Denne protokollen tar sikte på å beskrive hvordan man studerer omfanget av Staphylococcus aureus internalisering og dens evne til å overleve inne i den menneskelige vertscellen, samt den intracellulære effekten av antimikrobielle forbindelser.
Staphylococcus aureus uttrykker virulensfaktorer for å utløse internaliseringen i eukaryote celler og for å overleve inne i forskjellige subcellulære rom. Dette dokumentet beskriver en enzymbeskyttelsesanalyse for å studere omfanget av S. aureus internalisering og dens intracellulære overlevelse i tilhenger av ikke-profesjonelle fagocytiske celler (NPPCer) samt den intracellulære effekten av antimikrobielle forbindelser. NPPCer dyrkes i en multi-brønn plate til de når 100% samløp. S. aureuskulturer dyrkes over natten i cellekulturmediet. Bakteriell suspensjon fortynnes i henhold til antall celler per brønn for å inokulere cellene ved en kontrollert multiplisitet av infeksjon. Inokulerte celler inkuberes i 2 timer slik at bakteriene kan internaliseres av NPPCene, hvoretter lysostaphin legges til kulturmediet for selektivt å drepe ekstracellulære bakterier. Lysostaphin er til stede i kulturmediet for resten av eksperimentet.
På dette tidspunktet kan de infiserte cellene inkuberes med antimikrobielle forbindelser for å vurdere deres intracellulære aktiviteter mot S. aureus. Deretter vaskes cellene tre ganger for å fjerne stoffene, og intracellulær S. aureusbelastning kvantifiseres deretter ved å dyrke på agarplater. Alternativt, for å studere stafylokokkers virulensfaktorer involvert i intracellulær overlevelse og celletoksisitet, kan lysostaphin inaktiveres med proteinase K for å eliminere behovet for vasketrinn. Dette tipset forbedrer påliteligheten til den intracellulære bakterielle belastnings kvantifiseringen, spesielt hvis celler har en tendens til å løsne fra kulturplaten når de blir sterkt smittet på grunn av multiplikasjonen av intracellulær S. aureus. Disse protokollene kan brukes med nesten alle typer tilhenger NPPCer og med 3D-cellekulturmodeller som organoider.
Staphylococcus aureus er både et livstruende patogen og en commensal bakterie i huden og slimhinnen som koloniserer to milliarder individer rundt om i verden1. Hos mennesker har nesebærere av S. aureus økt risiko for infeksjon med sin egen transportstamme; Imidlertid er de multifaktorielle determinantene til S. aureus mucosal vogn fortsatt uklare1,2. I tillegg til akutte infeksjoner kan pasienter også utvikle kroniske S. aureusinfeksjoner som ofte er utfordrende å kurere3. En bedre forståelse av vertspatogeninteraksjoner under kolonisering og infeksjon er avgjørende for å utvikle nye terapeutiske strategier og forbedre pasientbehandlingen.
In vitro, S. aureus kan utløse internaliseringen i vertsceller som uttrykker α5β1 integrin4. Trepartsinteraksjonen mellom stafylokokkerfibronectinbindende proteiner forankret til celleveggen til S. aureus, fibronektin og β1-integrin uttrykt på vertscelleoverflaten er kjent som hovedveien til S. aureus internalisering i NPPCer som keratinocytter, osteoblaster, fibroblaster og epitel- og endotelceller. Nyere studier viser at S. aureus finnes inne i menneskelige celler under nesekolonisering5,6 og infeksjon7. Imidlertid er rollen til det intracellulære reservoaret i patogenesen av S. aureusinfeksjon fortsatt uklar. Vertscellene kan fungere som et ly for S. aureus, som er beskyttet mot både immunsystemet8 og de fleste antimikrobielle forbindelser6,9.
Lysostaphin beskyttelsesanalysen, beskrevet av Proctor10 tidligere på 1980-tallet, muliggjør studiet av bakterielle og vertsfaktorer involvert i internalisering av S. aureusisolasjoner . Lysostaphin er en bakteriocin produsert av Staphylococcus simulans, som utviser kraftig aktivitet mot nesten alle S. aureusisolasjoner , inkludert antibiotikaresistente stammer11. Lysostaphin har blitt brukt til å ødelegge bare ekstracellulær S. aureus for å muliggjøre telling av bare levedyktige intracellulære bakterier12. Denne teknikken har blitt mye brukt og har bidratt til oppdagelsen av flere virulensfaktorer av S. aureus. Gentamycin, alene og kombinert med lysostaphin, er også mye brukt til å studere intracellulære bakterier.
