हमने ताजा ट्यूमर समरूपता में माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन और इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए एक व्यावहारिक प्रोटोकॉल और विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण विकसित किया है। इस प्रोटोकॉल को कैंसर दीक्षा, प्रगति और उपचार प्रतिक्रिया में योगदान देने वाले विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों का सर्वेक्षण करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।
माइटोकॉन्ड्रिया ऊर्जा उत्पादन, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के विनियमन, और मैक्रोमॉलिक्यूल संश्लेषण के माध्यम से कैंसर की शुरुआत और प्रगति के लिए आवश्यक हैं। ट्यूमर पर्यावरण के लिए माइटोकॉन्ड्रिया के आनुवंशिक और कार्यात्मक अनुकूलन प्रोलिफेरेटिव और मेटास्टैटिक क्षमता को चलाते हैं। डीएनए और आरएनए अनुक्रमण के आगमन ने ट्यूमरजीनेसिस के आनुवंशिक मध्यस्थों के मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण बाधाओं को हटा दिया। हालांकि, आज तक, ट्यूमर माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए पद्धतिगत दृष्टिकोण मायावी बने हुए हैं और व्यवहार्यता को सीमित करने के लिए तकनीकी प्रवीणता की आवश्यकता होती है, अंततः प्रयोगात्मक और नैदानिक दोनों सेटिंग्स में नैदानिक और शकुन मूल्य कम हो जाता है। यहां, हम उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसन का उपयोग करके ताजा उत्पादित ठोस ट्यूमर समरूपता में ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन (ऑक्सीफोस) और इलेक्ट्रॉन ट्रांसफर (ईटी) क्षमता की दरों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक सरल और त्वरित विधि की रूपरेखा तैयार करते हैं। प्रोटोकॉल को प्रजातियों और ट्यूमर प्रकारों में पुन: लागू किया जा सकता है और साथ ही माइटोकॉन्ड्रियल ईटी रास्तों की विविधता का मूल्यांकन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हम प्रदर्शित करते हैं कि एक चमकदार बी स्तन कैंसर वाले चूहों ने ऑक्सफोस के माध्यम से एडेनोसाइन ट्राइफोस्फेट उत्पन्न करने के लिए संक्षेप पर दोषपूर्ण निकोटिनामाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड से जुड़े श्वसन और निर्भरता का प्रदर्शन किया।
सभी कोशिकाओं को परिचित उत्पादन और adenosine triphosphate (एटीपी), आणविक ऊर्जा मुद्रा का उपभोग करने की आवश्यकता से जुड़े हुए हैं । चूंकि सेलुलर उत्परिवर्तन ट्यूमर के गठन को जन्म देते हैं, माइटोकॉन्ड्रिया ऊर्जा उत्पादन के विविधीकरण के माध्यम से अस्तित्व सुनिश्चित करते हैं जो अक्सर गैर-कैंसरऊतक1,2,3से अलग होता है। इस प्रकार, ट्यूमर प्रकार, कैंसर दीक्षा, प्रगति और उपचार प्रतिक्रिया के वर्गीकरण को सुविधाजनक बनाने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन कार्य की तेजी से और गहरी प्रोफाइलिंग की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है।
