Denne protokol har til formål at beskrive, hvordan man studerer omfanget af Staphylococcus aureus internalisering og dens evne til at overleve inde i den menneskelige værtscelle, samt den intracellulære effekt af antimikrobielle forbindelser.
Staphylococcus aureus udtrykker virulensfaktorer for at udløse dens internalisering i eukaryoteceller og for at overleve inde i forskellige subcellulære rum. Dette papir beskriver en enzymbeskyttelsesanalyse for at studere omfanget af S. aureus internalisering og dens intracellulære overlevelse i klæbende ikke-professionelle fagocytiske celler (NPPCs) samt den intracellulære effekt af antimikrobielle forbindelser. NPPCs dyrkes i en multi-brønd plade, indtil de når 100% sammenløb. S. aureus kulturer dyrkes natten over i cellekultur medium. Bakterieopsengedningen fortyndes i henhold til antallet af celler pr. brønd for at vaccinere cellerne ved en kontrolleret mangfoldighed af infektion. Podede celler inkuberes i 2 timer for at gøre det muligt at internalisere bakterierne af NPPC’erne, hvorefter lysostaphin tilsættes kulturmediet for selektivt at dræbe ekstracellulære bakterier. Lysostaphin er til stede i kulturmediet for resten af eksperimentet.
På dette tidspunkt kunne de inficerede celler inkuberes med antimikrobielle forbindelser for at vurdere deres intracellulære aktiviteter mod S. aureus. Dernæst vaskes cellerne tre gange for at fjerne stofferne, og intracellulær S. aureusbelastning kvantificeres derefter ved dyrkning på agarplader. Alternativt, for at studere stafylokok virulens faktorer, der er involveret i intracellulær overlevelse og celletoksicitet, lysostaphin kunne inaktiveres med proteinase K for at fjerne behovet for vasketrin. Dette tip forbedrer pålideligheden af den intracellulære bakteriebelastning kvantificering, især hvis celler har tendens til at løsne sig fra kulturpladen, når de bliver stærkt inficeret på grund af multiplikationen af intracellulær S. aureus. Disse protokoller kan bruges med stort set alle typer af klæbende NPPCs og med 3D-cellekultur modeller såsom organoider.
Staphylococcus aureus er både et livstruende patogen og en commensal bakterie i huden og slimhinden, der koloniserer to milliarder individer rundt om i verden1. Hos mennesker har næsebærere af S. aureus en øget risiko for infektion med deres egen transportstamme; De multifaktoriske determinanter for S. aureus slimhindevogn er dog stadig uklare1,2. Ud over akutte infektioner, patienter kan også udvikle kroniske S. aureus infektioner, der ofte udfordrende at helbrede3. En bedre forståelse af værtspatogeninteraktioner under kolonisering og infektion er afgørende for at udvikle nye terapeutiske strategier og forbedre patientstyringen.
In vitro, S. aureus kan udløse sin internalisering i værtsceller, der udtrykker α5β1 integrin4. Trepartsinteraktionen mellem de stafylokok-fibrøstoktinbindende proteiner, der er forankret i cellevæggen af S. aureus, fibronectinen og β1-integrin udtrykt ved værtscelleoverfladen, er velkendt som hovedvejen for S. aureus internalisering i NPPCs såsom keratinocytter, osteoblaster, fibroblaster og epitelale og endotelceller4. Nylige undersøgelser viser, at S. aureus kan findes inde i menneskelige celler under nasal kolonisering5,6 og infektion7. Det intracellulære reservoirs rolle i patogenesen af S. aureus-infektion er dog fortsat uklar. Værtscellerne kunne fungere som et husly for S. aureus, som er beskyttet mod både immunsystemet8 og de fleste antimikrobielle forbindelser6,9.
Lysostaphin beskyttelse assay, beskrevet af Proctor10 tidligere i 1980’erne, gør det muligt at studere bakterielle og værtsfaktorer involveret i internalisering af S. aureus isolater. Lysostaphin er en bakteriedræbende produceret af Staphylococcus simulans, som udviser potent aktivitet mod næsten alle S. aureus isolater, herunder antibiotikaresistente stammer11. Lysostaphin er blevet brugt til kun at ødelægge ekstracellulære S. aureus at gøre det muligt at tælle kun levedygtige intracellulære bakterier12. Denne teknik har været meget udbredt og har bidraget til opdagelsen af flere virulens faktorer af S. aureus. Gentamycin, alene og kombineret med lysostaphin, er også meget udbredt til at studere intracellulære bakterier.