En nylig studie viste imidlertid at gentamycin kommer inn i eukaryote celler og når internaliserte bakterier på en tids- og konsentrasjonsavhengig måte13. Denne studien viste også at lysostaphin ikke kommer inn i eukaryote celler, og bekrefter at en lysostaphinbasert enzymbeskyttelsesanalyse (EPA) er den mest nøyaktige analysen for å kvantifisere intracellulær S. aureusbelastning etter kultur13. Uansett hvilken forbindelse som brukes til å ødelegge ekstracellulære bakterier (f.eks. lysostaphin eller gentamycin), bør den fjernes ved å vaske cellene før du plating intracellulær S. aureus på agarplater. Etterfølgende vasker kan føre til løsrivelse av celler, spesielt dårlig tilhengerceller (f.eks. tungt infiserte celler), noe som vil føre til en underestimering av den intracellulære S. aureusbelastningen . Dette dokumentet beskriver i detalj hvordan EPA kan brukes til å kvantifisere den intracellulære S. aureusbelastningen og for å måle den intracellulære effekten av antimikrobielle forbindelser ved hjelp av en in vitro-modell . Vær oppmerksom på at det er foreslått en enkel metode for å forbedre påliteligheten av intracellulær belastnings kvantifisering ved å unngå intensive vasker.
Analysene beskrevet her er verdifulle for å studere omfanget av internalisering og intracellulær overlevelse av S. aureus i NPPCs, samt den intracellulære effekten av antimikrobielle forbindelser6,15,16. Noen trinn i begge analyseprotokollene kan være kritiske. Helsetilstanden og tettheten av cellene må være perfekt kontrollert og konsistent mellom uavhengige eksperimenter. Bakteriell inokulum må nøye standardiseres for å oppnå en ekte MOI nær den målrettede teoretiske MOI. Generelt må det tas hensyn til ikke å løsne noen av cellene under pipettering. Vaskene for å fjerne lysostaphin og antibiotika er kritiske trinn i EPA. Bruken av proteinase K har vist seg å forbedre dette trinnet når det ikke brukes antibiotika (se nedenfor). Sist, men ikke minst, bør cellene løsnes helt i hver brønn og grundig homogeniseres etter inkubasjonen med lysisbufferen for pålitelig kvantifisere S. aureus intracellulær belastning.
I noen tilfeller kan det oppstå problemer, og flere punkter må kontrolleres først. Ved mangel på reproduserbarhet må man huske på at S. aureus kan danne klumper, noe som gjør kvantifisering ved absorbans unøyaktig. Klumpingen av bakterier kan økes ved sentrifugering og vasketrinn hvis kulturmediet skal byttes ut (f.eks. for å eliminere et utskilt protein). Bakteriell suspensjon bør brukes raskt fordi bakterier fortsetter å vokse ved romtemperatur. Lysostaphin-effekten kan reduseres på grunn av feil lagringsforhold, suboptimal pH for enzymaktivitet i kulturmediene, variasjon i enzymatisk aktivitet mellom partier og leverandører, og mangel på lysostaphinfølsomhet av noen stammer under spesifikke vekstforhold. Fenolrød kan ha en liten bakteriostatisk effekt, spesielt når kulturmediet er relativt dårlig i næringsstoffer sammenlignet med de typiske buljonger som brukes til voksende bakterier. Dermed er det tilrådelig å bruke et cellekulturmedium uten fenolrød, noe som også forbedrer fluorescens mikroskopiske observasjoner ved å redusere bakgrunnsstøyen.
Selv om denne metoden er et verdifullt verktøy for å studere den intracellulære skjebnen til forskjellige stammer, bør noen grenser for metoden vurderes. Bruken av en svært høy MOI kan overbelaste evnen til internalisering av NPPCer og utjevne forskjellene mellom de forskjellige stammene som er testet. Omfanget av internalisering av de mest cytotoksiske stammene kan undervurderes fordi lysostaphin (eller antibiotika) raskt ødelegger S. aureus som frigjøres av skadede celler. Dermed er eksperimenter med lengre varigheter (dvs. for å studere intracellulær overlevelse eller intracellulær aktivitet av antibiotika) lettere å sette opp med stammer med lav cytotoksisitet. Derfor bør inkubasjonstiden og MOI justeres nøyaktig i henhold til belastningsvirulensen, celletypen og det eksperimentelle målet.