उत्पादित ऊतक नमूनों के श्वसन कार्यों का मूल्यांकन बरकरार नहीं किया जा सकता क्योंकि ऑक्सफोस के लिए प्राथमिक सब्सट्रेट्स सेल-पारमेबल नहीं हैं। इस सीमा को दूर करने के लिए, माइटोकॉन्ड्रिया को या तो अलगाव, रासायनिक पारमेबिलाइजेशन, या यांत्रिक समरूपता द्वारा तैयार किया जा सकता है। माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव लंबे समय से श्वसन कार्य के मूल्यांकन के लिए एक स्वर्ण मानक माना जाता है। हालांकि, इसके लिए बड़ी मात्रा में ऊतक की आवश्यकता होती है, समय लेने वाला होता है, और माइटोकॉन्ड्रिया4के कुछ अंशों के लिए संभावित चयन पूर्वाग्रह के साथ कम उपज है। परिव्ययीकरण में यांत्रिक पृथक्करण होता है और ऊतक वर्गों या फाइबर बंडलों का एक हल्के डिटर्जेंट के संपर्क में जाता है जो प्लाज्मा झिल्ली को चुनिंदा रूप से कम कर देता है5. परिव्ययीकरण अक्सर कंकाल और हृदय की मांसपेशी जैसे स्ट्रेटेड ऊतकों में कार्यरत होता है क्योंकि व्यक्तिगत फाइबर बंडलों को अलग-अलग छेड़ा जा सकता है। अलगाव की तुलना में, पारमेबिलाइजेशन अपने मूल सेलुलर वातावरण और भौतिक रूप5में अधिक माइटोकॉन्ड्रिया पैदा करता है। ट्यूमर 6,7 और अपरा8जैसे अन्य ऊतकों मेंपरमीलाइजेशन सफलतापूर्वक लागू किया गया है । हालांकि, परमीबिलाइज्ड फाइबर तैयारी की प्रजनन क्षमता विच्छेदन और ऑक्सीजन आवश्यकताओं की स्थिरता के कारण मुश्किल हो सकता है प्रसार सीमाओं को दूर करने के लिए9. इसके अतिरिक्त, परमीबिलित फाइबर कुछ ट्यूमर प्रकारों में अनुपयुक्त हो सकते हैं जो घनी सेलुलर और अत्यधिक फाइब्रोटिक होते हैं। ऊतक समरूप प्लाज्मा झिल्ली के यांत्रिक व्यवधान के माध्यम से उत्पन्न होते हैं और माइटोकॉन्ड्रियल यील्ड और अखंडता10के संदर्भ में परमीबिलित फाइबर के समान होते हैं। ऊतक समरूपता ऑक्सीजन प्रसार की सीमाओं को भी कम करती है और यांत्रिक बल11 , 12के अनुकूलन के माध्यम से ऊतक प्रकारों में आसानी सेनियोजितकिया जा सकता है ।
यहां, हम ताजा उत्पादित ठोस ट्यूमर समरूपता में ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन (ऑक्सीफोस) और इलेक्ट्रॉन ट्रांसफर (ईटी) क्षमता की दरों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक सरल और तेजी से विधि की रूपरेखा तैयार करते हैं। प्रोटोकॉल को ऑक्सीग्राफ-2k (O2k) उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसन का उपयोग करके ताजा ऊतक का मूल्यांकन करने के लिए बेहतर ढंग से डिज़ाइन किया गया है, जिसके लिए वाद्य सेटअप और अंशांकन के पूर्व ज्ञान की आवश्यकता होती है, लेकिन इसी तरह किसी भी क्लार्क-प्रकार के इलेक्ट्रोड, सीहॉर्स एनालाइजर या प्लेट रीडर का उपयोग करके अनुकूलित किया जा सकता है। प्रोटोकॉल को प्रजातियों और ट्यूमर प्रकारों में पुन: लागू किया जा सकता है और साथ ही माइटोकॉन्ड्रियल ईटी रास्तों की विविधता का मूल्यांकन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
कैंसर में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन का मूल्यांकन करने के दृष्टिकोण काफी हद तक इन विट्रो मॉडल 13 ,14,15,16तक सीमित रहे हैं । रासायनिक पारमेबिलाइजेशन6,7,17का उपयोग करके ट्यूमर में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को मापने में कुछ सफलता हासिल की गई है, लेकिन कोई समान, स्वर्ण-मानक दृष्टिकोण नहीं है जिसे सार्वभौमिक रूप से लागू किया जा सकता है और ट्यूमर प्रकारों की तुलना में। इसके अतिरिक्त, लगातार डेटा विश्लेषण और रिपोर्टिंग की कमी में सीमित डेटा सामान्यता और प्रजनन क्षमता है। यहां उल्लिखित विधि हौसले से उत्पादित ठोस ट्यूमर नमूनों से माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी में माइटोकॉन्ड्रियलश्वसन 18 को मापने के लिए एक सरल, अपेक्षाकृत त्वरित दृष्टिकोण प्रदान करती है। ट्यूमर ऑर्थोटोपिक रूप से प्रत्यारोपित मुरीन ल्यूमिनल बी, ERα-नकारात्मक EO771 स्तन कैंसर कोशिकाओं19से बड़े हो गए थे ।
