Drift av laboratoriefotobioreaktorer med online-tillväxtmätningar och anpassningsbara ljusregimer

Summary

Denna publikation beskriver utformningen av laboratoriefotobioreaktorer (PBR) med anpassningsbara ljusregimer. Tillväxten av cyanobakterier eller mikroalger, med bikarbonat som kolkälla, övervakas kontinuerligt genom mätning av volymetrisk syreproduktion. Dessa PBR underlättar snabba, replikerade laboratorietillväxtjämförelser med liten användarintervention under experiment.

Abstract

Laboratoriestudien av mikroalger kan vara experimentellt utmanande. Förutom odlingskraven för icke-fotosyntetiska mikroorganismer kräver fototrofer också belysning. Rutinmässigt försöker forskare tillhandahålla anpassade ljusförråd, dvs variera ljusintensiteten och tiden över vilken den levereras. Sådan flexibilitet är svår med vanliga bänkskivor. Vanligtvis kräver odlingsstudier också tillväxtjämförelser mellan experimentella behandlingar. Ofta bedöms tillväxten under en längre tid, t.ex. flera gånger om dagen under en veckolång prövning. Manuella mätningar kan vara tidskrävande och sakna dataupplösning. Därför är fotobioreaktorer (PBR) med automatisk tillväxtövervakning och anpassningsbar ljustillförsel användbara för replikerade experiment med flera behandlingar. Det aktuella arbetet presenterar design, konstruktion och drift av laboratorie-PBR. Materialen är lättköpta och relativt billiga. Designen kan dupliceras med måttlig skicklighet. Varje struktur har ett fotavtryck på ~ 40 cm² och är värd för tre 1 L glasflaskor för tredubbla replikering. Flaskor vilar på plattformar som innehåller magnetiska omrörare och är anordnade vertikalt inom ett 1 m högt och 15 cm diameter polyvinylkloridrör (PVC). Rörets inre är fodrat med lysdioder (lysdioder). Dessa lysdioder producerar kontinuerliga ljusintensiteter från 0–2400 μmolfotoner ^{m-2 s-1} av fotosyntetiskt aktiv strålning (PAR). Användare utformar ett anpassat belysningsprogram. Ljusintensiteten kan justeras varje sekund eller hållas konstant under längre perioder. Syre som produceras från fotosyntesen lämnar varje flaska via en enkelriktad volymetrisk gassensor. Programvara används för att registrera gassensordata. Mängden syre som produceras kan korreleras till biomassatillväxt. Om biomassaprover krävs kan en spruta användas för att extrahera odling. Metoden lämpar sig för mikroalger odlade med bikarbonat som kolkälla. Dessa PBR är värdefulla för ett laboratorium som kräver replikerade experiment, lätt regimflexibilitet och kontinuerliga högupplösta tillväxtdata.

Introduction

Mikroalger och cyanobakterier, gemensamt kallade mikroalger för enkelhetens skull, förespråkas för sin potential inom hållbar bioteknik. De är attraktiva kandidater på grund av deras snabba tillväxt, förmåga att odlas på icke-åkermark och för deras användning av solljus för att driva omvandlingen av koldioxid till biomassa ^1,2,3. Mikroalgal biomassa kan omvandlas till produkter som bioenergi i form av olja eller gas, livsmedelsfärger och näringstillskott och material som biopolymerer 1,4,5,6,7. Dessutom kan de användas för att rena avloppsvatten eller sanera vattendrag genom att konsumera överskott av näringsämnen ^8,9. Med tanke på detta är mikroalgalforskning utbredd och etablerad. Fältet växer när samhället omprövar koldioxidintensiteten och den miljömässiga hållbarheten i nuvarande tillverknings- och energiproduktionsmetoder.

Tre grundläggande krav för laboratoriebaserade mikroalgalstudier är ett odlingskärl, ljuskälla och metod för att kvantifiera tillväxt. Termen fotobioreaktor (PBR) beskriver en uppsättning där odlingskärl belyses¹⁰. Vanligtvis syftar studier av mikroalger till att jämföra tillväxt mellan två eller flera behandlingar, t.ex. olika tillväxtmedier, ljusregimer eller arter 11,12,13. För statistisk relevans bör varje tillstånd, t.ex. behandling och kontroll, replikeras. Om kontroll och behandling körs samtidigt innebär detta att många PBR måste övervakas och provtas under ett experiment. Utmaningen med att driva flera PBR är tvåfaldig. För det första är det viktigt för reproducer att tillhandahålla en enhetlig ljusintensitet till varje PBR men kan vara svårt. Mängden ljus som inträffar på kärlytan påverkas av dess avstånd från ljuskällan, skuggning från intilliggande kärl och bakgrundsljusfluktuationer¹⁴. För det andra måste en metod för att exakt kvantifiera tillväxten väljas.

Tillväxten mäts vanligtvis med cellantal, optisk densitet (OD), klorofyll A-innehåll, torrvikt (DW) densitet och askfri torrvikt (AFDW) densitet¹⁵. Cellantal, klorofyll A-innehåll och gravimetriska metoder är manuella processer som producerar diskreta datapunkter. OD kan mätas kontinuerligt och icke-invasivt med en spektrofotometer, förutsatt att den är välkalibrerad mot en annan metod såsom AFDW-densitet¹⁵. OD-mätningar och klorofyll A-innehåll kan dock vara opålitliga eftersom resultaten varierar under olika odlingsförhållanden, t.ex. mellan arter och under hela tillväxtcykeln ^15,16. För klorofyll A kan extraktionsmetoden också påverka pigmentutbytet¹⁷. Klorofyll A-innehåll är särskilt användbart för att spåra tillväxten av mikroalger inom mikrobiella samhällen som också innehåller icke-fotosyntetiska organismer^17,18. När man väljer en metod för att bestämma tillväxten är det viktigt att överväga suspensionens morfologi. När organismer klumpar sig och inte blandas väl är OD och cellantal inte möjligt¹⁵. En enda metod är inte lämplig för alla experimentella tillämpningar – forskare måste bestämma vilka metoder som är praktiska och relevanta för deras experimentella mål.