Men, en nylig undersøgelse viste, at gentamycin kommer ind eukaryote celler og når internaliserede bakterier i en tid- og koncentration-afhængige måde13. Denne undersøgelse viste også, at lysostaphin ikke kommer ind i eukaryote celler, bekræfter, at en lysostaphin-baseret enzymbeskyttelse assay (EPA) er den mest præcise analyse til kvantificering intracellulære S. aureus belastning af kultur13. Uanset hvilken forbindelse der anvendes til at ødelægge ekstracellulære bakterier (f.eks. lysostaphin eller gentamycin), skal det fjernes ved at vaske cellerne, før de plating intracellulære S. aureus på agarplader. Successive vasker kan resultere i løsrivelse af celler, især dårligt klæbende celler (f.eks stærkt inficerede celler), hvilket ville føre til en undervurdering af den intracellulære S. aureus belastning. Dette papir beskriver i detaljer, hvordan EPA kan bruges til at kvantificere den intracellulære S. aureus belastning og til at måle den intracellulære effekt af antimikrobielle stoffer ved hjælp af en in vitro-model . Bemærk, at der er foreslået en simpel metode til at forbedre pålideligheden af intracellulære belastningskvantificeringer ved at undgå intensive vaske.
De analyser, der er beskrevet her, er værdifulde for at studere omfanget af internalisering og den intracellulære overlevelse af S. aureus i NPPCs, samt den intracellulære effekt af antimikrobielle forbindelser6,15,16. Nogle trin i begge assay protokoller kan være kritisk. Cellernes sundhedstilstand og massefylde skal være perfekt kontrolleret og konsistent mellem uafhængige eksperimenter. Bakterieinoculum skal omhyggeligt standardiseres for at opnå en reel MOI tæt på den målrettede teoretiske MOI. Generelt skal man passe på ikke at løsne nogen af cellerne under pipettering. Vaskene for at fjerne lysostaphin og antibiotika er kritiske skridt i EPA. Brugen af proteinase K har vist sig at forbedre dette trin, når der ikke anvendes antibiotika (se nedenfor). Sidst men ikke mindst skal cellerne være helt løsrevet i hver brønd og grundigt homogeniseret efter inkubationen med lysisbufferen for pålideligt at kvantificere S. aureus intracellulær belastning.
I nogle tilfælde kan der opstå problemer, og flere punkter skal kontrolleres først. I tilfælde af manglende reproducerbarhed skal det huskes, at S. aureus kan danne klumper, hvilket gør kvantificering ved absorbans unøjagtig. Klumpning af bakterier kan øges ved centrifugering og vasketrin, hvis kulturmediet skal udskiftes (f.eks. for at eliminere et udskillet protein). Bakterieophænget bør anvendes hurtigt, fordi bakterierne fortsætter med at vokse ved stuetemperatur. Lysostaphin-effekten kan falde på grund af ukorrekte opbevaringsforhold, suboptimal pH for enzymaktivitet i kulturmedierne, variabilitet i den enzymatiske aktivitet mellem partier og udbydere og manglende lysostaphinfølsomhed af nogle stammer under specifikke vækstbetingelser. Phenol rød kunne have en lille bakteriostatisk effekt, især når kulturmediet er relativt dårlig i næringsstoffer i forhold til de typiske bouillon, der anvendes til dyrkning af bakterier. Således er det tilrådeligt at bruge et cellekulturmedium uden phenolrødt, hvilket også forbedrer fluorescens mikroskopiske observationer ved at reducere baggrundsstøjen.
Selvom denne metode er et værdifuldt værktøj til at studere den intracellulære skæbne af forskellige stammer, bør nogle grænser for metoden overvejes. Brugen af en meget høj MOI kan overbelaste kapaciteten af NPPCs og udjævne forskellene mellem de forskellige testede stammer. Omfanget af internalisering af de mest cytotoksiske stammer kan undervurderes, fordi lysostaphin (eller antibiotika) hurtigt ødelægger S. aureus , der frigives af beskadigede celler. Forsøg med længere varigheder (dvs. at studere intracellulær overlevelse eller intracellulær aktivitet af antibiotika) er således lettere at etablere med stammer med lav cytotoksicitet. Derfor bør inkubationstiden og MOI justeres nøjagtigt i henhold til stammevirulensen, celletypen og forsøgsmålet.
