Vi utvecklat ett praktiskt protokoll och analytiska tillvägagångssätt för att utvärdera mitokondriell oxidativ fosforylering och elektron överföring kapacitet i färska tumör homogenates. Detta protokoll kan enkelt anpassas för att undersöka olika mitokondriella funktioner som bidrar till cancerinitiering, progression och behandlingssvar.
Mitokondrier är viktiga för uppkomsten och progressionen av cancer genom energiproduktion, reaktiva syrearter reglering och makromolekylsyntes. Genetiska och funktionella anpassningar av mitokondrier till tumör miljön driva proliferative och ögonbevarande potential. Tillkomsten av DNA och RNA sekvensering bort kritiska hinder för utvärdering av genetiska medlare av tumorigenesis. Hittills är dock metodologiska metoder för att utvärdera tumör mitokondriell funktion fortfarande svårfångade och kräver tekniska färdigheter som begränsar genomförbarheten, vilket i slutändan minskar diagnostiska och prognostiska värdet i både experimentella och kliniska inställningar. Här beskriver vi en enkel och snabb metod för att kvantifiera frekvenser av oxidativ fosforylering (OXPHOS) och elektronöverföring (ET) kapacitet i nystrukna fasta tumör homogenater med hjälp av högupplöst respirometry. Protokollet kan reproduceras mellan arter och tumörtyper samt anpassas för att utvärdera en mångfald av mitokondriella ET-vägar. Med hjälp av detta protokoll visar vi att möss med en luminal B bröstcancer uppvisar defekta nikotinamid adenin dinucleotide-linked andning och beroende av succinate att generera adenosintrifosfat via OXPHOS.
Alla celler är intimt kopplade av deras behov av att producera och konsumera adenosintrifosfat (ATP), den molekylära energivalutan. Eftersom cellulära mutationer ger upphov till bildandet av tumörer säkerställer mitokondrier överlevnad genom diversifiering av energiproduktion som ofta är fenotypiskt särskiljbar från icke-cancervävnad1,2,3. Som sådan finns det ett kritiskt behov av snabb och djup profilering av mitokondriell respiratorisk funktion för att underlätta klassificeringen av tumörtyp, cancerinitiering, progression och behandlingssvar.
Andningsfunktioner hos strukna vävnadsprover kan inte utvärderas intakta eftersom de primära substraten för OXPHOS inte är cellgenomsläppliga. För att övervinna denna begränsning kan mitokondrier beredas antingen genom isolering, kemisk permeabilisering eller mekanisk homogenisering. Mitokondriell isolering anses länge vara en guldstandard för utvärdering av andningsfunktionen. Det kräver dock stora mängder vävnad, är tidskrävande och är lågvkastande med möjlig urvalsbias för vissa fraktioner av mitokondrier4. Permeabilisering består av mekanisk separation och exponering av vävnadssektioner eller fiberbuntar till ett milt tvättmedel som selektivt försämrar plasmamembranet5. Permeabilization används ofta i strimmor vävnader såsom skelett och hjärtmuskel som enskilda fiber buntar kan retas isär. Jämfört med isolering ger permeabilisering mer mitokondrier i sin inhemska cellulära miljö och fysiska form5. Permeabilization har framgångsrikt tillämpats i andra vävnader såsom tumör6,7 och moderkakan8; Reproducerbarheten hos permeabiliserade fiberpreparat kan dock vara svår på grund av konsistensen av dissekering och syrekrav för att övervinna diffusionsbegränsningar9. Dessutom kan permeabiliserade fibrer vara olämpliga i vissa tumörtyper som är tätt cellulära och mycket fibrotiska. Vävnad homogenater genereras genom mekanisk störning av plasmamembranet och liknar permeabiliserade fibrer när det gäller mitokondriell avkastning och integritet10. Vävnads homogenater minimerar också begränsningarna av syrediffusion och kan lätt användas över vävnadstyper genom optimering av mekanisk kraft11,12.
Här beskriver vi en enkel och snabb metod för att kvantifiera frekvenser av oxidativ fosforylering (OXPHOS) och elektronöverföring (ET) kapacitet i nystrukna fasta tumör homogenater. Protokollet är optimalt utformat för att utvärdera färsk vävnad med hjälp av Oxygraph-2k (O2k) högupplöst respirometer, som kräver förkunskaper om instrumentell installation och kalibrering men kan anpassas på samma sätt med hjälp av någon Clark-typ elektrod, Seahorse-analysator eller plattläsare. Protokollet kan reproduceras mellan arter och tumörtyper samt anpassas för att utvärdera en mångfald av mitokondriella ET-vägar.
