Design og udvikling af en model til at studere effekten af supplerende ilt på cystisk fibrose Luftvejene Mikrobiom
Summary
Målet med denne protokol er at udvikle et modelsystem for effekten af hyperoxi på cystisk fibrose luftvejs mikrobielle samfund. Kunstigt spyt medium emulerer sammensætningen af spyt, og hyperoxiske kulturforhold modellerer virkningerne af supplerende ilt på lungemikrobielle samfund.
Abstract
Luftvejs mikrobielle samfund menes at spille en vigtig rolle i udviklingen af cystisk fibrose (CF) og andre kroniske lungesygdomme. Mikrober er traditionelt blevet klassificeret baseret på deres evne til at bruge eller tolerere ilt. Supplerende ilt er en almindelig medicinsk behandling administreres til mennesker med cystisk fibrose (pwCF); men eksisterende undersøgelser af ilt og luftvejene mikrobiom har fokuseret på, hvordan hypoxi (lavt iltindhold) snarere end hyperoxi (høj ilt) påvirker overvejende aerob og fakultetet anaerob lunge mikrobielle samfund. For at løse dette kritiske videnskløft blev denne protokol udviklet ved hjælp af et kunstigt spytmedie, der efterligner sammensætningen af spyt fra pwCF. Brugen af filtersterilisering, som giver et gennemsigtigt medium, gør det muligt for optiske metoder at følge væksten af encellede mikrober i suspensionskulturer. For at skabe hyperoxiske tilstande drager dette modelsystem fordel af etablerede anaerobe dyrkningsteknikker til at studere hyperoxiske tilstande; i stedet for at fjerne ilt tilsættes ilt til kulturer ved daglig sparging af serumflasker med en blanding af trykluft og luft. Sputum fra 50 pwCF gennemgik daglig sparging i en 72-timers periode for at kontrollere denne models evne til at opretholde differentierede iltforhold. Shotgun metagenomic sekventering blev udført på kultiverede og uncultured spyt prøver fra 11 pwCF at kontrollere evnen til dette medium til at støtte væksten af commensale og patogene mikrober almindeligt forekommende i cystisk fibrose spyt. Vækstkurver blev opnået fra 112 isolater opnået fra pwCF for at kontrollere dette kunstige spytmediums evne til at understøtte væksten af almindelige cystisk fibrosepatogener. Vi finder, at denne model kan kultur en bred vifte af patogener og commensals i CF spyt, genvinder et samfund meget lig uncultured spyt under normoxiske forhold, og skaber forskellige kultur fænotyper under varierende ilt betingelser. Denne nye tilgang kan føre til en bedre forståelse af uventede virkninger forårsaget af brugen af ilt i pwCF på luftvejsmikrobielle samfund og almindelige respiratoriske patogener.
Introduction
Cystisk fibrose (CF) er en genetisk sygdom karakteriseret ved en manglende evne til at rydde tyk slim fra lungerne, hvilket fører til gentagne infektioner og progressiv lungefunktion tilbagegang, der ofte resulterer i behovet for lungetransplantation eller død. Luftvejens mikrobiom hos mennesker med cystisk fibrose (pwCF) synes at spore sygdomsaktivitet1, med en reduktion i mikrobiel mangfoldighed forbundet med negative langsigtede resultater2,3. I kliniske undersøgelser af pwCF, supplerende iltbehandling har været forbundet med mere avanceret sygdom4,5, men traditionelt, brugen af iltbehandling er blevet betragtet som blot en markør for sygdommens sværhedsgrad6. Nylige undersøgelser fra et klinisk forsøg med patienter med respirationssvigt har vist, at højere patientens iltniveau paradoksalt nok er forbundet med en stigning i alvorlige bakterieinfektioner og højere dødelighed7, hvilket tyder på, at supplerende ilt kan bidrage til sygdomspatogenese. Effekten af supplerende ilt på cystisk fibrose lungemikrobiom og tilhørende lunge-og luftveje mikrobielle samfund er ikke blevet godt undersøgt.
