Her præsenterer vi en protokol til opnåelse af mikrocomputertomografibilleder i høj opløsning af sunde og patologiske store pattedyrs hele hjerter med kollagenselektiv kontrastforbedring.
Strukturel ombygning er en almindelig konsekvens af kroniske patologiske belastninger pålagt hjertet. Forståelse af de arkitektoniske og kompositoriske egenskaber af sygt væv er afgørende for at bestemme deres interaktioner med arytmisk adfærd. Mikroskala vævsombygning, under den kliniske opløsning, fremstår som en vigtig kilde til dødelig arytmi, med høj forekomst hos unge voksne. Der er fortsat udfordringer med at opnå høj billedkontrast ved tilstrækkelig mikroskalaopløsning til prækliniske modeller, såsom store pattedyrs hele hjerter. Desuden mangler vævssammensætningsselektiv kontrastforbedring til tredimensionel billeddannelse i høj opløsning stadig. Ikke-destruktiv billeddannelse ved hjælp af mikrocomputertomografi viser løfte om billeddannelse i høj opløsning. Målet var at lindre lidelse fra røntgen over fordæmpning i store biologiske prøver. Hjerter blev ekstraheret fra raske grise (N = 2) og får (N = 2) med enten induceret kronisk myokardieinfarkt og fibrotisk ardannelse eller induceret kronisk atrieflimren. Udskårne hjerter blev perfunderet med: en saltopløsning suppleret med et calciumion-slukningsmiddel og en vasodilator, ethanol i seriel dehydrering og hexamethyldisilizan under vakuum. Sidstnævnte forstærkede hjertestrukturen under lufttørring i 1 uge. Kollagen-dominerende væv var selektivt bundet af et røntgenkontrastforstærkende middel, phosphomolybdinsyre. Vævskonformationen var stabil i luften, hvilket tillod langvarige mikrocomputertomografiopkøb for at opnå billeder i høj opløsning (isotrope 20,7 μm). Optimal kontrastmiddelbelastning ved diffusion viste selektiv kontrastforbedring af epitellaget og sub-endokardielle Purkinje-fibre i sunde svineventrikler. Atrieflimren (AF) hjerter viste forbedret kontrastakkumulering i de bageste vægge og vedhæng af atrierne, der tilskrives større kollagenindhold. Myokardieinfarkthjerter viste øget kontrast selektivt i områder af hjertefibrose, hvilket gjorde det muligt at identificere sammenvævede overlevende myokardiemuskelfibre. Kontrastforstærkede lufttørrede vævspræparater muliggjorde mikroskala billeddannelse af det intakte store pattedyrshjerte og selektiv kontrastforbedring af underliggende sygdomsbestanddele.
Strukturelle hjertesygdomme tegner sig for størstedelen af hjerterelateret dødelighed på verdensplan1. Ombygning af hjertestruktur påvirker myokardiemiljøet og det interstitielle rum. Da både hjerteelektisk og mekanisk funktion afhænger af myocytorganisationen, kan forstyrrelse føre til uacceptabel hjertearytmi, nedsat blodpumpende handlinger og hjertesvigt 2,3,4,5,6,7,8,9. Udviklingen af helbredende terapier til strukturelle hjertesygdomme opvejes langt af sygdomsprævalensen 2,5. Som sådan dukker et stigende antal prækliniske modeller af strukturelle hjertesygdomme op for bedre at forstå de anatommorfologiske profiler og den resulterende patogenese af hjertearytmier 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23. Observeret på tværs af struktursygdomsspektret er opreguleringen af interstitiel fibrose og, mere almindeligt i iskæmi-relaterede tilfælde, myokardieudskiftning med fibrose og fedtvæv18. Morfologisk forståelse af patologiske ekstracellulære komponenter kan muliggøre identifikation af potentielle substrater af arytmi. Fordelingen og omfanget af sygdommen giver stærke indikatorer for arytmogen risiko. Alligevel er der stadig udfordringer med at afbilde sygdomsprofiler ved at integrere makro- og mikroskalaer i det intakte hjerte.