Metoder för att utvärdera mitokondriell andning vid cancer har till stor del begränsats till in vitro-modeller 13,14,15,16. Viss framgång har uppnåtts vid mätning av mitokondriell andning i tumörer med hjälp av kemisk permeabilisering6,7,17, men det finns ingen enhetlig, guldstandardmetod som kan tillämpas universellt och jämföras över tumörtyper. Dessutom har bristen på konsekvent dataanalys och rapportering begränsad datageneralisering och reproducerbarhet. Metoden beskrivs häri ger en enkel, relativt snabb strategi för att mäta mitokondriell andning18 i mitokondriellt preparat från nyligen strukits fasta tumör exemplar. Tumörer odlades från ortopiskt implanterade murin Luminal B, ERα-negativa EO771 bröstcancerceller19.
Flit och omsorg med vävnadshantering kommer avsevärt att förbättra noggrannheten och normaliseringen av syreförbrukningen. Vävnaden och mitokondrierna kan lätt skadas om provet inte hålls kallt, inte konsekvent är nedsänkt i konserveringsmedier eller hanteras alltför mycket, vilket resulterar i suboptimala rutiner och OXPHOS-hastigheter. Dessutom är noggrann våt vikt av homogeniserad vävnad av avgörande betydelse eftersom detta är den primära normaliseringsmetoden. Andra normaliseringsmetoder kan övervägas, såsom totalt protein eller mitokondriella specifika markörer, såsom citratsyntasaktivitet20. Dessutom måste vävnad heterogenitet åtgärdas, med beslut om tumör regioner att inkludera i experiment som gjorts a priori. Necrotic, fibrotic och bindväv får inte homogenisera och/eller respir väl och bör undvikas om inte avsiktligt analysera dessa tumör regioner. I synnerhet kan tumören vara mycket klibbig beroende på typ och excision region, vilket gör noggrann vägning och överföring mer utmanande. Antalet slag som används för homogeniseringar bör optimeras för att säkerställa fullständig förberedelse av mitokondrierna samtidigt som skadorna på de yttre mitokondriella membranen mildras.
För förbättrad noggrannhet och reproducerbarhet rekommenderar vi att optimeringsexperiment utförs för antalet slag för homogen beredning, vävnadskoncentration och substrat, frikopplings- och inhibitorkoncentrationer. Studier kan jämföra det olika antalet stroke och hur de motsvarar svar på tillsats av cytokrom c i studien samt den maximala mitokondriella andningskapaciteten 21. Även om det finns en allmän acceptans för att mindre cytokrom c svar är bättre, eftersom en ökning av syreförbrukningen efter tillsats av cytokrom c kan indikera skador på det yttre mitokondriella membranet, finns det ingen guldstandard för vad denna tröskel är för varje vävnad och bör undersökas experimentellt för att säkerställa att vävnaden inte är överarbetad eller underpreparerad. I denna tumör vävnad, det konstaterades att en cytokrom c svar under ~ 30% inte försämrade luftvägarna funktion. Cytokrom c användning blir avgörande för korrekt kvantifiering av andningskapacitet om testet är positivt. I detta fall fyller tillägget på endogen cytokrom c, vilket, om det utarmas, kommer att orsaka en underskattning av andningsfrekvenserna.
Vävnadskoncentration titreringsexperiment kan utföras över en rad möjliga koncentrationer och skulle helst göras med SUITs som kommer att undersökas under studien. Andningskapaciteten varierar beroende på tumörtyp och sammansättning. Således kommer tumörer täta med mitokondrier eller hög andningskapacitet att kräva lägre koncentrationer (0,5-5 mg/ml). Tumörer med få mitokondrier eller låg andningskapacitet kommer att kräva högre koncentrationer (7-12 mg/ml). Dessutom kan SUITs som är långa eller har mycket konsumerade substrat behöva mindre vävnad för att förhindra reoxygenation av kammaren eller ADP-begränsning. Vissa vävnader kommer att ha ett linjärt samband i syreförbrukningen, medan andra kommer att visa förbättrad känslighet och maximal oxidation vid vissa koncentrationsområden. Den valda vävnadskoncentrationen bör optimeras för att maximera syreflödet samtidigt som antalet reoxygenerationshändelser begränsas. Dessutom är det ofta bättre att överskatta behovet eller sikta på den högre änden av koncentrationsområdet. Inhibitorerna, som är väsentliga för mängden andningsflöde, är mer exakta när de används i större pooler av mitokondrier.