AFDW är en tillförlitlig metod som möjliggör tillväxtjämförelser mellan olika odlingsförhållanden, särskilt mellan arter och kulturmedier 15,19,20. För att beräkna AFDW koncentreras först ett prov av mikroalgalkultur, antingen genom filtrering eller centrifugering, och torkas. I detta skede kan DW bestämmas. Vanligtvis innehåller DW-provet minst 8–10% ask-oorganiskt material såsom salter och partiklar¹⁵. DW spårar tillväxttrender men kan vara skev om bidraget från oorganiska ämnen varierar. För att bestämma AFDW-densitet förbränns torr biomassa vid hög temperatur; detta förångar den organiska eller användbara delen medan den lämnar aska (oorganiska ämnen) efter¹⁹. För att beräkna AFDW subtraheras askfraktionens vikt från DW-fraktionen. I mikroalgala suspensioner varierar AFDW vanligtvis från 0,1–3 g/L 12,21,22. Små volymer utspädda suspensioner ger lite torr biomassa, <10 mg. Efter förbränning får aska endast väga 1 mg. Beroende på odlingstätheten kräver denna metod därför volymer mellan 5–100 ml och analytiska skalor som är exakta till 0,1 mg 12,15,19,22. Laboratorie-PBR är vanligtvis små, högst ett par liter, varför varje flytande prov tappar odlingsvolymen. Vidare är AFDW-metoden manuell och tar 2-3 dagar. För replikerade och repetitiva experiment är en automatiserad och kontinuerlig process att föredra.

För mikroalger som använder bikarbonat som kolkälla kan ytterligare två tillväxtmått mätas kontinuerligt. Fotosyntes förbrukar bikarbonat och producerar syre. Bikarbonatförbrukning driver upp medium pH²³. En nedsänkt pH-sond kan mäta denna förändring. Fotosyntetisk syreproduktion ökar mediets koncentration av upplöst syre (DO) tills mediet är mättat. Utöver mättnad finns syre som bubblor. Syreproduktion mäts med många olika tekniker: sonder mäter DO-koncentration, manometriska enheter bedömer huvudutrymmestryck, gaskromatografi mäter huvudrymdskompositionen och volymetriska sensorer registrerar gasutflöde 24,25,26,27. När syre används som tillväxtproxy måste odlingskärlen vara helt förseglade eller endast tillåta gasutflöde. För pH- och syremätningar måste kol tillföras i form av bikarbonat, inte genom_CO2-sparging. CO_2-sparging minskar mediet pH²³ och kan som gas störa syremätningar. En fördel med pH och syre jämfört med optisk densitet är att metoden inte äventyras om mikroalger bildar klumpar. Även om det är indirekt är både pH och syre effektiva för att jämföra tillväxt mellan behandlingar.

PBR som används idag varierar i komplexitet. Laboratorier kan använda enkla bänkkolvar, anpassade prototyper eller kommersiellt tillgängliga produkter. För forskargrupper som vill uppgradera från kolvar kan kostnaden för kommersiella PBR eller teknisk skicklighet och deltillverkning som krävs för att bygga många prototyper vara ett hinder. Detta manuskript syftar till att beskriva steg-för-steg-design, konstruktion och drift av laboratorie-PBR som överbryggar detta gap. Dessa PBR har en anpassningsbar ljusregim och övervakar tillväxten kontinuerligt genom att registrera volymetrisk syreproduktion. Denna design rymmer tre kulturkärl för trefaldig replikering och kan byggas med måttlig skicklighet och lättillgängliga material. Denna PBR är ett värdefullt tillskott till ett laboratorium som vill utöka sin kapacitet för mikroalgal forskning utan att investera i mycket tekniska eller dyra produkter. När forskare väljer att förvärva eller bygga en PBR måste de överväga lämpligheten av en design för deras kulturförhållanden, ekonomiska ställning och forskningsfrågor.