Mikrocomputertomografi (microCT), baseret på røntgenstråler, fremstår som et kraftfuldt værktøj til at forhøre blødt biologisk vævsmikrostruktur ved hjælp af kontrastmidler. Der er opnået meget detaljerede anatomiske kort for hjerter fra små gnavere 24,25,26 og små dissekerede prøver fra store pattedyrshjerter 27,28. Billeddannelse på hele organniveauet af store pattedyrshjerter præsenterer imidlertid for store stilængder, over hvilke røntgenfotoner dæmpes ved hjælp af konventionelle vævsforberedelsesteknikker. Dette indebærer kontrastbelastning af vævet og nedsænkning af prøven i et kontrastmiddelopløsningsmiddel under erhvervelsen. Forøgelse af stikprøvestørrelsen og opløsningen pålægger en forlængelse af den samlede anskaffelsestid. Derfor bliver vævsstabilitet afgørende for brugbar billedrekonstruktion, hvilket betyder, at vævsdeformation som følge af tørring skal forhindres. Anvendelsen af en nedsænkningsvæske har imidlertid ulemper: (i) den samlede baggrundssignalintensitet bliver ikke ubetydelig og (ii) fremmer fortynding af vævsbundne kontrastmolekyler. Begge disse faktorer bidrager til at sænke billedkontrasten.
Denne undersøgelse beskriver en ny vævsbehandlingsrørledning for at lindre baggrundsfotondæmpning og optimere det dynamiske område, der ydes af kontrastforbedringsmidler. Det foreslås at anvende en vævslufttørringsmetode med kemisk vævsforstærkning for at begrænse vævsdeformation29. Derfor kan vævsprøver forblive stabile i luften ved lange erhvervelser og udelade baggrundsbidrag fra nedsænkningsvæsker. Denne metodepipeline giver: (i) en omfattende vævsbehandlings- og billeddannelsesprotokol optimeret ved hjælp af hele svinehjerter; ii) en evaluering af kontrastkoncentrations- og belastningsteknikker og iii) anvendelse af denne pipeline i to forskellige kroniske sygdomsmodeller for atrieflimren og myokardieinfarkt i fårehjerter. Udvikling af kroniske sygdomsmodeller er beskrevet andetsteds for hver kronisk hjertesygdomsmodel, myokardieinfarkt induceret af perkutan koronararterieembolisering13 og selvbærende atrieflimren30.
En detaljeret protokol for store vævspræparater er fastsat ved hjælp af hele hjerter fra store pattedyr til efterfølgende strukturel billeddannelse i høj opløsning. En lufttørringsmetode fjernede påvirkninger af baggrundsrøntgendæmpning og maksimalt optimerende væv: baggrundskontrast29. Ved hjælp af denne fremgangsmåde blev der opnået en isotrop opløsning i området 20 μm til volumetrisk billeddannelse på tværs af prøver op til 7,2 cm i diameter. MikroCT af blødt væv er imidlertid typisk afhængig af anvendelse af ikke-specifikke kontrastmidler til at forbedre røntgenabsorptionen og følsomheden af mikrokt-systemer34. Selvom røntgenkontrastmidler forbedrer den samlede røntgendæmpning og forbedring af blødt vævsbilleddannelse, er adskillelse af vævsbestanddele baseret på biokemisk sammensætning fortsat udfordrende. Det blev imidlertid observeret, at ved hjælp af lufttørrede hjerter i kombination med et almindeligt røntgenkontrastmiddel i laboratorieindstillingen, PMA, selektivt farvede ekstracellulære komponenter. Bindevæv forbundet med sundt myokardie og patologisk strukturel ombygning i kroniske sygdomme blev forbedret.
