Meting van vetzuur β-oxidatie in een suspensie van vers geïsoleerde muizenhepatocyten
Summary
Vetzuur β-oxidatie is een essentiële metabole route die verantwoordelijk is voor het genereren van energie in veel verschillende celtypen, waaronder hepatocyten. Hier beschrijven we een methode om vetzuur β-oxidatie te meten in vers geïsoleerde primaire hepatocyten met behulp van 14C-gelabeld palmitinezuur.
Abstract
Vetzuur β-oxidatie is een belangrijke metabole route om aan de energiebehoeften van de lever te voldoen en substraten en cofactoren te bieden voor aanvullende processen, zoals ketogenese en gluconeogenese, die essentieel zijn om de glucosehomeostase van het hele lichaam te behouden en de extra-leverorgaanfunctie in de nuchtere toestand te ondersteunen. Vetzuur β-oxidatie treedt op in de mitochondriën en peroxisomen en wordt gereguleerd door meerdere mechanismen, waaronder de opname en activering van vetzuren, enzymexpressieniveaus en beschikbaarheid van cofactoren zoals co-enzym A en NAD +. In assays die vetzuur β-oxidatie in leverhomogenaten meten, maskeren cellyse en de gemeenschappelijke toevoeging van suprafysiologische niveaus van cofactoren de effecten van deze regulerende mechanismen. Bovendien is de integriteit van de organellen in de homogenaten moeilijk te controleren en kan deze aanzienlijk variëren tussen preparaten. De meting van vetzuur β-oxidatie in intacte primaire hepatocyten overwint de bovenstaande valkuilen. Dit protocol beschrijft een methode voor het meten van vetzuur β-oxidatie in een suspensie van vers geïsoleerde primaire muizenhepatocyten geïncubeerd met 14C-gelabeld palmitinezuur. Door uren tot dagen cultuur te vermijden, heeft deze methode het voordeel dat de eiwitexpressieniveaus en metabole routeactiviteit van de oorspronkelijke lever beter behouden blijven, inclusief de activering van vetzuur β-oxidatie waargenomen in hepatocyten geïsoleerd uit nuchtere muizen in vergelijking met gevoede muizen.
Introduction
Vetzuur β-oxidatie is een essentieel proces in het lipidenmetabolisme en biedt een katabole route om de vetzuursynthese en inname uit het dieet in evenwicht te brengen. Dit proces genereert energie voor meerdere organen, waaronder de hartspier, de nierschors en de nuchtere lever, en maakt gebruik van vetzuren verkregen uit het dieet, vetweefsellipolie en interne triglyceridenvoorraden 1,2.
Oxidatie van vetzuur door de β-oxidatieroute resulteert in de sequentiële verkorting van de vetacylketen door twee koolstofatomen tegelijk, vrijgegeven als acetyl-CoA, en dit proces vindt zowel in de mitochondriën als in de peroxisomen plaats. Hoewel de meeste vetzuren slechts β-oxidatie ondergaan, worden sommige geoxideerd bij verschillende koolstofatomen voordat ze deze route betreden. Bijvoorbeeld, 3-methyl-gesubstitueerde vetzuren, zoals fytaanzuur, ondergaan verwijdering van één koolstof door α-oxidatie in de peroxisomen voordat ze de β-oxidatieroute betreden. Evenzo worden sommige vetzuren eerst omgezet in dicarbonzuren door oxidatie van de terminale methylgroep (ω-oxidatie) in het endoplasmatisch reticulum voordat ze bij voorkeur worden geoxideerd in de peroxisomen door β-oxidatie3.