Protocol

1. Konstruktion av PBR-stativet Skär fem 380 mm längder och två 200 mm längder av vinklat slitsat stål med en handhållen bågfil. Fäst ihop med bultar och stora hörnstöd för att skapa ett stativs bas (figur 1A). Lim på säkerhetsändkåpor. Anslut två oklippta (1220 mm) vertikala längder av vinklat slitsat stål till basen. Säkra med bultar och metallhörnvindar (figur 1B). Lim på säkerhetsändkåpor. Skär fyra 65 mm plana längder av slitsat stål. Skruva fast dessa i 90 ° vinklar på de vertikala stöden – fäst två på varje stöd, en 130 mm upp från basen (figur 1C) och en 60 mm ner från toppen. Fäst vertikala stöd över toppen med en horisontell 140 mm längd av platt slitsat stål (tvärbalk) bultat på baksidan av ramen (figur 2A). 2. Konstruktion av ljuskammaren Skär ett vitt polyvinylkloridrör (PVC) med en diameter på 153 mm till en längd av 1070 mm. Skär röret på mitten på längden med en bandsåg. Slipa alla kanter. Jämnt utrymme och centrum fyra aluminium kylflänskanaler vertikalt tillsammans med rörets inre. Fäst inte kanaler inom 20 mm från rörets skärkant. Med små bultar, säkra kanalerna på plats på toppen och botten (figur 2B). Skruva fast ena halvan av röret på stativet med hjälp av de horisontella stöden som utformats i steg 1.3. Lägg ner reaktorn och återförena rörhalvorna genom att tejpa ihop dem. Centrera pianogångjärnet längs en cutline. Spåra gångjärnshålen och borra röret i enlighet därmed. Använd en nitpistol och medellånga nitar för att fästa gångjärnet på röret. Använd en liten bungee-sladd (se materialtabell) för att hålla röret stängt (figur 1C). Kontakta en elektriker för att koppla in LED-lamporna och installera följande fyra komponenter: LED-drivrutin, digital multiplex (DMX) avkodare, DMX-belysningsregulator och omkopplare (se materialtabell). Fäst alla komponenter på baksidan av PBR enligt figur 2A. 3. Konstruktion av flaskplattformarna Skär plattformsformer (figur 3A) av hårdplast, t.ex. högdensitetspolyeten (HDPE) (se materialtabell), med hjälp av dator numerisk styrning (CNC) fräsning. Gör tre av varje form.OBS: Att skära extra topp- och bottenskikt rekommenderas. Tejpa ihop botten- och toppskiktet. Markera och borra fem små hål, 6 mm i diameter, genom båda formerna (figur 3A). Använd en större borrkrona och expandera försiktigt ytan på dessa hål så att bulthuvuden kan försänkas (figur 3B). För var och en av de tre plattformarna, bulta två små hörnstöd på den bakre halvan av röret.OBS: Avståndet mellan toppen av hängslen ska vara 350 mm. Centrera varje bottenskikt ovanpå hängslen. Markera borrhålens placering under hängslen. Borra två hål med en diameter på 6 mm. Använd en större borr, expandera försiktigt hålytan så att bultarna kan försänkas. Bulta bottenskikten i hängslen (figur 3B–C). Skär femton stycken 12 mm långa 6,35 mm ytterdiameter (OD) styva slangar. Smörgås fem stycken av det styva röret mellan varje topp- och bottenskikt. Fäst lager och slangar tillsammans med långa smala bultar enligt figur 3B–D. Borra ett stort hål i PVC-röret bakom varje plattform. Sätt i varje mikromagnetisk omrörare i sin plattform. Trä varje omrörares elektriska kabel genom dessa nyskurna hål (figur 3C–E). Anslut varje omrörare till respektive styrenhet samt ett eluttag. Placera en 1 L flaska på varje plattform. Lägg till ögonbultar i det bakre röret på flaskhalsnivå. Linda en liten bungee-sladd runt varje flaskhals för att ge stabilitet (figur 4A).OBS: Under hela protokollet kommer färgkodningsplattformar, flaskor, magnetomrörare och alla tillhörande kablar och sensorer att vara till hjälp. 4. Konstruktion av vätskeprovtagningsportarna (valfritt) Skär tre 60 mm längder på 6,35 mm OD styv slang. Borra hål genom varje gummipropp med en 5 mm borr. Tryck styva rörlängder genom proppen. Skär tre 60 mm längder på 3,18 mm OD styv slang. Anslut dessa med en rak reducerare till det utskjutande röret på undersidan av varje propp. Sätt i en enkelriktad stoppventil (t.ex. port 1 = luerhona, port 2 = hanglidning Luer) i det utskjutande röret på varje proppyta (figur 4A). Skär tre 30 mm längder på 3,18 mm OD flexibel slang. Sätt i Luer-beslag (t.ex. manlig Luer till slangstång och kvinnlig Luer till slangstång) i vardera änden. Anslut bitarna i steg 4.4 till stoppkransventilerna på ytan av varje gummipropp (figur 4A).OBS: Många kombinationer av stoppkranar och Luer-beslag kan ge samma resultat. Konstruktionen ska göra det möjligt att dra ut vätska eller sättas in via en spruta. 5. Ansluta volymetriska gassensorer Förbered gassensorer enligt tillverkarens instruktioner.OBS: Detta innebär främst att fylla gassensorer med förpackningsvätska (figur 4B). För att göra gasledningarna, skär tre 1000 mm längder på 3,18 mm OD flexibel slang. Borra tre hål med en diameter på 4 mm i det bakre PVC-röret. Placera hålen bredvid gångjärnet i flaskhalshöjd. Gänga gasledningar genom dessa hål (figur 4A). Till slutet av gasledningen inuti PVC-röret, lägg till en Luer-koppling (t.ex. slangstång till hane Luer) och anslut en envägs stoppkranventil (t.ex. port 1 = kvinnlig Luer, port 2 = hane Luer).OBS: Ventilen krävs endast när vätskeprovtagningsportar också är installerade. Anslut den andra änden av gasledningen till gassensorns inloppsport med en rak reducerare. Säkra denna anslutning med en dragkedja. Anslut alla gassensorer till den digitala ingångsmodulen (DIM) med jackkontaktkablar och DIM till en dator i närheten. Installera datainsamlingsprogrammet (se Materialtabell) på ett Windows-operativsystem och anslut licensnyckeldongeln. Lägg till sensorkalibreringsfiler i programvarans kalibreringskatalog. 