tilpasninger af mitokondrier til tumormiljøet drev proliferativt og metastatisk potentiale. Fremkomsten af DNA og RNA sekventering fjernet kritiske barrierer for evaluering af genetiske mæglere af tumorigenese. Men til dato, metodiske tilgange til evaluering tumor mitokondrie funktion forbliver undvigende og kræver tekniske færdigheder begrænse gennemførligheden, i sidste ende faldende diagnostiske og prognostiske værdi i både eksperimentelle og kliniske indstillinger. Her skitserer vi en enkel og hurtig metode til at kvantificere oxidativ fosforylering (OXPHOS) og elektronoverførselskapacitet (ET) i friskudskårne faste tumor homogenater ved hjælp af høj opløsning respirometri. Protokollen kan reproducibly anvendes på tværs af arter og tumortyper samt tilpasset til at evaluere en mangfoldighed af mitokondrie ET veje. Ved hjælp af denne protokol viser vi, at mus med en lysende B brystkræft udviser defekt nicotinamid adenin dinucleotid-forbundet respiration og afhængighed af succinate at generere adenosin triphosphat via OXPHOS.
Alle celler er tæt forbundet med deres behov for at producere og forbruge adenosin triphosphat (ATP), den molekylære energi valuta. Som cellulære mutationer giver anledning til dannelsen af tumorer, mitokondrier sikre overlevelse gennem diversificering af energiproduktion, der ofte er fænotypeligt skelnes fra ikke-kræft væv1,2,3. Som sådan, der er et kritisk behov for hurtig og dyb profilering af mitokondrie respiratorisk funktion for at lette klassificeringen af tumortype, kræft indledning, progression, og behandling respons.
Åndedrætsfunktioner i udskårne vævsprøver kan ikke vurderes intakt, da de primære substrater for OXPHOS ikke er celle-gennemtrængelige. For at overvinde denne begrænsning kan mitokondrier fremstilles enten ved isolation, kemisk permeabilisering eller mekanisk homogenisering. Mitokondrie isolation anses længe for at være en guldstandard for evaluering af åndedrætsfunktion. Det kræver dog store mængder væv, er tidskrævende og giver lav giver med mulig udvælgelse bias for visse fraktioner af mitokondrier4. Permeabilisering består af mekanisk adskillelse og eksponering af vævssektioner eller fiberbundter for et mildt vaskemiddel, der selektivt nedbryder plasmamembranen5. Permeabilisering er ofte ansat i striated væv såsom skelet og hjertemusklen som individuelle fiber bundter kan drilles fra hinanden. Sammenlignet med isolation giver permeabilisering mere mitokondrier i deres oprindelige cellulære miljø og fysiske form5. Permeabilisering er blevet anvendt med succes i andre væv såsom tumor6,7 og moderkage8; Reproducerbarheden af permeabiliserede fiberpræparater kan dog være vanskelig på grund af konsistensen af dissektion og iltbehov for at overvinde diffusionsbegrænsninger9. Derudover kan permeabiliserede fibre være uegnede i visse tumortyper, der er tæt cellulære og meget fibrotiske. Vævsar homogenater genereres gennem mekanisk forstyrrelse af plasmamembranen og ligner permeabiliserede fibre med hensyn til mitokondrieudbytte og integritet10. Vævs homogenater minimerer også begrænsningerne ved iltdiffusion og kan let anvendes på tværs af vævstyper gennem optimering af mekanisk kraft11,12.
Her skitserer vi en enkel og hurtig metode til at kvantificere oxidativ fosforylering (OXPHOS) og elektronoverførselskapacitet (ET) i friskudskårne faste tumor homogenater. Protokollen er optimalt designet til at evaluere frisk væv ved hjælp af Oxygraph-2k (O2k) høj opløsning respirometer, som kræver forudgående kendskab til instrumental opsætning og kalibrering, men kan ligeledes tilpasses ved hjælp af enhver Clark-type elektrode, Seahorse analysator, eller pladelæser. Protokollen kan reproducibly anvendes på tværs af arter og tumortyper samt tilpasset til at evaluere en mangfoldighed af mitokondrie ET veje.