Mekanistiske undersøgelser kan ofte ikke udføres direkte på mennesker på grund af logistiske vanskeligheder og potentielle etiske spørgsmål forbundet med interventioner af ukendt medicinsk fordel eller skade. Translationelle tilgange, der integrerer menneskelige biospecimens i modelsystemer, kan give vigtig biologisk indsigt i disse tilfælde. Mens evnen til at bruge eller tolerere ilt traditionelt har været en vigtig del af mikrobielle klassificering, lidt vides om, hvordan den terapeutiske indførelse af supplerende ilt til miljøet kan forstyrre luftvejene mikrobielle samfund. For at kaste lys over de ukendte virkninger af supplerende ilt på luftvejene mikrobiomer af pwCF, vi havde brug for at løse to store udfordringer; for det første oprettelsen af et kulturmedium, der fysiologisk tilnærmer sammensætningen af CF sputum; for det andet oprettelsen af et modelsystem, der gør det muligt at opretholde forhøjede iltkoncentrationer i kulturen over længere tid.
Kunstige spytmedier (ASM) bruges i vid udstrækning til at efterligne lungesputum ex vivo8,9,10, men der er ingen klar konsensus om en bestemt opskrift. Denne protokol beskriver en kunstig spyt medium opskrift og forberedelse strategi omhyggeligt designet til fysiologisk omtrentlige spyt fra pwCF. Tabel 1 skitserer de valgte opskriftsværdier baseret på udgivet litteratur. Grundlæggende kemiske komponenter og pH blev matchet med værdier, der blev identificeret ved undersøgelser af human CF sputum11,12,13. Lav koncentration fysiologiske næringsstoffer blev tilsat ved hjælp af æggeblomme, som blev inkluderet som 0,25% af det endelige volumen10, samt vitamin og spormetal blander14,15. Mucin, den vigtigste komponent i spyt16, blev inkluderet på 1% w /v14. Selvom mere arbejdskrævende, filter sterilisering blev valgt over de mere konventionelle praksis med varme sterilisering for at reducere potentielle problemer fra varme-induceret denaturering af væsentlige mediekomponenter10. En yderligere fordel ved filtersterilisering er, at det genererer medier, der er gennemsigtige (varmesterilisering kan skabe uklare medier på grund af nedbør og koagulering af salte og proteiner), hvilket gør det muligt at bruge dette kunstige spytmedier til at følge mikrobiel vækst baseret på stigninger i turbiditet.
Dette modelsystem til den hyperoxiske kultur er baseret på anaerobe dyrkningsteknikker, hvor ilt tilsættes i stedet for at fjernes, hvilket skaber en model for effekten af supplerende iltforbrug til pwCF. Figur 1 og den tilhørende iltskåringsprotokol skitserer komponenterne i et iltskåringssystem, som kan opnås til lave omkostninger fra almindelige laboratorie- og hospitalsleverandører. Dette system gør det muligt at blande trykluft og luft til faste koncentrationer fra 21%-100% ilt. Integrationen af en iltsensor gør det muligt at kontrollere koncentrationen af outputgasblandingen samt kontrollere udstrømningsgassammensætningen af tidligere sparrede serumflasker for at kontrollere, at iltforholdene er blevet opretholdt inden for det ønskede interval.
Denne protokol skitserer procedurer for at skabe et kunstigt spyt medium, opførelse og brug af en ilt sparging system, og anvendelsen af både til kultur CF spyt under differentierede ilt betingelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne undersøgelse blev der udviklet en in vitro-model for at studere hyperoxiaens virkning på lungemikrobielle samfund. Denne model, der er baseret på kunstigt spyt medium og daglig sparging af serumflasker, opretholder forhøjede iltkoncentrationer og understøtter væksten af mikrober identificeret i spyt fra pwCF.
Der er flere kritiske trin i denne tilgang. For det første er valget om at bruge filtersterilisering i stedet for varmesterilisering af det kunstige spytmedie. Fil…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
En del af dette arbejde blev udført på Marine Biological Lab med støtte fra Marine Biological Lab, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (tilskudsnummer 5600373) og en gave fra Simons Foundation.