6. Programplanering av det enklare systemet Använd den bakre på / av-omkopplaren, slå på PBR och anslut DMX-belysningsregulatorn till en dator via en mikro-USB-kabel. Ladda ner Store Upgrade Tools (SUT) och LED-kontrollprogramvaran (se materialtabell). Registrera DMX-belysningsstyrenheten online. Öppna LED-kontrollprogramvaran och välj Klicka här för att arbeta med USB-DMX-gränssnittet: SUSHI-RB-RJ. Under fliken Inställningar i rutan ScanLibrary väljer du mappen Generic och Single Channel. Ändra ScanLibrary-inställningarna till DMX universe 1, antalet fixturer till 4 och indexnumret till 1. I det övre högra hörnet ändrar du listrutan till Listvy. Slutligen klickar du på Patch (kompletterande figur 1).OBS: I DMX-universum testar en ruta varje LED-remsas kontroll genom att skjuta dimmerknapparna eller ange ett numeriskt värde i textrutan. Gör en standardkurva som relaterar den digitala ljusinställningen i programvaran för belysningsstyrning till ljusintensiteten som upplevs i mitten av PVC-röret (figur 5). Mät inre ljusintensitet med en liten sfärisk sond (se materialtabell) upphängd i mitten av PVC-röret. Gå vidare till fliken Redigerare . Om du vill skapa ett anpassat ljusprogram skapar du en ny scen och börjar lägga till steg. Se tilläggstabell 1 för ett exempel på 16:8 h dagsprogram. Ställ in scenen på loop.OBS: Steg bryter ner scener i tidsblock, som var och en kan ställas in på olika ljusintensitet. Stegen sträcker sig från 1 s till 43 min. Här är 30 minuters steg mest praktiska. Flera scener kan laddas på en DMX-belysningsstyrenhet. Skapa en extra hjälpscen som är omedelbart igenkännlig, t.ex. två av de fyra lysdioderna på.OBS: Scener kan bläddras igenom manuellt med knappen på sidan av DMX-belysningskontrollen. Om det önskade ljusprogrammet börjar under natten är det omöjligt att skilja om ljusprogrammet redan har startat. Hjälpscenen fungerar som en indikator på att DMX-belysningsregulatorn fungerar korrekt. Spara scenerna och gå vidare till fliken Fristående . Skriv minnet på DMX-belysningsregulatorn och koppla bort enheten från datorn. Anslut DMX-belysningsregulatorn till strömkällan med en mikro-USB. Innan du startar ett experiment, testa ljusprogrammet genom att logga den interna ljusintensiteten under en varaktighet på 24 timmar. Om vätsketemperaturen är av intresse, logga detta samtidigt med en nedsänkt temperatursond (figur 6). 7. Starta ett experiment Sterilisera media, flaskor, omrörare, gummiproppar, provtagningsportar, gängade skruvlock och slangar.OBS: Alla komponenter som används i denna design är autoklaverbara utom ventilerna och Luer-beslagen – det finns autoklaverbara alternativ från andra tillverkare. Öppna datainsamlingsprogrammet och fyll i konfigurationssidan (kompletterande figur 2). Tilldela kalibreringsfiler till deras respektive sensorer. Under Katalogfilnamn väljer du motsvarande DIM-portnummermapp. Klicka på Aktuell mapp och upprepa för alla portar. Klicka på OK för att gå vidare till loggningssidan. Fyll flaskorna till önskad volym med odlingsmedium (tilläggstabellerna 2,3).OBS: Var och en av dessa flaskor rymmer högst ~ 1.1 L med ett litet huvudutrymme (~ 80 ml, inklusive gasledningen). Centrifugera stamkulturen i tre balanserade 50 ml rör i 15 minuter vid 4500 x g för att ge tre pellets. Tillsätt en pellet till varje flaska – tvätta i pellets med en serologisk pipett och färskt medium.OBS: Odlingstätheten för dag 0 är också känd som den initiala biomassakoncentrationen (IBC). För att mäta IBC i gAFDW. L-1 kan ytterligare ett rör på 50 ml centrifugeras i steg 7.6. Den resulterande pelleten kan sedan torkas och förbrännas 15,19. Steg 7.6 kommer sannolikt att kräva modifiering baserat på användarnas individuella mål och deras experiment. Släpp en magnetomrörare, 25 x 8 mm, i varje flaska. Försegla varje flasköppning med en gummipropp och gängat bländarskruvlock (figur 4A). Om valfria provtagningsportar är installerade, stäng ventilerna. Leta reda på änden av varje gasledning inuti PVC-röret (inbyggt i steg 5.4) och fäst en nål på ventilens Luer-port för hanen. Anslut varje flaska till dess gassensor genom att genomborra varje gummipropp med motsvarande nål. Starta varje gassensor individuellt genom att markera kryssrutan till vänster på skärmen, klicka på Start och mata in ett filnamn. Klicka på OK och upprepa för alla sensorer (kompletterande bild 3).När du loggar ska du inte lämna datainsamlingsfönstret. Ställ in datorns ström- och viloinställningar på aldrig och skjut upp datoruppdateringar under experimentets varaktighet. Slå på PBR och se till att DMX-belysningsregulatorn är ansluten till en strömförsörjning. Den första programmerade scenen börjar automatiskt. Se steg 6.7 för att bekräfta att DMX-belysningsregulatorn fungerar korrekt. 8. Flaskprovtagning (valfritt) Bered ytterligare 500 ml av det färska mediet innan försöket påbörjas (tilläggstabell 2).OBS: Om ett 24-timmars ljusprogram med en 16: 8-timmars dygnscykel startades klockan 9, skulle provtagningstiderna före skymning och gryning falla klockan 8 och 16 (tilläggstabell 1). Här hänvisar gryning och skymning till 30 min steg som övergår ljus från ON till OFF och vice versa. Stäng ventilen på gasledningen. Anslut en spruta (10 ml) till provtagningsportventilen (bild 4A). Öppna provtagningsportventilen och dra ut 8 ml kultur.OBS: Mellan 5–10 ml rekommenderas. Att ta bort vätska genererar ett vakuum i huvudutrymmet, vilket gör volymer > 10 ml svåra att extrahera. Stäng provtagningsportventilen och koppla bort sprutan. Anslut en spruta som innehåller 8 ml färskt medium (från steg 8.1) till provtagningsportventilen. Öppna provtagningsportventilen och injicera färskt medium.OBS: Att ersätta volymen av provkulturen med färskt medium tjänar till att bibehålla en lika stor volym och tryck i huvudutrymmet och spola provtagningsportledningen. Stäng provtagningsportventilen innan du kopplar bort sprutan. Upprepa steg 8.2–8.8 vid varje provtagningstidpunkt. 9. Avsluta ett experiment Markera alla aktiva portrutor i datainsamlingsfönstret och klicka på Stopp. Om du vill exportera data väljer du Fil- och offlinedata. Välj alla relevanta loggfiler. Exportera data till kalkylprogram och spara. För varje flaska, konvertera den totala volymen syre mätt i ml till mol med hjälp av den ideala gaslagen. Förutsäga vikten av odlad biomassa (gAFDW) om 1,05 molO2 genereras för varje mol biomassa som produceras. Ta molvikten av biomassa som 24,6 g mol-1. Hantera flödeshastighetsdata manuellt. Använd enheter av ml/h och ett 3-punkts glidande medelvärde.