Tilgange til evaluering af mitokondrie respiration i kræft har i vid udstrækning været begrænset til in vitro modeller13,14,15,16. En vis succes er opnået i måling mitokondrie respiration i tumorer ved hjælp af kemisk permeabilization6,7,17, men der er ingen ensartet, guld-standard tilgang, der kan anvendes universelt og sammenlignes på tværs af tumortyper. Derudover har mangel på konsekvent dataanalyse og -rapportering begrænset datageneralisering og reproducerbarhed. Metoden skitseret heri giver en enkel, relativt hurtig tilgang til måling mitokondrie respiration18 i mitokondrie præparater fra frisk excised solid tumor prøver. Tumorer blev dyrket fra ortotopisk implanteret murin Luminal B, ERα-negativ EO771 brystkræftceller19.
Omhu og pleje med vævshåndtering vil i høj grad forbedre nøjagtigheden og normaliseringen af iltforbruget. Vævet og mitokondrier kan let beskadiges, hvis prøven ikke holdes kold, ikke konsekvent nedsænkes i konserveringsmedier eller håndteres for meget, hvilket resulterer i suboptimal rutine og OXPHOS-satser. Derudover er nøjagtig vådvægt af det homogeniserede væv af afgørende betydning, da dette er den primære normaliseringsmetode. Andre normaliseringsmetoder kan overvejes, såsom totale protein- eller mitokondriespecifikke markører, såsom citratsyntaseaktivitet20. Derudover, væv heterogenitet skal behandles, med beslutninger om tumor regioner til at omfatte i eksperimenter foretaget på forhånd. Nekrotisk, fibrotisk, og bindevæv kan ikke homogenisere og / eller respire godt og bør undgås, medmindre forsætligt assaying disse tumor regioner. Især, tumoren kan være meget klæbrig afhængigt af typen og excision region, hvilket gør præcis vejning og overførsel mere udfordrende. Antallet af strøg, der anvendes til homogeniseringer, bør optimeres for at sikre fuldstændig forberedelse af mitokondrier, samtidig med at der formildes skader på de ydre mitokondriemembraner.
For forbedret nøjagtighed og reproducerbarhed anbefaler vi optimeringsforsøg for antallet af slagtilfælde til homogenatpræparat, vævskoncentration og substrat, uncoupler, inhibitorkoncentrationer. Undersøgelser kan sammenligne det forskellige antal slagtilfælde, og hvordan de svarer til respons på tilsætning af cytochrom c i undersøgelsen samt den maksimale mitokondrie respiratoriske kapacitet 21. Selv om der er en generel accept af, at mindre cytochrom c respons er bedre, da en stigning i iltforbruget efter tilsætning af cytochrom c kan indikere skader på den ydre mitokondriemembran, er der ingen guldstandard for, hvad denne tærskel er for hvert væv og bør eksperimentelt undersøges for at sikre, at vævet ikke bliver overbebyrdet eller underforberedt. I dette tumorvæv blev det konstateret, at en cytochrom c respons under ~ 30% ikke forringe respiratorisk funktion. Cytochrom c-brug bliver afgørende for nøjagtig kvantificering af åndedrætskapaciteten, hvis testen er positiv. I dette tilfælde genopfylder tilsætning endogene cytochrom c, som, hvis de er udtømt, vil forårsage en undervurdering af åndedrætsfrekvenserne.