Materials
| BME Vitamins (100x) Solution | MilliporeSigma | B6891 | Concentrated solution of supplemental vitamins. |
| Crimper, 30 mm | DWK Life Sciences | 224307 | Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles. |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | Solid glucose powder (dextrorotatory isomer). |
| Diaphragm Pump ME 2 NT | VACUUBRAND | 20730003 | Vacuum pump for vacuum filtration. |
| Egg Yolk Emulsion | HiMedia | FD045 | Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline. |
| Ferritin, Cationized from Horse Spleen | MilliporeSigma | F7879 | Ferritin (iron-storage protein) solution. |
| FIREBOY plus Safety Bunsen Burner | Integra Biosciences | 144000 | Bunsen burner with user interface and safety features. |
| Hydrion pH Paper (1.0–14.0) | Micro Essential Laboratory | 94 | pH testing paper for the range of 1.0–14.0. |
| Hydrion pH Paper (4.0–9.0) | Micro Essential Laboratory | 55 | pH testing paper for the range of 4.0–9.0. |
| Hydrion pH Paper (6.0–8.0) | Micro Essential Laboratory | 345 | pH testing paper for the range of 6.0–8.0. |
| Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G | Smiths Medical | 401815 | 18 G needles with safety caps. |
| In-Line Pressure Gauge | MilliporeSigma | 20469 | Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure. |
| Innova 42 Incubated Shaker | Eppendorf | 2231000756 | Combination incubator/orbital shaker. |
| Luer-Lok Syringe with Attached Needle | Becton Dickinson | 309580 | Combination 3 mL syringe and 18 G needle. |
| Luer Valve Assortment | World Precision Instruments | 14011 | Valves for gas flow tubing. |
| LSE Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | 6780-NP | Orbital shaker to agitate media during filtration. |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | MilliporeSigma | M2773 | Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate). |
| Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-346-15FM | Air flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| MEM Amino Acids (50x) Solution | MilliporeSigma | M5550 | Concentrated solution of essential amino acids. |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution | MilliporeSigma | M7145 | Concentrated solution of non-essential amino acids. |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | MilliporeSigma | SLMP25SS | 0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter. |
| Milli-Q Academic | MilliporeSigma | ZMQS60E01 | Milli-Q sterile water filtration system. |
| MiniOX 3000 Oxygen Monitor | MSA | 814365 | Gas flow oxygen percentage monitor. |
| MOPS Buffer (1 M, pH 9.0) | Boston BioProducts | BBM-90 | MOPS buffer for adjusting media pH. |
| Mucin from Porcine Stomach | MilliporeSigma | M2378 | Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder. |
| Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit | Harvard Apparatus | 72-1413 | Connectors for gas flow tubing. |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Library preparation for identification during sequencing. |
| NovaSeq 6000 Sequencing System | Illumina | 770-2016-025-N | Shotgun sequencing platform for generating sample reads. |
| Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-540-15FM | Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors | SunMed | 2001-01 | Tubing for connecting gas system components. |
| Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 | Molecular Biologicals International | MRGF-6235 | Concentrated phosphate-buffered saline solution. |
| PC 420 Hot Plate/Stirrer | Marshall Scientific | CO-PC420 | Combination hot plate/stirrer. |
| Potassium Chloride | MilliporeSigma | P9541 | Solid potassium chloride salt. |
| PTFE Disposable Stir Bars | ThermoFisher Scientific | 14-513-95 | Disposable magnetic stir bars. |
| PTFE Thread Seal Teflon Tape | VWR | 470042-938 | Teflon tape for reinforcing gas system connections. |
| Q-Gard 2 Purification Cartridge | MilliporeSigma | QGARD00D2 | Purification cartridge for Milli-Q system. |
| Reusable Media Storage Bottles | ThermoFisher Scientific | 06-423A | Bottles for mixing and storing culture media. |
| Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl | DWK Life Sciences | 224100-331 | Rubber stoppers for serum bottles. |
| Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL | DWK Life Sciences | 223952 | Glass serum bottles for sealed culturing. |
| Small Bore Extension Set | Braun Medical | 471960 | Tubing extension with luer lock connectors. |
| Sodium Chloride | MilliporeSigma | S3014 | Solid sodium chloride salt. |
| Spike-in Control I (High Microbial Load) | ZymoBIOMICS | D6320 | Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations |
| Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System | MilliporeSigma | S2GPU02RE | 250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber. |
| Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes | Professional Disposables International | H04082 | Disposable germicidal wipes for sterilization. |
| Trace Metals Mixture, 1000x | ThermoFisher Scientific | NC0112668 | Concentrated solution of physiological trace metals. |
| Unlined Aluminum Seal, 30 mm | DWK Life Sciences | 224187-01 | Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers. |
| USP Medical Grade Air Tank | Airgas | AI USP200 | Compressed air tank for input to sparging system. |
| USP Medical Grade Oxygen Tank | Airgas | OX USP200 | Compressed oxygen tank for input to sparging system. |
References
- Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLoS One. 13 (3), 0194060 (2018).