Representative Results

Här är syreflödeshastigheten ett mått på kulturens fotosyntetiska hastighet. Högre fotosynteshastigheter, och därmed kolfixering, översätts till högre tillväxthastigheter. Detta innebär att användaren kan jämföra syreflödeshastigheter mellan olika behandlingar och operationsdagar som en proxy för tillväxt. I korthet fungerar gassensorn genom att fånga och släppa gasbubblor i en mätcell med dubbla kammare (figur 4B). Gasbubblor från inloppet vid sensorns bas färdas upp genom förpackningsvätskan. Bubblor ackumuleras i en kammare i mätcellen till en volym av ~ 3,2 ml. När denna tröskel har uppnåtts spetsar mätcellen. Detta frigör gasen och återställer systemet. Varje tips registreras av datainsamlingsprogramvaran. I exempeldata jämfördes tillväxthastigheten för tre behandlingar med varierande ljusintensiteter dagtid och initiala biomassakoncentrationer (IBC). Dessa behandlingar valdes godtyckligt för demonstrativa ändamål. De var (A) 300 μmolfotoner m-2 s-1 och 0,03 gAFDW L-1, (B) 600 μmolfotoner m-2 s-1 och 0,13 gAFDW L-1 och (C) 600 μmolfotoner m-2 s-1 och 0,40 gAFDW L-1. Dessa bestrålningar mättes med en sfärisk sond i mitten av PVC-röret innan flaskor placerades på plattformarna. Kulturdjup och densitet påverkar ljusdämpningen. Därför kan den faktiska ljusintensiteten som mikroalger upplever variera från de rapporterade. Varje behandling utfördes i tre exemplar – inom en PBR innehållande tre flaskor. Här kännetecknades ett framgångsrikt experiment av nära replikerade dagliga mönster för gasproduktion (figur 7A–C). Under upplysta timmar (dag) ökade gasproduktionen stadigt och under icke-upplysta timmar (natt) stannade gasproduktionen (figur 7A–C). Två gaser produceras av mikroalger, syre från fotosyntes och koldioxid från andning28. Fotosyntesen är begränsad till upplysta timmar, medan andningen sker kontinuerligt men är mest aktiv på natten28. Fotosyntes bygger, medan andning kataboliserar biomassa28. Ursprungligen är sammansättningen av huvudrymdsgas identisk med atmosfärens. Med varje vändning av mätcellen förskjuterO2 atmosfärisk gas. Därför tillskrevs gassensoravläsningar produktionen avO2 även om den utgående gasen inte var renO2. Det lägsta gasinloppstrycket för gassensorn är extremt lågt, 8–9 mbar, vilket gör att flaskhuvudets tryck endast är något över atmosfären (1,01 bar vid havsnivå). Därför börjar gassensoravläsningar strax efteratt O2-bubblor lämnar mediet. CO2 som frigörs från andning bidrar inte till gassensoravläsningar av två skäl. För det första reagerarCO2 i det alkaliska mediet på bikarbonat, vilket minskar pH (figur 8). För det andra, om CO2 släpper ut, löser gassensorns förpackningsvätska, Silox,CO2-bubblor innan de kan nå mätcellen och utgasar CO2 vid vätskeytan29. Detta stöds av bristen på gassensoravläsningar över natten. De som inträffade registrerades strax efter att lamporna släcktes, vilket indikerar att avläsningar representerade kvarvarande syrefrisättning dagtid (figur 7). I den experimentella installationen (med användning av lokala temperatur- och tryckdata) krävde ett 80 ml huvudutrymme vid omgivningstryck 340 ml exlöstO2 för att upprätta ettO2-partialtryck på 99%. Här varierade den totala volymen syre som producerades under 4 dagar från 316 (SEM ± 11) ml vid behandling A till 902 (SEM ± 51) ml vid behandling C (tabell 1). Därför, i slutet av experimentet, skulle huvudutrymmet för alla flaskor ha innehållit främstO2. Den ökade koncentrationen av huvudrymdenO2, och därmed minskad koncentration avN2, skulle ha påverkat dessa gasers partialtryck och mättnad. Med ett 99% O2-huvudutrymme beräknades en 5x ökning av DO. För 1,1 L-kulturerna översattes detta till ytterligare23 ml DO. Detta innebär att under ett nästan rent syreutrymme förskjuts merO2 änN2 . Således, eftersom merO2 förblir i mediet, skulle denna effekt ha lett till små underskattningar i mängden fotosyntetiskt syre som produceras. Den huvudsakliga utmaningen med denna metod uppstod när kulturerna blev täta. Med mer biomassa, och därmed mer andning, ökade efterfrågan påO2 . Nattetid O2-förbrukning genererade ett huvudutrymme under tryck. Detta fick gassensorns packningsvätska att färdas upp genom gasledningen. NärO2-produktionen återupptogs måste förpackningsvätska drivas tillbaka in i gassensorerna. Detta orsakade en fördröjning i den första gassensoravläsningen. Men den fjärde natten orsakade storleken på detta undertryck att förpackningsvätskan nådde och droppade i två av de tre replikaten av behandling B, vilket genererade ett ytoljebälte. På grund av den reducerade packvätskenivån kortsluts gassensorerna och släpper ut omätadO2 direkt till atmosfären. Detta ledde till att datainsamlingen blev platt (figur 7B). Undertryck kan också orsakas av en temperaturinducerad sammandragning av huvudutrymmets volym. Effekten här var dock minimal. Kylflänskanaler och luftflöde avledde tillräckligt överskottsvärme. Av de två testade ljusregimerna minskade den maximala temperaturförändringen huvudutrymmesvolymen med 1% eller mindre, vilket motsvarar en 800 μL packningsvätskeförskjutning i ett 80 ml huvudutrymme. Den maximala dygnstemperatursvängningen var 1,4 °C för 300 μmolfotoner m-2 s-1-regimerna (figur 6) och 3,2 °C för 600 μmol-fotonerna m-2 s-1-regimerna. Den genomsnittliga dagtemperaturökningen för 300 och 600 μmolfotoner m-2 s-1-regimerna var 0,7 respektive 1,8 °C. Odlingstemperaturerna återgick till baslinjen över natten (figur 6). Högupplösta tillväxthastighetsdata kan avslöja trender som annars kan gå obemärkt förbi. Tänk på behandlingar B och C. Trots sina olika IBC genererade båda samma mängd total biomassa (gAFDW), vilket orsakade en identisk förskjutning av medium pH (tabell 1). Med tanke på endast startdata och slutliga datapunkter kan en individ med rätta inte anta någon skillnad i den genomsnittliga tillväxthastigheten mellan de två behandlingarna (tabell 1). Online-syreflödesdata avslöjade dock att varje behandling hade varierande dagliga tillväxthastigheter. Dessa variationer återspeglades också i pH-mätningar två gånger dagligen (figur 8). Dag ett var tillväxttakten för behandling B lägre än för behandling C. Vid dag tre vände detta med behandling B: s tillväxthastighet som översteg den för behandling C (figur 7B, C). Syreflödesdata indikerade att den högsta tillväxthastigheten inträffade dag tre i behandling B (figur 7B). Den totala volymen syre som genererades av varje flaska i de tre behandlingarna användes för att uppskatta deras respektive förändring av total biomassa (gAFDW). Detta uppnåddes med användning av en generisk ekvation för fotosyntetisk biomassasyntes:CO2 + 0,2NH3 + 0,6H2O =CH1,8O0,5 N 0,2 + 1,05O2. Ökningen avO2-partialtrycket i huvudutrymmet och den efterföljande ökningen av DO-mättnaden förväntades orsaka en liten underskattning av biomassatillväxten. Detta gällde för fem av sju exempel (tabell 2). I genomsnitt låg den uppskattade biomassatillväxten inom 10 % av den uppmätta biomassatillväxten. Vissa uppskattningar skilde sig med endast 1–3 mg från uppmätt tillväxt. Två exempel överskattade tillväxten, dvs. mer syre producerades än biomassatillväxt kunde stå för. VarjeO2 som konsumeras genom andning över natten bör återspeglas i fördröjningen iO2-produktionen följande dag. Här avslutades experimenten vid nattens slut. På detta sätt blir biomassakatabolism över natten under de sista 8 timmarna av varje experiment omätad. Detta kan orsaka överskattningar av biomassatillväxt, särskilt i täta kulturer. Som sådan rekommenderas att experiment avslutas i slutet av upplysta timmar. Figur 1: Reaktorstativbas (A) Mått på baskomponenter i mm. (B) Orientering av metallhörnvindar som säkrar de två vertikala stöden. (C) En av fyra korta stållängder förbinder den bakre halvan av PVC-röret med reaktorstället. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 2: Elektriska komponenter. (A) Bakifrån av PBR som visar övre tvärbalk och konfiguration av elektriska komponenter. (B) Framifrån av PBR efter ljusinstallation. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 3: Flaskplattformsdetaljer (A) Mått på övre och nedre lager i mm. (B) Infällda bulthuvuden i båda skikten. (C) Hängslen ansluter bottenskiktet direkt till den bakre halvan av PVC-röret. (D) Fem korta stycken styva slangar monterade över smala bultar håller isär de övre och nedre skikten. (E) När flaskplattformen är klar ska ytan vara jämn. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 4: Gasledning och valfri provtagningsport. Om provtagningsporten krävs bör gasledningarna innehålla en envägsventil omedelbart nedströms nålen. (B) Volymetrisk gassensor. Vätskeförpackningsnivån ska vidröra spårningsskruven. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 5: Standardkurva som relaterar inställningar för LED-kontrollprogramvara till intern ljusintensitet. Vita cirklar och grå trianglar representerar var och en en individuell PBR. För varje ljusinställning ställdes alla fyra armaturerna in på samma värde. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 6: Kulturtemperaturförändring för 300 μmolfotoner m-2 s-1 ljusregimer. Under 24 h, 16: 8-h dagsprogram ökade lysdioderna kulturtemperaturen på dagtid. Den blå pilen indikerar skillnaden mellan lägsta och högsta temperatur. Ett lätt programfel orsakade temperaturdippen före skymningen; detta korrigerades innan experimentet påbörjades. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 7: Syreproduktion under tre unika experimentella förhållanden. Varje reaktor fick en annan kombination av ljusintensitet och initial biomassakoncentration (IBC); (A) 300 μmolfotoner m-2 s-1 och IBC 0,03 gAFDW L-1, (B) 600 μmolfotoner m-2 s-1 och IBC 0,13 gAFDW L-1, (C) 600 μmolfotoner m-2 s-1 och IBC 0,40 gAFDW L-1. De översta diagrammen visar kumulativ syreproduktion (ml) och gasflödeshastigheten (ml / h). Heldragna svarta linjer, streckade blå linjer och prickade röda linjer är replikat. Körningen för varje experiment var 104 timmar, vilket inkluderade fyra kompletta 16:8-timmars dag-natt-cykler. Mörkorange skuggning representerar nattetid och ljusorange dagtid. Observera att vid behandling B planar syreproduktionen på dag 4 för två av de tre replikaten. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 8: pH-respons. Varje reaktor fick en annan kombination av ljusintensitet och IBC; (gröna diamanter) 300 μmolfotoner m-2 s-1 och IBC 0,03 gAFDW L-1, (röda trianglar) 600 μmolfotoner m2 s-1 och IBC 0,13 gAFDW L-1, (lila cirklar) 600 μmolfotoner m-2 s-1 och IBC 0,40 gAFDW L-1 . Mörkorange skuggning representerar nattetid och ljusorange dagtid. Felstaplar representerar medelvärdets standardfel. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Behandling Ljusintensitet (μmol fotoner m-2 s-1) IBC (gAFDW L-1) Δ Total biomassa (gAFDW) Δ pH Totalt syre som produceras (ml) A 300 0.031 0,289 (± 0,01) 0,15 (± 0,01) 316.2 (±11.4) B 600 0.130 0,674 (± 0,02) 0,52 (± 0,27) 834.6* C 600 0.400 0,675 (± 0,02) 0,55 (± 0,03) 902,2 (±50,5) * Endast en av de tre replikaten lyckades Tabell 1: Tillväxtmåttskifte från timme 0 till 104. Parenteser representerar medelvärdets standardfel. Behandling Ljusintensitet (μmolfotoner m-2 s-1) IBC (gAFDW L-1) Uppmätt tillväxt av biomassa (gAFDW) Förväntad tillväxt av biomassa (gAFDW) Underskatta (%) A 300 0.031 0.289 0.288 0.5 A 300 0.031 0.311 0.270 13.1 A 300 0.031 0.268 0.247 7.9 B 600 0.13 0.708 0.705 0.4 C 600 0.4 0.718 0.796 -10.9 C 600 0.4 0.640 0.830 -29.7 C 600 0.4 0.668 0.659 1.3 Tabell 2: Tillväxtuppskattningar baserade på totalt uppmätt syre. Endast en replikat från 300 μmolfotonerna m-2 s-1 och IBC = 0,13 gAFDW L-1-behandling löpte till slutförande. Kompletterande bild 1: Skärmdump från LED-kontrollprogramvara. Var och en av de fyra armaturerna kan styras oberoende av varandra genom att skjuta dimmerknapparna eller ange ett numeriskt värde i textrutan. Klicka här för att ladda ner den här filen. Kompletterande bild 2: Skärmbild av konfigurationsfönstret för datainsamlingsprogramvara. Klicka här för att ladda ner den här filen. Kompletterande bild 3: Skärmbild av loggningsfönstret för datainsamlingsprogram. Ljusgröna rektanglar indikerar gassensorer online. Data visas i realtid. Klicka här för att ladda ner den här filen. Kompletterande tabell 1: Exempel 24 h lätt regim. För ett 16: 8 h dagsprogram finns det 48 uppsättningar på 30 minuter vardera. Asterisker anger föreslagna provtagningstider. Klicka här för att ladda ner denna tabell. Tilläggstabell 2: Hög alkalinitet hög pH mediumsammansättning. Klicka här för att ladda ner denna tabell. Tilläggstabell 3: Spårämneslösning. Lägg till en slutlig koncentration på 1 ml / l till basmediet. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Discussion