Vævskoncentration titrering eksperimenter kan udføres over en række mulige koncentrationer og ideelt set ville ske med SUITs, der vil blive undersøgt i løbet af undersøgelsen. Respiratorisk kapacitet vil variere efter tumortype og sammensætning. Således tumorer tæt med mitokondrier eller høj respiratorisk kapacitet vil kræve lavere koncentrationer (0,5-5 mg/mL). Tumorer med få mitokondrier eller lav respiratorisk kapacitet vil kræve højere koncentrationer (7-12 mg/mL). Derudover kan SUITs, der er lange eller har meget forbrugte substrater, have brug for mindre væv for at forhindre reoxygenation af kammeret eller ADP-begrænsning. Nogle væv vil have en lineær sammenhæng i iltforbruget, mens andre vil vise forbedret følsomhed og maksimal oxidation på visse koncentrationsområder. Den valgte vævskoncentration skal optimeres for at maksimere iltstrøm og samtidig begrænse antallet af reoxygenationshændelser. Derudover er det ofte bedre at overvurdere behovet for eller sigte mod den højere ende af koncentrationsområdet. Hæmmerne, som er afgørende for kvantificeringen af respiratoriske fluxer, er mere præcise, når de anvendes i større puljer af mitokondrier.
En anden væsentlig overvejelse er koncentrationen af de lægemidler, der anvendes under protokollerne. Ændringer i homogenatkoncentrationen kan ændre koncentrationerne af substrater, uncouplers og hæmmere, der kræves for maksimal respons. Når det optimale koncentrationsområde er valgt, skal der således udføres et forsøg, der tester de doser, der kræves til SUIT-protokollen. Yderligere ADP kan tilføjes for at sikre, at adenylatkoncentrationer ikke begrænser sig til luftvejsstrøm. Kemiske afkoblere som FCK eller CCCP vil hæmme åndedrættet ved højere koncentrationer22. Som sådan er det vigtigt at titrere i små mængder for at afsløre den maksimale opnåede sats. Hæmmere, såsom rotenon og antimycin A, anvendes bedst, når de er mættet i den første injektion. Mens optimale koncentrationer blev bestemt i indledende forsøg, har vi også observeret behandlingsrelaterede forskelle som reaktion på hæmmere og tilføjer derfor ofte en ekstra injektion af hæmmere for at demonstrere maksimal hæmning, da de resulterende satser tjener som grundlag for kvantificering. Kemisk hæmning af Ascorbat/TPMD er afgørende for nøjagtig analytisk reduktion, da TMPD gennemgår autooxidation23. Vi kontrollerede for autooxidation af ascorbat/TMPD/cytochrom c gennem tilsætning af natriumazid, en etableret CIV-hæmmer. For Km-undersøgelserne forhindrer tilsætning af rotenon i nærværelse af succinate alene oxaloacetatakkumulering, som kan hæmme succinate dehydrogenaseaktivitet ved lave koncentrationer24. Volumen og koncentration af ADP er meget afhængig af mitokondriers følsomhed over for den fremherskende substratkombination. Mitokondriepræparater, der er meget følsomme over for ADP, vil kræve lavere startkoncentrationer. Derudover validerede kemikalier og korrekt lægemiddelpræparat med opmærksomhed på pH, følsomhed over for lys, hvis det er relevant, og opbevaringstemperatur er afgørende for vellykkede eksperimenter.
Instrument setup og rutinemæssig pleje er af afgørende betydning for succesen af disse eksperimenter. Tilstrækkelig og korrekt rengøring af kamrene er afgørende for reproducerbarhed og forebyggelse af biologisk, protein, hæmmer eller afkoblet forurening. Clark-type elektroder og O2k systemer udnytte glas reaktion kamre, som er en betydelig omkostningsfordel for plade-baserede systemer, der er afhængige af forbrugsstoffer. Glaskamrene skal dog rengøres kraftigt og kan være en kilde til kontaminering af hæmmere i efterfølgende undersøgelser. Inkubation med mitokondrier-rige prøver under vaskeprocessen (f.eks. isolerede hjerte- eller lever mitokondrier) kan reducere risikoen for eksperimentel forurening og anbefales ud over fortyndings- og alkoholbaserede vaskeprocedurer. Hvis der gennemføres på hinanden følgende undersøgelser, minimerer rengøring med ethanol og mitokondrier muligheden for inhibitorforurening. Kalibrering af iltsensoren anbefales forud for hvert forsøg for at opnå nøjagtige målinger af respiration i forhold til det fremherskende delvise ilttryk. Hvis det ikke er muligt at kalibrere flere kalibreringer, kan en kalibrering om dagen være tilstrækkelig, hvis iltkoncentrationen forbliver stabil og ensartet efter vaskeproceduren.