ऊतक हैंडलिंग के साथ परिश्रम और देखभाल ऑक्सीजन खपत दरों की सटीकता और सामान्यीकरण में बहुत सुधार करेगी। ऊतक और माइटोकॉन्ड्रिया को आसानी से क्षतिग्रस्त किया जा सकता है यदि नमूना ठंडा नहीं रखा जाता है, तो संरक्षण मीडिया में लगातार जलमग्न नहीं होता है, या पीढ़ी-पीढ़ी संभाला जाता है, जिसके परिणामस्वरूप उप-इष्टतम दिनचर्या और ऑक्सीएफओस दरें होती हैं। इसके अतिरिक्त, समरूप ऊतक का सटीक गीला वजन महत्वपूर्ण महत्व का है क्योंकि यह प्राथमिक सामान्यीकरण विधि है। अन्य सामान्यीकरण विधियों पर विचार किया जा सकता है, जैसे कुल प्रोटीन या माइटोकॉन्ड्रियल विशिष्ट मार्कर, जैसे साइट्रेट सिंथेस गतिविधि20। इसके अतिरिक्त, ऊतक विषमता को संबोधित करने की आवश्यकता होगी, ट्यूमर क्षेत्रों के बारे में निर्णय के साथ प्रयोगों में शामिल करने के लिए एक प्राथमिकताओं बनाया । परिगलित, फाइब्रोटिक, और संयोजी ऊतक समरूप नहीं हो सकता है और/या अच्छी तरह से respire और जब तक जानबूझकर इन ट्यूमर क्षेत्रों परख से बचा जाना चाहिए । विशेष रूप से, ट्यूमर प्रकार और उत्तेजना क्षेत्र के आधार पर बहुत चिपचिपा हो सकता है, जिससे सटीक वजन और हस्तांतरण अधिक चुनौतीपूर्ण हो सकता है। बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली को नुकसान को कम करते हुए माइटोकॉन्ड्रिया की पूरी तैयारी सुनिश्चित करने के लिए समरूपता के लिए उपयोग किए जाने वाले स्ट्रोक की संख्या को अनुकूलित किया जाना चाहिए।
बेहतर सटीकता और प्रजनन क्षमता के लिए, हम अनुकूलन प्रयोगों को समरूप तैयारी, ऊतक एकाग्रता, और सब्सट्रेट, अनकूपलर, अवरोधक सांद्रता के लिए स्ट्रोक की संख्या के लिए किए जाने की सलाह देते हैं। अध्ययन ों से स्ट्रोक की विभिन्न संख्याओं की तुलना की जा सकती है और वे अध्ययन के भीतर साइटोक्रोम सी के साथ – साथ अधिकतम माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन क्षमता 21के साथ – साथ के साथ – साथ अधिकतम माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन क्षमता के जवाब के अनुरूप कैसे होते हैं । यद्यपि एक सामान्य स्वीकृति है कि कम साइटोक्रोम सी प्रतिक्रिया बेहतर है, क्योंकि साइटोक्रोम सी के अतिरिक्त के बाद ऑक्सीजन की खपत में वृद्धि बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली को नुकसान का संकेत दे सकती है, इस सीमा के लिए कोई स्वर्ण-मानक नहीं है और यह सुनिश्चित करने के लिए प्रायोगिक रूप से जांच की जानी चाहिए कि ऊतक को अधिक काम नहीं किया जा रहा है या कम तैयार नहीं किया जा रहा है। इस ट्यूमर ऊतक में, यह पाया गया कि ~ 30% के तहत एक साइटोक्रोम सी प्रतिक्रिया श्वसन कार्य ख़राब नहीं था। यदि परीक्षण सकारात्मक है तो साइटोक्रोम सी का उपयोग श्वसन क्षमता के सटीक मात्राकरण के लिए महत्वपूर्ण हो जाता है। इस मामले में, इसके अलावा अंतर्जात साइटोक्रोम सी को भर देता है, जो यदि समाप्त हो जाता है, तो श्वसन दरों का अनुमान देगा।