En annan viktig faktor är koncentrationen av de läkemedel som används under protokollen. Förändringar i homogenkoncentrationen kan förändra koncentrationerna av substrat, uncouplers och inhibitorer som krävs för maximal respons. Således, när det optimala koncentrationsområdet har valts, bör ett experiment som testar de doser som krävs för SUIT-protokollet utföras. Ytterligare ADP kan tillsättas för att säkerställa att adenylatkoncentrationerna inte begränsas till andningsflöde. Kemiska uncouplers som FCCP eller CCCP kommer att hämma andning vid högre koncentrationer22. Som sådan är det viktigt att titrera i små mängder för att avslöja den maximala uppnådda hastigheten. Inhibitorer, såsom rotenon och antimycin A, används bäst när de är mättade inom den första injektionen. Medan optimala koncentrationer fastställdes i preliminära experiment, har vi också observerat behandlingsrelaterade skillnader som svar på inhibitorer och därmed ofta lägga till en ytterligare injektion av inhibitorer för att visa maximal hämning eftersom de resulterande frekvenserna tjänar som grund för kvantifiering. Kemisk hämning av Ascorbate/TPMD är avgörande för noggrann analytisk reduktion eftersom TMPD genomgår autooxidation23. Vi kontrollerade för automatisk oxidation av ascorbate/TMPD/cytokrom c genom tillsats av natriumazid, en etablerad CIV-hämmare. För Km-studierna förhindrar tillsats av rotenon i närvaro av enbart succinate oxaloacetat ackumulering som kan hämma konjak dehydrogenasaktivitet vid låga koncentrationer24. Volymen och koncentrationen av ADP är mycket beroende av mitokondriernas känslighet för den rådande substratkombinationen. Mitokondriella preparat som är mycket känsliga för ADP kommer att kräva lägre startkoncentrationer. Dessutom är validerade kemikalier och korrekt läkemedelsberedning med uppmärksamhet på pH, ljuskänslighet om tillämpligt och lagringstemperatur avgörande för framgångsrika experiment.
Instrumentinställning och rutinvård är av avgörande betydelse för framgången för dessa experiment. Adekvat och korrekt rengöring av kamrarna är avgörande för reproducerbarhet och förebyggande av biologisk, protein-, hämmare eller frikopplingskontaminering. Elektroder av Clark-typ och O2k-system använder glasreaktionskammare vilket är en betydande kostnadsfördel för plåtbaserade system som är beroende av förbrukningsvaror. Glaskamrarna måste dock rengöras kraftigt och kan vara en källa till inhibitorkontaminering i efterföljande studier. Inkubation med mitokondririka exemplar under tvättprocessen (isolerad hjärt- eller lever mitokondrier, till exempel) kan minska risken för experimentell förorening och rekommenderas utöver utspädning och alkoholbaserade tvättprocedurer. Om på varandra följande studier körs minimerar rengöring med etanol och mitokondrier risken för inhibitorkontaminering. Kalibrering av syresensorn rekommenderas före varje experiment för att få exakta mätningar av andning i förhållande till det rådande partiella syretrycket. Om flera kalibreringar inte är möjliga kan en kalibrering om dagen vara tillräcklig om syrekoncentrationen förblir stabil och jämn efter tvättproceduren.
De procedurer som beskrivs ovan utnyttjar Oroboros O2k-instrumentet för att mäta syreförbrukning i tumörvävnad inom 4 timmar efter tumörexcision med hjälp av tidigare utformad och optimerad konserveringslösning och andningsmedier25,26,27. Flera parametrar i det här protokollet kan ändras för efterföljande program. Instrumentinställningen och kalibreringen, homogenisatorerna som används för vävnadsberedning och optimal homogenis- och kammarsyrekoncentration kan alla anpassas för användning på andra instrument med syreövervakningspotential. Till exempel var kamrarna något överfyllda när man lägger till homogen, och således när kammaren är helt stängd förblir kammaren kapillären full. Detta kommer att konsumera lite syre i kammaren, men med optimering av provkoncentrationen kan vi redogöra för denna förbrukning för att bestämma vilken syrenivå vi ska börja med. Alternativt kan provet tillåtas att balansera vid omgivande syre innan kammaren stängs, men detta ökar ofta tiden innan experimentet startar och fördröjer tillsatsen av substrat. Medan homogenisatorer som används i detta protokoll är allmänt tillgängliga, kan andra kommersiella homogeniseringstekniker användas, till exempel en vävnadsförstörare eller automatiserad homogenisator28.
Dessutom kan vävnadsberednings- och instrumentprocedurerna användas med ett antal olika SUITs för att studera andningskontroll genom en mångfald av kopplings- och vägkontrolltillstånd29. Dessa SUIT-protokoll har utvecklats för att mäta funktionskapacitet, och därmed har bidraget från potentiella endogena substrat ingen inverkan på kapacitetsmätningen. Vi tar analytiskt hänsyn till icke-mitokondriell syreförbrukning och/eller restförbrukning av homogenatet genom subtraktion av antimycin A-rotenone, eller natrium azid okänsliga priser, när så är lämpligt. Mitokondrier kan förbli livskraftiga i BIOPS eller liknande konstruerade konserveringslösningar under längre tidsperioder (>24 h) beroende på vävnadstyp och intakthet30,31. Studier kan utföras i förväg för att fastställa de tidsmässiga lagringsgränserna eftersom OXPHOS för vissa substrat kan ha olika begränsningar. Detta är viktigt om experimentet inte kan utföras inom flera timmar efter vävnad excision/biopsi. 37°C är en optimal och fysiologisk temperatur för utvärdering av andningsfunktionen i de flesta däggdjurssystem. Om analystemperaturen verkar störa utvärdering32kan jämförande studier dock genomföras över ett brett temperaturområde (25–40 °C) för att säkerställa tillräcklig respons. Instrumentella begränsningar kan begränsa förmågan att genomföra sådana studier.
