Her presenterer vi en protokoll for å isolere kjerner av høy kvalitet fra frosne musenyrer som forbedrer representasjonen av medulære nyrecelletyper og unngår genuttrykksartefakter fra enzymatisk vevsdissosiasjon.
Nyrene regulerer ulike biologiske prosesser som vann, elektrolytt og syre-base homeostase. Fysiologiske funksjoner av nyrene utføres av flere celletyper arrangert i en kompleks arkitektur over organets kortikomedullære akse. Nylige fremskritt innen enkeltcelletranskriptomikk har akselerert forståelsen av celletypespesifikt genuttrykk i nyrefysiologi og sykdom. Imidlertid krever enzymbaserte vevsdissosiasjonsprotokoller, som ofte brukes til enkeltcelle RNA-sekvensering (scRNA-seq), for det meste friskt (ikke-arkivert) vev, introduserer transkripsjonelle stressresponser og favoriserer valg av rikelig celletyper i nyrebarken, noe som resulterer i en underrepresentasjon av celler i medulla.
Her presenterer vi en protokoll som unngår disse problemene. Protokollen er basert på kjerneisolering ved 4 °C fra frosset nyrevev. Kjerner er isolert fra et sentralt stykke av musnyren som består av cortex, ytre medulla og indre medulla. Dette reduserer overrepresentasjonen av kortikale celler som er typiske for hele nyreprøver til fordel for medulære celler, slik at data vil representere hele kortikomedullære akse i tilstrekkelig overflod. Protokollen er enkel, rask og tilpasningsdyktig og gir et skritt mot standardisering av enkeltkjernetranskriptomikk i nyreforskning.
Nyrer viser en svært kompleks vevsarkitektur. De består av funksjonelt og anatomisk distinkte segmenter langs en kortikomedullær akse og formidler biologiske funksjoner, for eksempel regulering av ekstracellulært væskevolum, elektrolyttbalanse eller syre-base homeostase1.
Fremskritt innen enkeltcelletranskriptomikk har muliggjort grundig karakterisering av komplekse vev og akselerert forståelsen av segment- og celletypespesifikt genuttrykk i nyrefysiologi, utvikling og sykdom 2,3,4.
Imidlertid viser de enzymbaserte dissosiasjonsprotokollene som ofte brukes til scRNA-seq, flere ulemper og begrensninger. Avhengig av protokollen genererer de transkripsjonelle stressresponser og vevsdissosiasjonsskjevhet mot lettere å dissosiere kortikale celletyper 5,6. Selv om protokoller som bruker kaldaktive proteaser for embryonale nyrer, er i stand til å redusere stressrelaterte transkripsjonsendringer, klarer de ikke å overvinne dissosiasjonsskjevheten mot kortikale celler og kan ikke lett tilpasses forskjellige typer syke nyrevev7. I tillegg er enkeltcellede tilnærminger ikke lett kompatible med frosne vevsprøver, og begrenser deres anvendelse hovedsakelig til ikke-arkivert, ferskt vev, noe som gjør vevssamlingen til en begrensende faktor6.
RNA-sekvensering med enkeltkjerner (snRNA-seq) kan omgå disse begrensningene 8,9. Her presenterer vi en protokoll for kjerneisolering fra et sentralt stykke frosset voksent nyrevev fra mus (figur 1)10. Vår protokoll er enkel og gir en standardisert tilnærming for å oppnå RNA-sekvenseringsbiblioteker med en balansert representasjon av forskjellige nyrecelletyper for eksperimentelle modeller som ikke involverer sterke regionale vevsendringer. I sistnevnte tilfelle kan protokollen vår også utføres med hele nyrer.
Enkeltcelle transkriptomikk fremmer forståelsen av celletypespesifikt genuttrykk i nyrefysiologi og sykdom. Her ga vi en enkel og reproduserbar metode for å isolere enkeltkjerner av høy kvalitet fra frosset musnyrevev for snRNA-seq på en standardisert måte.
For snRNA-seq er det avgjørende å bruke kjerner av høy kvalitet som input for bibliotekgenerering og for å unngå RNA-nedbrytning under vevsbehandling. Derfor er inkubasjon av vevsstykker i RNA-stabiliseringsløsning umiddelbart etter disseksjon avgjørende for å beskytte og stabilisere cellulært RNA og gjør det mulig å lagre prøver ved – 80 ° C på ubestemt tid. Ved bruk av denne protokollen på frosset vev uten RNA-stabiliseringsløsningsbehandling, for eksempel arkivmateriale, er det nødvendig med en prøvekjøring, og RNA-kvaliteten må vurderes da vi observerte et signifikant tap av RNA-integritet i snapfrosset vev uten tidligere inkubasjon i RNA-stabiliseringsløsning.
Generelt er riktig prøvehåndtering avgjørende for å maksimere utvinningen av intakte, enkle kjerner. Alle opphengstrinn skal utføres forsiktig ved å pipettere for å unngå skjærbelastning og fysisk skade. Buffere for de endelige kjernene resuspensjon og kjernesortering bør inneholde BSA for å unngå kjernetap og aggregering.