Metoden beskrevet her med bruk av lysostaphin er mer pålitelig enn de som er basert på gentamicin fordi, i motsetning til lysostaphin, har gentamicin en tendens til å bli internalisert av vertsceller13. Den andre fordelen er muligheten til å inaktivere lysostaphin. Hemming av lysostaphinaktivitet ble rapportert av Kim et al.13 ved bruk av EDTA for å chelate sinkioner eller 1,10-fenanthroline; Imidlertid er det fortsatt nødvendig med intensive vasker for å fjerne enzymet før plating av bakteriene. Her muliggjør proteinase K rask inaktivering av lysostaphin. Vi observerte at celler har en tendens til å løsne fra kulturplaten når de blir sterkt smittet på grunn av multiplikasjonen av intracellulær S. aureus. Ved å hoppe over det endelige vasketrinnet forenklet iEPA-metoden i stor grad teknisk håndtering og gjorde det mulig å gjenopprette de internaliserte bakteriene i løst festede eller allerede frittliggende celler.
De mer konsentrerte reagensene og bufferne som brukes i iEPA bidro også til å redusere pipetteringsinnsatsen og minimere tap av celler. I tillegg kan iEPA brukes med celler i suspensjon, så vel som med organoider som er vanskelige å vaske. Til slutt muliggjør enzymbeskyttelsesanalyser studiet av omfanget av internalisering og S . aureus intracellulære skjebne, samt intracellulær aktivitet av antimikrobielle legemidler med forskjellige in vitro-modeller . Forbedringer bør gjøres for bedre å karakterisere forholdet mellom internalisering og cytotoksisitet for bedre å sette pris på viktigheten av å utvikle legemidler som er i stand til å nå S. aureus inne i cellen.
The authors have nothing to disclose.
S. aureus stammer SF8300 WT og SF8300 ΔfnbA / B ble sjenerøst begavet av Prof. Binh Diep (University of California, San Francisco, USA). Dette arbeidet ble støttet av et tilskudd fra FINOVI-foreningen (#AO13 FINOVI) under stiftelsens aegis for University of Lyon.
24-well plate | CORNING-FALCON | 353047 | |
A549 cell line | ATCC | CCL-185 | |
Acetate buffer solution pH 4.6 | Fluka | 31048 | Used to prepare lysostpahine stock solution at 10 mg/mL in 20 mM sodium acetate. |
AMBICIN (Recombinant lysostaphin) | AMBI | LSPN-50 | Lyophilized recominant lysostaphin. Freeze at -80 °C for long-term storage. |
COS – Colombia agar + 5% sheep blood | Biomerieux | 43049 | Any agar plate suitable for growing staphylococci can be used instead. |
Densitometer WPA CO8000 | Biochrom Ltd. | 80-3000-45 | Cell density meter |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose with phenol red | Sigma-Aldrich | D6429 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose without phenol red | Sigma-Aldrich | D1145 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline with MgCl2 and CaCl2, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | D8662 | |
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Easyspiral dilute | Interscience | 414000 | Automatic diluter and spiral plater |
Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
HaCaT cell line | Cell lines service (CLS) | 300493 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water | Fisher scientific | 11534886 | |
Propidium iodide, 1.0 mg/mL solution in water | Invitrogen | P3566 | |
Proteinase K, recombinant 20 mg/mL | Eurobio | GEXPRK01-B5 | > 30 U/mg, lot 901727 |
Scan 4000 | Interscience | 438000 | Automatic colony counter |
Sterile water | OTEC | 600500 | |
T-75 culture flask | CORNING-FALCON | 353136 | |
TC20 Automated cell counter | Biorad | 1450102 | Automatic cell counter |
Tris 1 M pH 8.0 | Invitrogen | AM9855G | Used to prepare lysostaphine working solution at 1 mg/mL in 0.1 M Tris-HCl. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Trypsin – EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | 0.05% porcine trypsin and 0.02% EDTA in Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red |
Wide-field fluorescence microscope | Nikon | Ti2 |