ऊतक एकाग्रता टिटरेशन प्रयोगों को व्यवहार्य सांद्रता की एक श्रृंखला पर किया जा सकता है और आदर्श रूप से, SUITs के साथ किया जाएगा जिसकी अध्ययन के दौरान जांच की जाएगी। श्वसन क्षमता ट्यूमर प्रकार और संरचना के अनुसार भिन्न होगी। इस प्रकार, माइटोकॉन्ड्रिया या उच्च श्वसन क्षमता के साथ घने ट्यूमर को कम सांद्रता (0.5-5 मिलीग्राम/एमएल) की आवश्यकता होगी। कुछ माइटोकॉन्ड्रिया या कम श्वसन क्षमता वाले ट्यूमर को उच्च सांद्रता (7-12 मिलीग्राम/एमएल) की आवश्यकता होगी। इसके अतिरिक्त, लंबे समय तक या अत्यधिक खपत वाले सब्सट्रेट्स वाले सूइट्स को चैंबर या एडीपी सीमा के पुनर्वजीनीकरण को रोकने के लिए कम ऊतक की आवश्यकता हो सकती है। कुछ ऊतकों में ऑक्सीजन की खपत में एक रैखिक संबंध होगा, जबकि अन्य कुछ एकाग्रता पर्वतमाला पर बेहतर संवेदनशीलता और अधिकतम ऑक्सीकरण दिखाएंगे। चुने हुए ऊतक एकाग्रता को ऑक्सीजन प्रवाह को अधिकतम करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, जबकि पुनर्ऑक्सिजनिंग घटनाओं की संख्या को सीमित करना चाहिए। इसके अतिरिक्त, एकाग्रता सीमा के उच्च अंत के लिए आवश्यकता या लक्ष्य को अधिक आंकना अक्सर बेहतर होता है। माइटोकॉन्ड्रिया के बड़े पूल में उपयोग किए जाने पर अवरोधक, जो श्वसन प्रवाह के क्वांटिटेशन के लिए आवश्यक हैं, अधिक सटीक हैं।
एक अन्य आवश्यक विचार प्रोटोकॉल के दौरान उपयोग की जाने वाली दवाओं की एकाग्रता है। समरूप एकाग्रता में परिवर्तन अधिकतम प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक सब्सट्रेट्स, अनकूप्लर और अवरोधकों की सांद्रता को बदल सकता है। इस प्रकार, एक बार इष्टतम एकाग्रता सीमा चुनी जाती है, तो सूट प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक खुराक का परीक्षण करने वाला प्रयोग किया जाना चाहिए। अतिरिक्त एडीपी को यह सुनिश्चित करने के लिए जोड़ा जा सकता है कि एडेनेलेट सांद्रता श्वसन प्रवाह तक सीमित नहीं है। एफसीसीपी या सीसीसीपी जैसे रासायनिक अनकपलर्स उच्च सांद्रता22पर श्वसन को बाधित करेंगे । इस प्रकार, अधिकतम प्राप्त दर को प्रकट करने के लिए छोटी मात्रा में टिकेट करना आवश्यक है। रोटेनोन और एंटीमाइसिन ए जैसे अवरोधकों का सबसे अच्छा उपयोग किया जाता है जब पहले इंजेक्शन के भीतर संतृप्त होता है। जबकि प्रारंभिक प्रयोगों में इष्टतम सांद्रता निर्धारित की गई थी, हमने अवरोधकों के जवाब में उपचार से संबंधित मतभेदों को भी देखा है और इस प्रकार अक्सर अधिकतम अवरोध प्रदर्शित करने के लिए अवरोधकों का एक अतिरिक्त इंजेक्शन जोड़ते हैं क्योंकि परिणामी दरें मात्राकरण के आधार के रूप में काम करती हैं। सटीक विश्लेषणात्मक कमी के लिए अस्कोरबेट/टीपीएमडी का रासायनिक अवरोध आवश्यक है क्योंकि टीएमपीडी ऑटोऑक्सीडेशन23से गुजरता है । हमने सोडियम एजाइड, एक स्थापित सीआईवी अवरोधक के अलावा एस्कॉर्बेट/टीएमपीडी/साइटोक्रोम सी के ऑटो-ऑक्सीकरण के लिए नियंत्रित किया । किमी अध्ययनों के लिए, अकेले संक्षेप की उपस्थिति में रोटेनोन का जोड़ ऑक्सलोसिटेट संचय को रोकता है जो कम सांद्रता24पर संक्षेप डेहाइड्रोजनेज़ गतिविधि को रोक सकता है। एडीपी की मात्रा और एकाग्रता प्रचलित सब्सट्रेट संयोजन के लिए माइटोकॉन्ड्रिया की संवेदनशीलता पर अत्यधिक निर्भर हैं। माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी जो एडीपी के प्रति अत्यधिक संवेदनशील हैं, कम शुरुआती सांद्रता की आवश्यकता होगी। इसके अतिरिक्त, पीएच पर ध्यान देने के साथ मान्य रसायन और उचित दवा तैयार करना, लागू होने पर प्रकाश के प्रति संवेदनशीलता, और सफल प्रयोगों के लिए भंडारण तापमान आवश्यक है।