- Acosta, N., et al. Sputum microbiota is predictive of long-term clinical outcomes in young adults with cystic fibrosis. Thorax. 73 (11), 1016-1025 (2018).
- Muhlebach, M. S., et al. Initial acquisition and succession of the cystic fibrosis lung microbiome is associated with disease progression in infants and preschool children. PLoS Pathogens. 14 (1), 1006798 (2018).
- Zolin, A., Bossi, A., Cirilli, N., Kashirskaya, N., Padoan, R. Cystic fibrosis mortality in childhood. Data from European cystic fibrosis society patient registry. International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (9), (2018).
- Ramos, K. J., et al. Heterogeneity in survival in adult patients with cystic fibrosis with FEV1 30% of predicted in the United States. Chest. 30 (6), 1320-1328 (2017).
- Ramos, K. J., et al. Predictors of non-referral of patients with cystic fibrosis for lung transplant evaluation in the United States. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (2), 196-203 (2016).
- Girardis, M., et al. Effect of conservative vs conventional oxygen therapy on mortality among patients in an intensive care unit: The Oxygen-ICU randomized clinical trial. JAMA. 316 (15), 1583-1589 (2016).
- Comstock, W. J., et al. The WinCF model – An inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55532 (2017).
- Diraviam Dinesh, S. Artificial sputum medium. Protocol Exchange. , (2010).
- Kirchner, S., et al. Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857 (2012).
- Grandjean Lapierre, S., et al. Cystic fibrosis respiratory tract salt concentration: An Exploratory Cohort Study. Medicine. 96 (47), 8423 (2017).
- Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
- Van Sambeek, L., Cowley, E. S., Newman, D. K., Kato, R. Sputum glucose and glycemic control in cystic fibrosis-related diabetes: a cross-sectional study. PLoS One. 10 (3), 0119938 (2015).
- Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846 (2016).
- Gallagher, T., et al. Liquid chromatography mass spectrometry detection of antibiotic agents in sputum from persons with cystic fibrosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 65 (2), (2021).
- Voynow, J. A., Rubin, B. K. Mucins, mucus, and sputum. Chest. 135 (2), 505-512 (2009).
- Sui, H. Y., et al. Impact of DNA extraction method on variation in human and built environment microbial community and functional profiles assessed by shotgun metagenomics sequencing. Frontiers in Microbiology. 11, 953 (2020).
- McIver, L. J., et al. bioBakery: a meta’omic analysis environment. Bioinformatics. 34 (7), 1235-1237 (2018).
- Truong, D. T., et al. MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling. Nature Methods. 12 (10), 902-903 (2015).
- Stammler, F., et al. Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria. Microbiome. 4 (1), 28 (2016).
- Henke, M. O., Renner, A., Huber, R. M., Seeds, M. C., Rubin, B. K. MUC5AC and MUC5B mucins are decreased in cystic fibrosis airway secretions. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 86-91 (2004).
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyper concentration and increased osmotic pressure. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy. American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).
- Ibanez de Aldecoa, A. L., Zafra, O., Gonzalez-Pastor, J. E. Mechanisms and regulation of extracellular DNA release and its biological roles in microbial communities. Frontiers in Microbiology. 8, 1390 (2017).
- Tunney, M. M., et al. Detection of anaerobic bacteria in high numbers in sputum from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (9), 995-1001 (2008).
- Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Investigation. 109 (3), 317-325 (2002).