Ongeacht het specifieke organel, moet een vetzuur eerst worden omgezet in een co-enzym A (CoA) thioester, of acyl-CoA, om te worden geoxideerd via de β-oxidatieroute. β-oxidatie van lange-keten acyl-CoA’s in de mitochondriale matrix vereist de carnitine shuttle voor hun translocatie, waar carnitine palmitoyltransferase 1 (CPT1) de omzetting van acyl-CoA’s naar acylcarnitines katalyseert en het snelheidsbeperkende enzym in dit proces is4. Eenmaal getransloceerd naar de mitochondriale matrix, worden de acyl-CoA’s opnieuw gevormd en dienen ze als substraten voor de mitochondriale β-oxidatiemachines. In nuchtere toestand wordt het acetyl-CoA geproduceerd door β-oxidatie in hepatische mitochondriën voornamelijk gekanaliseerd naar ketogenese. Peroxisomen dienen als de primaire plaats voor de β-oxidatie van zeer lange keten, vertakte keten en dicarbonzuren. Peroxisomen vereisen niet dat de carnitineshuttle vetzuursubstraten importeert, maar importeert in plaats daarvan de correspondent acyl-CoA’s via de activiteit van de ATP-binding cassette (ABC) transporters ABCD1-35. Binnen de peroxisomen worden acyl-CoA’s vervolgens geoxideerd door een speciale set enzymen, verschillend van de mitochondriale vetzuur- β-oxidatiemachines. Zowel mitochondriën als peroxisomen vereisen ook een voorraad NAD + en vrij CoA om vette acylketens te oxideren. Het is aangetoond dat de CoA-niveaus in de lever toenemen als reactie op vasten, ter ondersteuning van de verhoogde snelheid van vetzuuroxidatie die in deze toestand optreedt6. Bovendien resulteert een verhoogde CoA-afbraak in de peroxisomen in een selectieve afname van peroxisomale vetzuuroxidatie7. Daarom wordt het proces van vetzuuroxidatie in de cel gereguleerd door de expressieniveaus en activiteiten van enzymen die betrokken zijn bij de activering, transport en oxidatie van vetzuren, evenals de concentraties van cofactoren en andere metabolieten in meerdere subcellulaire compartimenten.
Procedures met behulp van weefselhomogenaten om vetzuuroxidatie te meten, vernietigen de cellulaire architectuur die dit proces reguleert en ondersteunt, wat leidt tot een verzameling gegevens die het in vivo metabolisme niet nauwkeurig weergeeft. Hoewel technieken met behulp van vergulde primaire hepatocyten dit systeem behouden, resulteert het kweken van geïsoleerde cellen gedurende langere tijd in een verlies van het in vivo genexpressieprofiel dat aanwezig was in de cellen toen ze nog in het dier leefden 8,9. Het volgende protocol beschrijft een methode om primaire hepatocyten te isoleren en hun capaciteit voor vetzuur β-oxidatie onmiddellijk na isolatie en in suspensie te testen, met behulp van [1-14C] palmitinezuur. De test is gebaseerd op de meting van de radioactiviteit geassocieerd met de zuuroplosbare metabolieten (ASM) of producten, zoals acetyl-CoA, geproduceerd door de β-oxidatie van [1-14C]palmitinezuur10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tijdens de leverperfusie is het van cruciaal belang om de introductie van luchtbellen te voorkomen, omdat ze de microcapillairen in de lever blokkeren, de buffercirculatie voorkomen of beperken en over het algemeen de opbrengst en levensvatbaarheid van de hepatocyten verminderen20,21. Voorzorgsmaatregelen, zoals het nauwkeurig inspecteren van de met buffer gevulde inlaatlijn vóór het cannuleren van de IVC en het vermijden van het opheffen van de inlaatlijn van …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health subsidie R35GM119528 aan Roberta Leonardi.
Materials
| (R)-(+)-Etomoxir sodium salt | Tocris Bioscience | 4539/10 | |
| [1-14C]-Palmitic acid, 50–60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL | American Radiolabeled Chemicals | ARC 0172A | |
| 1 M HEPES, sterile | Corning | 25060CI | |
| 10 µL disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette | Mettler Toledo | 17008604 | |
| 1000 µL, 200 µL, and 10 µL pipettes and tips | |||
| 5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes | |||
| 50 mL sterile centrifuge tubes | CellTreat | 229421 | |
| 70% Perchloric acid | Fisher Scientific | A2296-1LB | |
| BSA, fatty acid-free | Fisher Scientific | BP9704100 | |
| CaCl2 dihydrate | MilliporeSigma | 223506 | |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | |
| EGTA | Gold Biotechnology | E-217 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200CSPP | |
| Filter System, 0.22 μm PES Filter, 500 mL, Sterile | CellTreat | 229707 | |
| Gentamicin sulphate | Gold Biotechnology | G-400-25 | |
| HDPE, 6.5 mL scintillation vials | Fisher Scientific | 03-342-3 | |
| Hemocytometer | |||
| Hypodermic needles 22 G, 1.5 in | BD Biosciences | 305156 | |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| KH2PO4 | MilliporeSigma | P5655 | |
| Liberase TM Research Grade | MilliporeSigma | 5401119001 | Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin |
| M199 medium | MilliporeSigma | M5017 | |
| MgSO4 heptahydrate | MilliporeSigma | M1880 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5980 | |
| NaCl | Chem-Impex International | 30070 | |
| NaHCO3 | Acros Organics | 424270010 | |
| Palmitic acid | MilliporeSigma | P0500 | |
| Penicillin/streptomycin (100x) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cytiva Life Sciences | SH30256.01 | |
| Positive displacement pipette MR-10, 10 µL | Mettler Toledo | 17008575 | |
| Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes | Eppendorf | 5810 R | |
| Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes | Fisher Scientific | 14-956-9A | |
| Scintillation counter | Perkin Elmer | TriCarb 4810 TR | |
| ScintiVerse BD cocktail | Fisher Scientific | SX18-4 | |
| Shaking water bath, 30 L capacity | New Brunswick Scientific | Model G76 | |
| Sterile cell strainers, 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Thumb Dressing Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | RS-8120 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Variable-flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 138762 | |
| Water baths, 2–2.5 L capacity |
References
- Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E. Triglyceride Metabolism in the Liver. Comprehensive Physiology. 8 (1), 1-8 (2017).
- Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiological Reviews. 90 (1), 207-258 (2010).
- Mannaerts, G. P., van Veldhoven, P. P. Functions and organization of peroxisomal beta-oxidation. Annals of the New York Academy of Sciences. 804, 99-115 (1996).
- Kerner, J., Hoppel, C. Fatty acid import into mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1486 (1), 1-17 (2000).
- Baker, A., et al. Peroxisomal ABC transporters: functions and mechanism. Biochemical Society Transactions. 43 (5), 959-965 (2015).
- Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PloS One. 5 (6), 11107 (2010).
- Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60 (5), 1005-1019 (2019).
- Richert, L., et al. Gene expression in human hepatocytes in suspension after isolation is similar to the liver of origin, is not affected by hepatocyte cold storage and cryopreservation, but is strongly changed after hepatocyte plating. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 34 (5), 870-879 (2006).
- Colbert, R. A., Amatruda, J. M., Young, D. A. Changes in the expression of hepatocyte protein gene-products associated with adaptation of cells to primary culture. Clinical Chemistry. 30 (12), 2053-2058 (1984).
- Spurway, T. D., Sherratt, H. A., Pogson, C. I., Agius, L. The flux control coefficient of carnitine palmitoyltransferase I on palmitate beta-oxidation in rat hepatocyte cultures. Biochemical Journal. 323, 119-122 (1997).
- Consitt, L. A., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1alpha overexpression increases lipid oxidation in myocytes from extremely obese individuals. Diabetes. 59 (6), 1407-1415 (2010).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50615 (2013).
- Lilly, K., Chung, C., Kerner, J., VanRenterghem, R., Bieber, L. L. Effect of etomoxiryl-CoA on different carnitine acyltransferases. Biochemical Pharmacology. 43 (2), 353-361 (1992).
- Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J. Rates of mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation of palmitate change during postnatal development and food deprivation in liver, kidney and heart of pigs. Journal of Nutrition. 127 (9), 1814-1821 (1997).
- Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J., Lin, X. Response of hepatic mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation to increasing palmitate concentrations in piglets. Biology of the Neonate. 72 (5), 284-292 (1997).
- Veerkamp, J. H., van Moerkerk, H. T. Peroxisomal fatty acid oxidation in rat and human tissues. Effect of nutritional state, clofibrate treatment and postnatal development in the rat. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 875 (2), 301-310 (1986).
- Hakvoort, T. B., et al. Interorgan coordination of the murine adaptive response to fasting. Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 16332-16343 (2011).
- Sokolovic, M., et al. The transcriptomic signature of fasting murine liver. BMC Genomics. 9, 528 (2008).
- Kersten, S., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha mediates the adaptive response to fasting. Journal of Clinical Investigation. 103 (11), 1489-1498 (1999).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Ng, I. C., et al. Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62289 (2021).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).
- Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes. Biochemical Pharmacology. 62 (4), 439-446 (2001).
- Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57 (7), 1466-1475 (2014).
- Bougarne, N., et al. PPARalpha blocks glucocorticoid receptor alpha-mediated transactivation but cooperates with the activated glucocorticoid receptor alpha for transrepression on NF-kappaB. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7397-7402 (2009).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).