Den metode, der er beskrevet her med brug af lysostaphin er mere pålidelig end dem, der er baseret på gentamicin, fordi gentamicin i modsætning til lysostaphin har tendens til at blive internaliseret af værtsceller13. Den anden fordel er muligheden for at inaktivere lysostaphin. Hæmning af lysostaphin aktivitet blev rapporteret af Kim et al.13 ved brug af EDTA til chelate zinkioner eller 1,10-phenanthroline; Der kræves dog stadig intensive vasker for at fjerne enzymet før plating af bakterierne. Her muliggør proteinase K hurtig inaktivering af lysostaphin. Vi observerede, at celler har tendens til at løsne sig fra kulturpladen, når de bliver stærkt inficeret på grund af multiplikationen af intracellulær S. aureus. Ved at springe det sidste vasketrin over forenklede iEPA-metoden i høj grad teknisk håndtering og muliggjorde genopretningen af de internaliserede bakterier i løst klæbende eller allerede løsrevne celler.
De mere koncentrerede reagenser og buffere, der anvendes i iEPA, hjalp også med at reducere rørarbejdet og minimere tabet af celler. Derudover kan iEPA bruges med celler i suspension, såvel som med organoider, der er vanskelige at vaske. Afslutningsvis muliggør enzymbeskyttelsesanalyser undersøgelsen af omfanget af internalisering og S. aureus‘ intracellulære skæbne samt den intracellulære aktivitet af antimikrobielle lægemidler med forskellige in vitro-modeller . Der bør foretages forbedringer for bedre at karakterisere forholdet mellem internalisering og cytotoksicitet for bedre at forstå vigtigheden af at udvikle lægemidler, der er i stand til at nå S. aureus inde i cellen.
The authors have nothing to disclose.
S. aureus stammer SF8300 WT og SF8300 ΔfnbA / B blev generøst begavet af Prof. Binh Diep (University of California, San Francisco, USA). Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra FINOVI-foreningen (#AO13 FINOVI) under ledelse af Instituttet for Universitetet i Lyon.
24-well plate | CORNING-FALCON | 353047 | |
A549 cell line | ATCC | CCL-185 | |
Acetate buffer solution pH 4.6 | Fluka | 31048 | Used to prepare lysostpahine stock solution at 10 mg/mL in 20 mM sodium acetate. |
AMBICIN (Recombinant lysostaphin) | AMBI | LSPN-50 | Lyophilized recominant lysostaphin. Freeze at -80 °C for long-term storage. |
COS – Colombia agar + 5% sheep blood | Biomerieux | 43049 | Any agar plate suitable for growing staphylococci can be used instead. |
Densitometer WPA CO8000 | Biochrom Ltd. | 80-3000-45 | Cell density meter |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose with phenol red | Sigma-Aldrich | D6429 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose without phenol red | Sigma-Aldrich | D1145 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline with MgCl2 and CaCl2, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | D8662 | |
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Easyspiral dilute | Interscience | 414000 | Automatic diluter and spiral plater |
Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
HaCaT cell line | Cell lines service (CLS) | 300493 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water | Fisher scientific | 11534886 | |
Propidium iodide, 1.0 mg/mL solution in water | Invitrogen | P3566 | |
Proteinase K, recombinant 20 mg/mL | Eurobio | GEXPRK01-B5 | > 30 U/mg, lot 901727 |
Scan 4000 | Interscience | 438000 | Automatic colony counter |
Sterile water | OTEC | 600500 | |
T-75 culture flask | CORNING-FALCON | 353136 | |
TC20 Automated cell counter | Biorad | 1450102 | Automatic cell counter |
Tris 1 M pH 8.0 | Invitrogen | AM9855G | Used to prepare lysostaphine working solution at 1 mg/mL in 0.1 M Tris-HCl. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Trypsin – EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | 0.05% porcine trypsin and 0.02% EDTA in Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red |
Wide-field fluorescence microscope | Nikon | Ti2 |