Processen med lufttørring af biologisk væv kræver en intervention for at modstå deformationen af prøven. Prøveforberedelse til elektronmikroskopi har lignende krav. Typisk anvendes en kritisk punkttørringsmetode, der bruger en balance mellem vævsnedsænkningsmedium, temperatur og tryk for at eliminere overfladespænding af vævets væskeindhold, hvilket forårsager deformation på molekylært niveau ved fordampning35. Denne fremgangsmåde kræver ensartet udskiftning af prøvens vandindhold med flydende kuldioxid, som er mere pålidelig i små og let diffusible prøver. Alternativt kan vævets strukturelle integritet forbedres, og lufttørring, dvs. fordampningsfasen, kan påføres over en længere periode for at reducere den samlede deformation. Molekylet HMDS gennemgår silylering for at danne et silikonebaseret stillads for at forstærke og stabilisere den molekylære organisation af vævsprøven36. Fordampningen forlænges yderligere ved at begrænse cirkulerende luftstrømme fra miljøet, også for at undgå inhomogen fordampning, især mellem prøveoverfladen og de intramurale lag.
Talrige kontrastmidler er tidligere blevet brugt til microCT-billeddannelse af blødt væv. De mest almindelige er jod, phosphotungstic acid (PTA) og PMA. Jod har især været anvendt på grund af en højere diffusionshastighed 34,37,38. Ikke desto mindre virker jod som katalysator for silylering af HMDS-reagens36. Den katalyserede reaktion er aggressiv og eksoterm med stor risiko for destruktion af prøven og sikkerhedsrisiko, hvis resterende HMDS forbliver på grund af ufuldstændig udtørring af prøven. Både PTA og PMA opløst i ethanol kan sikkert anvendes sammen med HMDS. PTA og PMA har vist sig at give større opløsningsevne af fine strukturer i ikke-mineraliserede intervertebrale skiver sammenlignet med jodfarvning38. I mikroCT-billeddannelse af pattedyrsprøver er PTA og PMA blevet anvendt til farvning af museembryoner39, muse-kardiovaskulært system37, kaninmuskel og hjerne40 og svineårer41. PTA har en højere molekylmasse og densitet i opløsning end PMA. Dette skyldes til dels en højere atommasse af wolfram (atomnummer er 74 g / mol), det vigtigste dæmpende element i PTA. Til sammenligning har det tungeste grundstof i PMA, molybdæn, et atomnummer på 42 g/mol. Både atommasse og prøvetæthed ligger til grund for røntgendæmpning ud over prøvetykkelsen42. Ved at øge røntgenstiens længde ved at øge prøvestørrelserne bliver røntgendæmpning mere følsom over for øget prøvetæthed. Derfor blev PMA-kontrastmidlet med lavere densitet valgt for at reducere risikoen for overdæmpning og for at optimere det dynamiske område af billedkontrast for hjerter af menneskelignende skala. Yderligere beviser har vist, at diffusionsbelastning af PMA giver mere homogen farvning end for det større molekyle PTA i hjertevæv43.
Metoden til levering af kontrastmiddel påvirker ensartetheden af kontrastmiddelfordelingen i hjertevæv (figur 3). Perfusion af kontrastmidler i det ethanol-dehydrerede hjerte viste ujævne baggrundsfarvningsniveauer af PMA på grund af variabel vaskulær resistens. I det lufttørrede hjerte understreges muskellaminær struktur af prøveudtørringsprocessen, hvilket øger muskellaminær adskillelse. Dette forbedrede i sidste ende vævets samlede permeabilitet til diffusionsbaseret kontrastmiddelbelastning. Følgelig lettede lufttørring væv: luftkontrast på det laminære og intralaminære niveau (figur 4). Desuden kan diffusionsbelastning lettes yderligere ved påføring under vakuum. Det er endvidere blevet påvist, at vævskrympning af ikke-tørrede prøver er afhængig af koncentration af kontrastmiddel40. Tidligere morfologisk stabilisering af prøven ved lufttørring hæmmer imidlertid vævskrympningseffekter29.
Mikrokt-billeder i høj opløsning af hele organer producerer i sagens natur store datamængder. Karakteren af tomografiske billeddannelsesteknikker muliggør visualisering og billedhåndtering på skive-for-skive-basis, hvilket letter computerens behandling og hukommelsesbyrde. For at visualisere tredimensionelle billedstakke, for eksempel for at gengive prøvevolumener i tredimensionelle repræsentationer, er de anbefalede minimumscomputerspecifikationer imidlertid 128 GB RAM og en processorhastighed på 3 GHz. Solid state-harddiske forbedrede også dataoverførslen betydeligt.