इन प्रयोगों की सफलता के लिए इंस्ट्रूमेंट सेटअप और रूटीन केयर का महत्वपूर्ण महत्व है । जैविक, प्रोटीन, अवरोधक, या अनकूलर संदूषण की प्रजनन क्षमता और रोकथाम के लिए कक्षों की पर्याप्त और उचित सफाई आवश्यक है। क्लार्क-प्रकार के इलेक्ट्रोड और O2k सिस्टम ग्लास रिएक्शन कक्षों का उपयोग करते हैं जो प्लेट-आधारित प्रणालियों के लिए एक महत्वपूर्ण लागत लाभ है जो उपभोग्य सामग्रियों पर भरोसा करते हैं। हालांकि, कांच के कक्षों को सख्ती से साफ किया जाना चाहिए और बाद के अध्ययनों में अवरोधक संदूषण का स्रोत हो सकता है। धोने की प्रक्रिया (अलग दिल या जिगर माइटोकॉन्ड्रिया, उदाहरण के लिए) के दौरान माइटोकॉन्ड्रिया से भरपूर नमूनों के साथ इनक्यूबेशन प्रयोगात्मक संदूषण के जोखिम को कम कर सकते हैं और कमजोर पड़ने और शराब आधारित धोने की प्रक्रियाओं के अलावा सिफारिश की जाती है। यदि लगातार अध्ययन चलाए जाते हैं, तो इथेनॉल और माइटोकॉन्ड्रिया के साथ सफाई अवरोधक संदूषण की संभावना को कम करती है। ऑक्सीजन सेंसर के अंशांकन ऑक्सीजन के मौजूदा आंशिक दबाव के सापेक्ष श्वसन के सटीक माप प्राप्त करने के लिए प्रत्येक प्रयोग से पहले की सिफारिश की जाती है। यदि कई अंशांकन संभव नहीं हैं, तो एक दिन में एक अंशांकन पर्याप्त हो सकता है यदि धोने की प्रक्रिया के बाद ऑक्सीजन एकाग्रता स्थिर और सुसंगत बनी रहती है।
ऊपर उल्लिखित प्रक्रियाएं ट्यूमर के ऊतकों में ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए ओरोबोरोस O2k उपकरण का लाभ उठाएं , जो पहले से डिजाइन किए गए और अनुकूलित संरक्षण समाधान और श्वसन मीडिया25,26,27का उपयोग करके ट्यूमर उत्तेजना के4घंटे के भीतर है । इस प्रोटोकॉल में कई मापदंडों को बाद के अनुप्रयोगों के लिए संशोधित किया जा सकता है। उपकरण सेटअप और अंशांकन, ऊतक तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले समरूप, और इष्टतम समरूप और कक्ष ऑक्सीजन एकाग्रता सभी को ऑक्सीजन निगरानी क्षमता वाले अन्य उपकरणों पर उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, होमोजेनेट जोड़ते समय कक्षों को थोड़ा भरा गया था, और इस प्रकार जब कक्ष पूरी तरह से बंद हो जाता है, तो कक्ष केशिका भरा रहता है। यह कक्ष में कुछ ऑक्सीजन की खपत करेगा, लेकिन नमूना एकाग्रता के अनुकूलन के साथ, हम यह निर्धारित करने में इस खपत के लिए खाते कर सकते हैं कि ऑक्सीजन का स्तर किस से शुरू करना है। वैकल्पिक रूप से, नमूना कक्ष बंद होने से पहले परिवेश ऑक्सीजन पर संतुलन करने की अनुमति दी जा सकती है, लेकिन यह अक्सर प्रयोग शुरू होने से पहले समय की मात्रा में वृद्धि होगी और सब्सट्रेट्स के अलावा देरी करेगा। जबकि इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले समरूप व्यापक रूप से सुलभ हैं, अन्य वाणिज्यिक समरूपता तकनीकों को नियोजित किया जा सकता है, जैसे कि ऊतक श्रेडर या स्वचालित होमोजेनाइजर28।
इसके अतिरिक्त, ऊतक तैयारी और साधन प्रक्रियाओं का उपयोग कई अलग-अलग सूती के साथ किया जा सकता है ताकि युग्मन और मार्ग नियंत्रण राज्यों की विविधता द्वाराश्वसननियंत्रण का अध्ययन किया जा सके। ये सूट प्रोटोकॉल कार्यात्मक क्षमता को मापने के लिए विकसित किए गए हैं, और इस प्रकार, संभावित अंतर्जात सब्सट्रेट्स के योगदान का क्षमता माप पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है। हम विश्लेषणात्मक रूप से अष्टावक्र ऑक्सीजन की खपत और/या अस्त्र-ाव की अवशिष्ट खपत के लिए