De procedurer, der er skitseret ovenfor udnytte Oroboros O2k instrument til måling af iltforbrug i tumorvæv inden for 4 timer efter tumor excision ved hjælp af tidligere designet og optimeret konservering løsning og respiration medier25,26,27. Flere parametre i denne protokol kan ændres til efterfølgende programmer. Instrumentopsætningen og kalibreringen, de homogenisatorer, der anvendes til vævspræparat, og den optimale homogenat- og kammer oxygenkoncentration kan alle tilpasses til brug på andre instrumenter med iltovervågningspotentiale. For eksempel blev kamrene lidt overfyldte, når de tilsættes homogenat, og når kammeret er helt lukket, forbliver kammerkapillæren fuld. Dette vil forbruge noget ilt i kammeret, men med optimering af prøvekoncentrationen kan vi redegøre for dette forbrug ved at bestemme, hvilket iltniveau der skal starte med. Alternativt kan prøven få lov til at ekvilibrere ved omgivende ilt, før kammeret lukkes, men dette vil ofte øge tiden, før eksperimentet starter og forsinke tilsætning af substrater. Mens de homogenisatorer, der anvendes i denne protokol, er bredt tilgængelige, kan der anvendes andre kommercielle homogeniseringsteknikker, såsom en vævs shredder eller automatiseret homogenisator28.
Derudover kan vævspræparatet og instrumentprocedurerne anvendes sammen med en række forskellige SUIT’er til at studere åndedrætskontrol ved en mangfoldighed af koblings- og vejkontroltilstande29. Disse SUIT-protokoller er udviklet til at måle funktionel kapacitet, og dermed har bidraget fra potentielle endogene substrater ingen indvirkning på kapacitetsmålingen. Vi analytisk tegner os for ikke-mitokondrie iltforbrug og / eller resterende forbrug af homogenatet gennem subtraktion af antimycin A-rotenone, eller natrium azid ufølsomme satser, alt efter hvad der er relevant. Mitokondrier kan forblive levedygtige i BIOPS eller lignende konstruerede konserveringsløsninger i længere tid (>24 timer) afhængigt af vævstype og intakthed30,31. Undersøgelser kan udføres på forhånd for at bestemme de tidsmæssige opbevaringsgrænser, da OXPHOS af visse substrater kan have forskellige begrænsninger. Dette er afgørende, hvis eksperimentet ikke kan udføres inden for få timer efter vævs excision/biopsi. 37 °C er en optimal og fysiologisk temperatur til evaluering af åndedrætsfunktion i de fleste pattedyrsystemer. Hvis analysetemperaturen imidlertid ser ud til at forstyrre evaluering32, kan der gennemføres sammenlignende undersøgelser på tværs af et bredt temperaturområde (25-40 °C) for at sikre tilstrækkelig reaktionsevne. Instrumentale begrænsninger kan begrænse evnen til at gennemføre sådanne undersøgelser.
Større begrænsninger af ovennævnte metode er 1) potentialet for skader på mitokondrier gennem mekanisk homogenisering, 2) tilstedeværelse af ATPaser eller andre subcellulære biokemikalier i homogenatpræparater, der kan forstyrre samtidig bestemmelse af ATP eller andre variabler af interesse og kan kræve yderligere korrektionsmetoder eller hæmmerbrug33 og 3) evaluering af mange prøver og/eller flere SUIT’er pr. prøve er tidskrævende, da ét instrument kan rumme to eksperimenter ad gangen og kræver rengøring og opsætning mellem efterfølgende forsøg. Optimering eksperimenter og konsekvent forberedelse af prøver kan minimere betydelige mitokondrie skader, der ville bidrage til inkonsekvente data.