Inom detta protokoll ökar sannolikheten för att generera reproducerbara data av hög kvalitet genom att fokusera på följande steg. Vid konstruktion av reaktorstativet (steg 1) måste basen vara robust med väljusterade vertikala stöd. Slitsat stål har skarpa kanter, så det är viktigt att lägga till säkerhetslock. Flaskplattformens ytor måste vara helt plana, magnetomröraren och bulthuvudena ska båda sitta under det övre lagrets yta (steg 3.2–3.6). Enligt tillverkarens instruktion bör gassensorns förpackningsvätska fyllas till “spårningsskruven för vätskenivå” för noggranna syremätningar. Denna vätskenivå bör kontrolleras regelbundet eftersom avdunstning av förpackningsvätskan kan kortsluta mätcellen. Alla tre gasledningar som tillverkas i steg 5.2 bör vara lika långa; Detta säkerställer att replikerar har identiska huvudutrymmesvolymer. Innan du påbörjar ett experiment är det lämpligt att testa den programmerade ljusregimen genom att logga ljusintensiteten under en 24-timmarsperiod (steg 6.11). Om det är oroande att vätsketemperaturen ökar bör detta test även omfatta en förseglad flaska med en inre temperatursond (steg 6.11). När du loggar, lämna inte programvarufönstret för datainsamling. detta kommer att avsluta loggningen. Om du tar odlingsprover, var försiktig så att du inte släpper ut gas i huvudutrymmet genom att öppna ventilerna i fel ordning (steg 8.2-8.8). När du granskar experimentella data bör du informera om att datainsamlingsprogramvaran automatiskt genererar ett glidande medelvärde av flödeshastigheten. Detta blåser upp värdet på de en eller två flödeshastighetsavläsningar som genereras över natten. Kurera gassensorloggar manuellt för att åtgärda detta.