Större begränsningar av ovannämnda metod är 1) risken för skador på mitokondrier genom mekanisk homogenisering, 2) förekomst av ATPases eller andra subcellulära biokemikalier i homogena preparat som kan störa samtidig bestämning av ATP eller andra variabler av intresse och kan kräva ytterligare korrigeringsmetoder eller inhibitoranvändning33 , och 3) Utvärdering av många prover och/eller flera SUIT per prov är tidskrävande eftersom ett instrument kan rymma två experiment i taget och kräver rengöring och inrättande mellan på varandra följande experiment. Optimeringsexperiment och konsekvent förberedelse av prover kan minimera betydande mitokondriella skador som skulle bidra till inkonsekventa data.
Metodens betydelse för befintliga/alternativa metoder är förbättrad genomförbarhet jämfört med mängden startmaterial, utmaning att isolera mitokondrier eller teknisk utmaning i permeabiliserande vävnad. Beredning av homogenater är snabbare, syre är inte alls lika begränsande och är mindre mottagligt för variabilitet mellan personal jämfört med permeabiliserad vävnad. Viktigt är att nästan alla provtyper är lämpliga för homogen beredning som möjliggör jämförande analys mellan vävnader. Högupplöst respirometri är guldstandardmätningen av mitokondriell OXPHOS och ET. Tillämpningen av denna metod i preklinisk och klinisk cancerforskning har kapacitet att utöka nuvarande in vitro-undersökningar till ex vivo-studier. Dessutom erbjuder det potentiella applikationer i kliniska och diagnostiska inställningar.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Pennington Biomedical Research Center Comparative Biology Core personal för djurvård. Denna forskning stöddes delvis av National Institute of Health grants U54GM104940 (JPK) och KL2TR003097 (LAG). Alla experiment och försök med djur godkändes av Pennington Biomedical Research Center Institutional Animal Care and Use Committee.
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A2383 | |
Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4544 | |
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock, fatty acid free | Sigma-Aldrich | 3117057001 | Roche |
BD 50 mL Luer-Lok Syringe | Fisher Scientific | 13-689-8 | |
BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C4830 | |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | |
Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C2506 | |
Datlab 7.4 software | Oroboros Instruments | ||
Dimethylsulfoxide | Amresco | N182 | |
Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
D-Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Dumoxel, autoclavable |
Dumont # 7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumoxel, autoclavable |
Digital Calipers 150 mm/6 in | World Precision Instruments | 501601 | |
EO771 cells | CH3 BioSystems | SKU: 94APV1-vial-prem | Pathogen Tested |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | |
Female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Stock #000664 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750 | |
Kimwipes | Fisher Scientific | 34120 | |
L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | G1626 | |
Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | L2398 | |
Malate | Sigma-Aldrich | M6413 | |
Matrigel Matrix | Corning | 354248 | |
MgCl·6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Microsyringes | Hamilton | 87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943 | |
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | T7394 | |
Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10023-03 | |
Oxygraph-2k FluoRespirometer | Oroboros Instruments | 10003-01 | |
PBS | Gibco | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | P1767 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
RPMI 1640 | Gibco | 21875034 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
Succinate (disodium) | Sigma-Aldrich | W327700 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
Whatman Filter Paper, grade 5 | Sigma-Aldrich | 1005-090 | |
Wheaton Tenbroeck Tissue Grinder, 7 mL | Duran Wheaton Kimble | 357424 | |
Straight Tip Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5914SC | |
Non-Safety Scalpel No. 11 | McKesson | 1029065 | |
BD Precision Glide Needle 27 G x 1/2 | Becton, Dickinson and Company | 305109 | |
BD Precision Glide Needle 18 G x 1 | Becton, Dickinson and Company | 305195 | |
BD 1mL Slip Tip Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
Pyrex Reusable Petri Dish, 60 mm | Thermo Fisher Scientific | 316060 | |
Rodent Very High Fat Diet, 60% kcal from fat, 20% kcal from protein, and 20% kcal from carbohydrate | Research Diet | D12492 | |
Pyrex Watch Glass, 100 mm | Thermo Fisher Scientific | S34819 |