Måling mitokondrie substrat flux i rekombinant perfringolysin O-Permeabilized celler

Summary

I dette arbejde beskriver vi en modificeret protokol til test af mitokondriesubstratstrømpe ved hjælp af rekombinant perfringolysin O i kombination med mikropladebaseret respirometri. Med denne protokol viser vi, hvordan metformin påvirker mitokondrie respiration af to forskellige tumorcellelinjer.

Abstract

Mitokondrie substrat flux er et kendetegn ved hver celletype, og ændringer i dens komponenter såsom transportører, kanaler eller enzymer er involveret i patogenesen af flere sygdomme. Mitokondrie substrat flux kan studeres ved hjælp af intakte celler, permeabilized celler, eller isolerede mitokondrier. Undersøgelse af intakte celler støder på flere problemer på grund af samtidig oxidation af forskellige substrater. Desuden indeholder flere celletyper interne lagre af forskellige substrater, der komplicerer resultatfortolkning. Metoder såsom mitokondrie isolation eller ved hjælp af permeabilizing agenter er ikke let reproducerbare. Isolering af ren mitokondrier med intakte membraner i tilstrækkelige mængder fra små prøver er problematisk. Brug af ikke-selektive permeabilizers forårsager forskellige grader af uundgåelige mitokondrie membran skader. Rekombinant perfringolysin O (rPFO) blev tilbudt som en mere passende permeabilizer, takket være sin evne til selektivt permeabilize plasmamembran uden at påvirke mitokondrie integritet. Når det bruges i kombination med mikroplade respirometri, det gør det muligt at teste flux af flere mitokondrie substrater med nok replikerer inden for et eksperiment, mens du bruger et minimalt antal celler. I dette arbejde beskriver protokollen en metode til at sammenligne mitokondriesubstrat flux af to forskellige cellulære fænotyper eller genotyper og kan tilpasses til at teste forskellige mitokondrie substrater eller hæmmere.

Introduction

Mikropladebaseret respirometri har revolutioneret mitokondrieforskning ved at muliggøre studiet af cellulært åndedræt af en lille prøvestørrelse¹. Cellulær respiration betragtes generelt som en indikator for mitokondriefunktion eller ‘dysfunktion’, på trods af at mitokondriespektret af funktioner strækker sig ud over energiproduktion². Under aerobe forhold udvinder mitokondrier den energi, der lagres i forskellige substrater, ved at nedbryde og omdanne disse substrater til metaboliske mellemprodukter, der kan give næring til^{citronsyrecyklussen 3} (Figur 1). Den kontinuerlige flux af substrater er afgørende for strømmen af citronsyre cyklus til at generere høj energi ‘elektron donorer’, som leverer elektroner til elektron transport kæde, der genererer en proton gradient på tværs af den indre mitokondriemembran, gør det muligt ATP-synthase at fosforylatere ADP til ATP⁴. Derfor skal et eksperimentelt design til analyse af mitokondrie respiration omfatte prøven naturen (intakte celler, permeabilized celler, eller isolerede mitokondrier) og mitokondrie substrater.

Celler holder et lager af indfødte substrater⁵, og mitokondrier oxiderer flere typer substrater samtidigt⁶, hvilket komplicerer fortolkningen af resultater fra eksperimenter udført på intakte celler. En fælles tilgang til at undersøge mitokondrie evne til at oxidere et udvalgt substrat er at isolere mitokondrier eller permeabilize de undersøgte celler⁵. Selvom isolerede mitokondrier er ideelle til kvantitative undersøgelser, er isolationsprocessen besværlig. Det står over for tekniske vanskeligheder såsom behovet for stor prøvestørrelse, renhed af udbyttet og reproducerbarhed af teknikken⁵. Permeabiliserede celler tilbyder en løsning til ulemperne ved mitokondrieisolering; rutinemæssige permeabiliseringsmidler af vaskemiddelkarakter er dog ikke specifikke og kan beskadige mitokondriemembraner⁵.

Rekombinant perfringolysin O (rPFO) blev tilbudt som et selektivt plasmamembranpermeabiliserende middel⁷, og det blev anvendt med succes i kombination med en ekstracellulær fluxanalysator i flere undersøgelser^7,8,9,10. Vi har ændret en protokol ved hjælp af rPFO til at screene mitokondrie substrat flux ved hjælp af XFe96 ekstracellulære flux analysator. I denne protokol sammenlignes fire forskellige substratoxiderende veje i to cellulære fænotyper, mens der er tilstrækkelige replikater og den korrekte kontrol for hvert testet materiale.

Protocol

1. En dag før analysen Fremstilling af reagenser og substrater. Mitokondrieanalyseopløsning (MAS): Udarbejde lageropløsninger af alle reagenser som beskrevet i tabel 1. Varm lagrene af mannitol og saccharose til 37 °C for at opløses fuldstændigt. Bland reagenserne til fremstilling af 2x MAS, og varm derefter blandingen til 37 °C. Juster pH med 5N KOH til 7,4 (~7 mL), tilsæt derefter vand for at bringe volumen op til 1 L. Filtersterilisation og opbevar aliquots ved -20 °C indti…

Representative Results

Start med at normalisere resultaterne til den anden måling af baseline respiration for at vise værdier som iltforbrugsprocent (OCR%). Resultaterne af analysen er vist i figur 5, figur 6, figur 7 og figur 8. Det er vigtigt at tildele de rigtige baggrunds brønde for hver gruppe og inaktivere baggrunds brønde i andre grupper. Figur 5 vise…

Discussion

Denne protokol er en ændring af tidligere offentliggjorte undersøgelser^7,8,9,10 og produktbrugervejledningen. I modsætning til producentens protokol anvendes 2x MAS i stedet for 3x MAS, da 2× MAS er lettere at opløse og ikke danner nedbør efter frysning. Frosne 2x MAS aliquots kan opbevares op til seks måneder og vise ensartede resultater. En anden forskel er at inkludere ADP i komponent…

Materials

Adinosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate	Merck	A5285	store at -20 °C
Antimycin A	Merck	A8674	store at -20 °C
Bovine serum albumin	Merck	A3803	store at 2 – 8 °C
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Merck	C2920	store at -20 °C
Dimethyl sulfoxide	Merck	D8418	store at RT
D-Mannitol	Merck	63559	store at RT
Dulbecco's phosphate buffered saline	Gibco	14190-144	store at RT
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid	Merck	03777	store at RT
HEPES	Merck	H7523	store at RT
L(-)Malic acid disodium salt	Merck	M9138	store at RT
L-Glutamic acid sodium salt hydrate	Merck	G5889	store at RT
Magnissium chloride hexahydrate	Merck	M2670	store at RT
Oligomycin	Merck	O4876	store at -20 °C
Palmitoyl-DL-carnitine chloride	Merck	P4509	store at -20 °C
Potassium hydroxide	Merck	484016	store at RT
Potassium phosphate monobasic	Merck	P5655	store at RT
Rotenone	Merck	R8875	store at -20 °C
Seahorse Wave Desktop Software	Agilent technologies		Download from www.agilent.com
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent technologies
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent technologies	102416-100	XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates
Sodium pyruvate	Merck	P2256	store at 2 – 8 °C
Sodium succinate dibasic hexahydrate	Merck	S2378	store at RT
Sucrose	Merck	S7903	store at RT
Water	Merck	W3500	store at RT
XF calibrant	Agilent technologies	100840-000	store at RT
XF Plasma membrane permeabilizer	Agilent technologies	102504-100	Recombinant perfringolysin O (rPFO) – Aliquot and store at -20 °C