Fremkomsten af mikrokt-billeddannelse på hjerteområdet giver mange fordele for translationelle undersøgelser og klinisk validering. Fordelene ved dens tredimensionelle og mikrometriske billeddannelse har allerede vist anvendelser til bestemmelse af den trombotiske byrde hos ST-elevation myokardieiskæmipatienter44,45. Kortlægning af potentielle kilder til arytmi hos patienter med strukturelle hjertesygdomme er i høj grad afhængig af at bestemme fordelingen af fibrotisk arvæv og lokalisere sammenvævningsspor af overlevende myokardie. Andenlinjetilgange til diagnosticering af ventrikulære arytmier anvender magnetisk resonansbilleddannelse46. Det kan robust lokalisere tæt fibrose, men er begrænset til morfologisk karakterisering med lav opløsning og giver begrænset indsigt i mikrostrukturel ombygning og diffuse fordelinger af fibrotiske læsioner47. Højopløselig undersøgelse af arfordeling og karakterisering har et stort potentiale for at forbedre vores forståelse af hjertestrukturel ombygning og risikoen for at udvikle hjertesvigt. Især vil grundforskningsundersøgelser eller post mortem-undersøgelser drage fordel af bekræftende strukturelle billeder til elektrisk kortlægning af hjertearytmi.
Afslutningsvis kan hjerter forstærket med HMDS-behandling og lufttørring efterfølgende farves med et røntgenkontrastmiddel for at forbedre røntgendæmpningen af ekstracellulære komponenter. Specifikt forekommer PMA-akkumulering i sundt myokardie ved epitelet, valvulært væv og rum i det ventrikulære ledningssystem beklædt med bindevæv resulterede i forbedret røntgendæmpning. Desuden var forbedret kontrast i strukturelt sygt myokardie yderligere selektiv for fibrose.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse modtog finansiel støtte fra den franske regering som en del af programmet “Investments of the Future”, der forvaltes af National Research Agency (ANR), Grant reference ANR-10-IAHU-04 og Leducq Foundation (RHYTHM-netværket) samt Grant reference ANR-17-CE14-0029-01 [UNMASC], finansiering fra det europæiske forskningsrum i hjerte-kar-sygdomme (ERA-CVD), tilskudsreference H2020-HCO-2015_680969 [MultiFib] og finansiering fra den franske region Nouvelle Aquitaine, tilskudsreferencer 2016 – 1R 30113 0000 7550/2016-1R 30113 0000 7553 og ANR-19-ECVD-0006-01.
10% neutral buffered formalin | Diapath | F0043 | |
Calcium chloride solution | Honeywell | 21114 | |
Canulation Tubing PTFE | VWR | DENE3400102 | |
Constant Head 1L Reservoir | Harvard Apparatus | 50-0496 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 796881 | |
Heparin sodium (5000 U/mL) | Panpharma | 3400891287301. | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma | 440191-1L | |
Hydrochloric acid, ACS reagent, 37% | Sigma | 258148 | |
Magnesium chloride solution | Honeywell | 63020 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368 | |
Phosphomolybdic acid hydrate | Fisher Scientific | 417895000 | |
Potassium Chloride | Sigma | P5405 | |
Pump Tubing, 3-Stop | Ismatec | FV-96328-48 | |
SkyScan, 1276 | Bruker | micro CT | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
Sodium hydroxide solution 50% in H2O | Sigma | 415413 | |
Tube Connector Kits | Harvard Apparatus | 72-1407 | |
Tubing pump | Ismatec | ISM 1089 | |
Tubing Tygon R-3603 1.6 mm 3.2 mm 0.8 mm | VWR | 228-1279 | |
Tubing Tygon R-3603 3.2 mm 4.8 mm 0.8 mm | VWR | 228-1283 | |
Two-part single-use syringes 50 mL | Norm-Ject | 4850001000 | Pyrogen-free, PVC-free |