Buffervolumer i denne protokollen er optimalisert for svært små vevsprøver (~15 mg). Det er avgjørende å sikre fullstendig cellelyse og tilstrekkelig vask for å generere suspensjoner av høy kvalitet. Større vevsblokker eller hele nyreprøver vil resultere i overdreven kjernekonsentrasjoner som fører til klumping og aggregering, høy overflod av omgivende RNA og generelt dårlig suspensjonskvalitet. Hvis større prøver eller annet vev behandles, anbefales det sterkt å utføre prøvekjøringer for å bestemme optimale buffervolumer for minimale omgivende RNA-nivåer. Kjerne- og RNA-kvalitet og konsentrasjoner må undersøkes nøye, da overbelastning resulterer i generelt dårlig ytelse.
I tillegg påvirker store mengder celleavfall, som forårsaker høye nivåer av omgivende RNA som ikke er forbundet med enkeltkjerner, sekvenseringsresultatene negativt. Avklaring av kjernesuspensjonen ved sentrifugering gjennom en sukrosepute demper dette problemet til en viss grad, men det kan også føre til skjevhet i cellerepresentasjon ved motseleksjon mot tette, små kjerner som finnes for eksempel i immunceller16. Hvis dette er bekymret, bør sukrosegradienten utelates. Derimot fant vi at flowcytometri basert på DAPI-farging var avgjørende for å redusere mengden celleavfall for å produsere en enkelt kjernesuspensjon av høy kvalitet.
Isoleringen av enkeltkjerner har betydelige fordeler sammenlignet med enkeltcelletilnærminger8. Den er kompatibel med riktig frosset vev, noe som gjør vevssamlingen mer fleksibel, og omgår behovet for enzymbasert vevsdissosiasjon, som kan introdusere transkripsjonelle stressresponser 6,17. Videre overvinner den dissosiasjonsskjevheten som favoriserer valget av lett dissosiable celletyper i nyrebarken, noe som kan føre til en underrepresentasjon av medulære celletyper i noen enzymbaserte tilnærminger 5,6,10.
Ved å bruke et sentralt nyrestykke i stedet for hele nyrevevet sparer du ytterligere ressurser og korrigerer for overrepresentasjon av rikelig med celletyper som beskrevet tidligere10. Avhengig av musemodellen eller fenotypen som er undersøkt, kan det imidlertid være fordelaktig å bruke hele nyreprøver i stedet for en enkelt midtskive. Hele nyreprøver kan være mer representative for sanne celleproporsjoner, eller forandringer som forekommer i hele nyrene, mens en trimmet midtskive viste seg å være fordelaktig for medullære fenotyper eller når prøvematerialet var begrenset. Denne avgjørelsen er derfor svært brukerspesifikk og bør vurderes nøye.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Scientific Genomics Platform ved Max Delbrück Center for Molecular Medicine i Helmholtz Association, Berlin for teknisk støtte.
JL og KMSO ble støttet av German Research Foundation (DFG) Research Training Group GRK 2318 og av Research Unit FOR 2841. KMSO ble støttet av Collaborative Research Grant 1365. AB ble støttet av midler fra Gottfried Wilhelm Leibniz-prisen fra DFG tildelt NR.
Cell sorter | – | – | For fluorescence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter. |
Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811000015 | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | Needs to contain DAPI light cube to count nuclei. Alternatively, nuclei can be counted manually under fluorescence microscope. |
4′,6-Diamidino-2-phenyl-indol-dihydrochlorid (DAPI) | Biotrend | 40043/b | Stock solution prepared with a concentration of 100 µM. Used for nuclei staining in a final concentration of 2 µM. |
D(+)-Sucrose ≥99.9%, ultrapure DNAse-, RNAse-free | VWR | 0335-500G | |
DNA LoBind Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22431021 | |
Ethanol, 70 % | – | – | |
FACS tubes | pluriSelect | 43-10100-46 | |
KIMBLE Dounce tissue grinder set 2 mL complete | Sigma-Aldrich | D8938-1SET | |
Minisart Syringe Filters 0.2 µm | Sartorius | 16534-GUK | |
Nuclease-free Water | Invitrogen | AM9937 | |
Nuclei EZ Prep Nuclei Isolation Kit | Sigma-Aldrich | NUC-101 | Nuclei EZ Lysis Buffer (Product No. N3408) needed for buffer preparation. |
PBS (Phosphate-Buffered Saline) 1X without calcium or magnesium | Corning | 21-040-CV | |
Petri dishes, polystyrene 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
pluriStrainer Mini 100 µm | pluriSelect | 43-10100-46 | |
pluriStrainer Mini 20 µm | pluriSelect | 43-10020-40 | |
pluriStrainer Mini 40 µm | pluriSelect | 43-10040-40 | |
Polystyrene Centrifuge Tube (15 mL) | Falcon | 352099 | |
Razor blades | – | – | |
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | EO0384 | |
Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S | Follow manufacturer's instructions (https://international.neb.com/products/s1402-ribonucleoside-vanadyl-complex#Product%20Information). Upon use the 200 mM stock solution is reconstituted to a green-black clear solution by incubating at 65 °C. |
RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | |
RNase AWAY | Fisher Scientific | 11952385 |