Metodens betydning med hensyn til eksisterende/alternative metoder er forbedret gennemførlighed i forhold til mængden af udgangsmateriale, udfordring med at isolere mitokondrier eller teknisk udfordring i permeabilizing væv. Forberedelse af homogenater er hurtigere, ilt er ikke nær så begrænsende, og er mindre modtagelige for variation mellem personale sammenlignet med permeabiliseret væv. Det er vigtigt, at næsten alle prøvetyper er egnede til homogenatpræparat, som giver mulighed for sammenlignende analyse på tværs af væv. Respirometri i høj opløsning er guldstandardmålingen af mitokondrie OXPHOS og ET. Anvendelsen af denne metode i præklinisk og klinisk kræftforskning har kapacitet til at udvide de nuværende in vitro-undersøgelser til ex vivo-undersøgelser. Desuden tilbyder det potentielle anvendelser i kliniske og diagnostiske indstillinger.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Pennington Biomedical Research Center Comparative Biology Core personale for dyrepleje. Denne forskning blev delvist støttet af National Institute of Health Grants U54GM104940 (JPK) og KL2TR003097 (LAG). Alle forsøg og procedurer, der involverer dyr, blev godkendt af Pennington Biomedical Research Center Institutional Animal Care and Use Committee.
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A2383 | |
Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4544 | |
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock, fatty acid free | Sigma-Aldrich | 3117057001 | Roche |
BD 50 mL Luer-Lok Syringe | Fisher Scientific | 13-689-8 | |
BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C4830 | |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | |
Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C2506 | |
Datlab 7.4 software | Oroboros Instruments | ||
Dimethylsulfoxide | Amresco | N182 | |
Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
D-Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Dumoxel, autoclavable |
Dumont # 7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumoxel, autoclavable |
Digital Calipers 150 mm/6 in | World Precision Instruments | 501601 | |
EO771 cells | CH3 BioSystems | SKU: 94APV1-vial-prem | Pathogen Tested |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | |
Female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Stock #000664 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750 | |
Kimwipes | Fisher Scientific | 34120 | |
L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | G1626 | |
Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | L2398 | |
Malate | Sigma-Aldrich | M6413 | |
Matrigel Matrix | Corning | 354248 | |
MgCl·6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Microsyringes | Hamilton | 87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943 | |
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | T7394 | |
Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10023-03 | |
Oxygraph-2k FluoRespirometer | Oroboros Instruments | 10003-01 | |
PBS | Gibco | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | P1767 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
RPMI 1640 | Gibco | 21875034 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
Succinate (disodium) | Sigma-Aldrich | W327700 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
Whatman Filter Paper, grade 5 | Sigma-Aldrich | 1005-090 | |
Wheaton Tenbroeck Tissue Grinder, 7 mL | Duran Wheaton Kimble | 357424 | |
Straight Tip Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5914SC | |
Non-Safety Scalpel No. 11 | McKesson | 1029065 | |
BD Precision Glide Needle 27 G x 1/2 | Becton, Dickinson and Company | 305109 | |
BD Precision Glide Needle 18 G x 1 | Becton, Dickinson and Company | 305195 | |
BD 1mL Slip Tip Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
Pyrex Reusable Petri Dish, 60 mm | Thermo Fisher Scientific | 316060 | |
Rodent Very High Fat Diet, 60% kcal from fat, 20% kcal from protein, and 20% kcal from carbohydrate | Research Diet | D12492 | |
Pyrex Watch Glass, 100 mm | Thermo Fisher Scientific | S34819 |