अष्टावक्र ए-रोटेनोन, या सोडियम अज़ाइड असंवेदनशील दरों के घटाव के माध्यम से समरूप की खपत के लिए खाते हैं, के रूप में उपयुक्त है । माइटोकॉन्ड्रिया बायोप्स में व्यवहार्य रह सकता है या इसी तरह ऊतक प्रकार और बरकरारता30, 31के आधार पर समय की विस्तारित अवधि (>24 एच) के लिए संरक्षणसमाधानोंका निर्माण कर सकता है। अस्थायी भंडारण सीमा निर्धारित करने के लिए पहले से अध्ययन किए जा सकते हैं क्योंकि कुछ सब्सट्रेट्स की ऑक्सफोस की अलग-अलग सीमाएं हो सकती हैं। यह आवश्यक है यदि प्रयोग ऊतक उत्तेजना/बायोप्सी के कई घंटों के भीतर नहीं किया जा सकता है । 37 डिग्री सेल्सियस अधिकांश स्तनधारी प्रणालियों में श्वसन समारोह के मूल्यांकन के लिए एक इष्टतम और शारीरिक तापमान है। हालांकि, यदि परख तापमान मूल्यांकन32में हस्तक्षेप करता प्रतीत होता है, तो पर्याप्त जवाबदेही सुनिश्चित करने के लिए तुलनात्मक अध्ययन एक विस्तृत तापमान सीमा (25-40 डिग्री सेल्सियस) में आयोजित किया जा सकता है। वाद्य बाधाएं इस तरह के अध्ययन करने की क्षमता को सीमित कर सकती हैं।
उपर्युक्त विधि की प्रमुख सीमाएं 1 हैं) यांत्रिक समरूपता के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रिया को नुकसान की संभावना, 2) समरूप तैयारी में एटीपी या अन्य उप-सेलुलर बायोकेमिकल्स की उपस्थिति जो एटीपी या ब्याज के अन्य चरों के एक साथ निर्धारण में हस्तक्षेप कर सकती है और अतिरिक्त सुधार विधियों या अवरोधक उपयोग की आवश्यकता हो सकती है33 , और 3) प्रति नमूना कई नमूनों और/या कई SUITs का मूल्यांकन समय लेने वाला है क्योंकि एक उपकरण एक समय में दो प्रयोगों को समायोजित कर सकता है और सफाई की आवश्यकता होती है और लगातार प्रयोगों के बीच में स्थापित किया जाता है । अनुकूलन प्रयोग और नमूनों की लगातार तैयारी पर्याप्त माइटोकॉन्ड्रियल क्षति को कम कर सकती है जो असंगत डेटा में योगदान देगी।
मौजूदा/वैकल्पिक तरीकों के संबंध में विधि का महत्व प्रारंभिक सामग्री की मात्रा, माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने की चुनौती, या ऊतकों को पार करने में तकनीकी चुनौती की तुलना में व्यवहार्यता में सुधार है । समरूपता की तैयारी तेज है, ऑक्सीजन लगभग सीमित के रूप में नहीं है, और परमीबिलित ऊतक की तुलना में कर्मियों के बीच परिवर्तनशीलता के लिए कम संवेदनशील है। महत्वपूर्ण बात यह है कि लगभग सभी नमूना प्रकार समरूप तैयारी के लिए उपयुक्त हैं जो ऊतकों में तुलनात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है। हाई-रेजोल्यूशन श्वसन माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सफोस और ईटी का गोल्ड-स्टैंडर्ड मेजरमेंट है। पूर्व नैदानिक और नैदानिक कैंसर अनुसंधान में इस विधि के आवेदन पूर्व वीवो अध्ययन करने के लिए इन विट्रो जांच में वर्तमान का विस्तार करने की क्षमता है। इसके अलावा, यह नैदानिक और नैदानिक सेटिंग्स में संभावित अनुप्रयोगों प्रदान करता है।
The authors have nothing to disclose.
हम पशु देखभाल के लिए पेनिंगटन बायोमेडिकल रिसर्च सेंटर तुलनात्मक जीव विज्ञान कोर स्टाफ का शुक्रिया अदा करते हैं । इस शोध को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट U54GM104940 (JPK) और KL2TR003097 (LAG) द्वारा भाग में समर्थित किया गया था । जानवरों से जुड़े सभी प्रयोगों और प्रक्रियाओं को पेनिंगटन बायोमेडिकल रिसर्च सेंटर इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी ने मंजूरी दी थी ।
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A2383 | |
Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4544 | |
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock, fatty acid free | Sigma-Aldrich | 3117057001 | Roche |
BD 50 mL Luer-Lok Syringe | Fisher Scientific | 13-689-8 | |
BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C4830 | |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | |
Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C2506 | |
Datlab 7.4 software | Oroboros Instruments | ||
Dimethylsulfoxide | Amresco | N182 | |
Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
D-Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Dumoxel, autoclavable |
Dumont # 7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumoxel, autoclavable |
Digital Calipers 150 mm/6 in | World Precision Instruments | 501601 | |
EO771 cells | CH3 BioSystems | SKU: 94APV1-vial-prem | Pathogen Tested |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | |
Female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Stock #000664 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750 | |
Kimwipes | Fisher Scientific | 34120 | |
L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | G1626 | |
Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | L2398 | |
Malate | Sigma-Aldrich | M6413 | |
Matrigel Matrix | Corning | 354248 | |
MgCl·6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Microsyringes | Hamilton | 87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943 | |
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | T7394 | |
Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10023-03 | |
Oxygraph-2k FluoRespirometer | Oroboros Instruments | 10003-01 | |
PBS | Gibco | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | P1767 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
RPMI 1640 | Gibco | 21875034 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
Succinate (disodium) | Sigma-Aldrich | W327700 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
Whatman Filter Paper, grade 5 | Sigma-Aldrich | 1005-090 | |
Wheaton Tenbroeck Tissue Grinder, 7 mL | Duran Wheaton Kimble | 357424 | |
Straight Tip Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5914SC | |
Non-Safety Scalpel No. 11 | McKesson | 1029065 | |
BD Precision Glide Needle 27 G x 1/2 | Becton, Dickinson and Company | 305109 | |
BD Precision Glide Needle 18 G x 1 | Becton, Dickinson and Company | 305195 | |
BD 1mL Slip Tip Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
Pyrex Reusable Petri Dish, 60 mm | Thermo Fisher Scientific | 316060 | |
Rodent Very High Fat Diet, 60% kcal from fat, 20% kcal from protein, and 20% kcal from carbohydrate | Research Diet | D12492 | |
Pyrex Watch Glass, 100 mm | Thermo Fisher Scientific | S34819 |