Det vanligaste bakslaget med denna metod är potentialen att kortsluta gassensorn om vätskeförpackningsnivån sjunker. Det finns två sätt detta kan ske på. För det första kan avdunstning långsamt minska vätskenivån. Detta är dock osannolikt under ett kortvarigt (<7 dagar) experiment²⁹. För det andra kan höga andningshastigheter dra syre in i lösningen och generera ett huvudutrymme under tryck. När ljusenergi inte är tillgänglig använder mikroalger aerob andning för att leverera den energi som krävs för cellulärt underhåll och reparation²⁸. Därför kan syreförbrukningen och det resulterande undertrycket vara betydande i täta kulturer under icke-upplysta timmar. Detta suger packvätska från gassensorerna in i gasledningen. Avståndet som förpackningsvätskan färdas är proportionellt mot mängden andning nattetid. Om förpackningsvätskan kommer in i flaskorna genererar detta ett oljeläckage på vätskeytan.

Om höga andningsfrekvenser nattetid förväntas kan ändringar i protokollet göras. Det enklaste sättet att undvika undertryck är att lämna flaskhuvudena öppna över natten. Detta har också fördelen att lätta på DO-nivåerna genom att minska det partiella huvudutrymmestrycket för_O2. Höga DO-koncentrationer tros vara skadliga för tillväxten eftersom O₂ kan hindra aktiviteten hos Rubisco och kan utlösa oxidativ stress^30,31. Det är inte ovanligt att kultursuspensioner når 4x övermättnad även vid kontakt med atmosfären^25,32. För att öppna huvudutrymmet, koppla bort gasledningen från nålen som spänner över gummiproppen. Nattetid kan fungera som ett fönster för att fylla på gassensorförpackningsvätska eller manipulera kontinuerliga experiment med liten inverkan på datainsamlingen. Till exempel kan man ändra odlingstätheten, uppdatera näringsämnen, lägga till en ändring eller införa en patogen. Flaskorna måste förseglas igen och gassensorledningen anslutas igen innan lamporna tänds igen. Syremätningarna som samlats in från experiment med stängda kontra öppna nattliga huvudutrymmen kommer att skilja sig åt.

När flaskorna förblir förseglade minskar syreförbrukningen nattetid antalet mol_O2 i huvudutrymmet. Detta gör att packningsvätska kryper upp i gassensorledningen för att bibehålla huvudutrymmets tryck. När lamporna tänds återupptas syreproduktionen. Förpackningsvätska måste tryckas tillbaka in i gassensorn innan flödeshastighetsavläsningarna börjar. Denna fördröjning är därför proportionell mot graden av andning nattetid. På detta sätt, när huvudutrymmet förblir stängt, representerar_{O2-avläsningar} netto_{O2-produktion} (fotosyntetisk produktion – andningsförbrukning). Omvänt, när huvudutrymmet är öppet på natten, ersätter atmosfärisk gas vilket huvudutrymme O₂ förbrukas, och ingen förpackningsvätska kommer in i gasledningen. Resultatet är att_{andnings-O2-förbrukningen} inte redovisas i_{O2-produktionsdata} . Detta kan minska noggrannheten i uppskattningarna av tillväxt av AFDW-biomassa. Det bör dock inte påverka nyttan av att använda O_2-produktion dagtid som ett mått för att jämföra tillväxt mellan behandlingar.

Alla laboratorie-PBR drabbas av samma begränsning; konstgjorda lampor kan inte replikera solspektrumet. Mikroalger använder våglängder av ljus mellan 400–700 nm för fotosyntes. Denna region kallas fotosyntetiskt aktiv strålning (PAR)³³. Solljus och artificiellt ljus varierar i deras relativa bidrag av våglängder inom detta intervall. Detta, tillsammans med gynnsamma temperaturer och en konstant ljustillförsel, innebär att laboratorietillväxtdata ofta inte kan extrapoleras på ett tillförlitligt sätt till utomhusförhållanden. Dessa PBR kan dock ta itu med en av begränsningarna för pbr-ljusförsörjning i laboratorium. Solljusintensiteten är mycket varierande under hela dagen, med molntäcke som genererar övergående fluktuationer i incident PAR. Programvaran för belysningsstyrning och DMX-belysningsregulatorn kan ge ljusintensiteter från 0 till 2400 μmol_fotoner ^{m-2 s-1} och därefter. Lätta regimer kan delas upp i enskilda steg så korta som 1 s. Avstämbar ljusintensitet gör det möjligt för användaren att efterlikna utomhusljusmönster närmare än vanliga PBR-inställningar. Här bleknar simulerade 30 min grynings- och skymningsintervaller dag- och nattcykler tillsammans (tilläggstabell 1).

Även om AFDW-densitet har blivit standardmåttet på tillväxt, kan denna metod kräva betydande odlingsvolymer, en 2–3-dagars bearbetningsperiod och genererar en datapunkt i taget. Vidare, om förhållandena blir ogynnsamma och celler dör, diskriminerar AFDW-densiteten inte mellan aktivt fotosyntetiserande celler och de som sönderdelas. Kvantifiering av hastigheten för fotosyntetisk syreproduktion fungerar som en alternativ tillväxtproxy. Denna PBR-design kan registrera syreproduktion kontinuerligt med liten användarintervention samtidigt som odlingsvolymen bevaras. Dataupplösningen kan förbättras genom att välja en gassensor med en lägre mätcellvolym, t.ex. 1 ml. Vidare, om kulturer är väl blandade, kan användare välja att installera en spektrofotometer för kontinuerliga optiska densitetsavläsningar. Om temperaturreglering av mediet önskas kan en återcirkulerande kylare tillsättas. Dessa PBR är ett värdefullt tillskott till ett laboratorium som vill utöka sin mikroalgala forskningskapacitet utan stora ekonomiska investeringar. De är särskilt lämpliga för dem som arbetar med hög alkalinitet, högt pH-arter som Spirulina. Dessa PBR erbjuder lätt regimflexibilitet och är giltiga för snabba, replikerade, laboratorietillväxtjämförelser.

Materials

Aluminum channels Imperial: 0.90” x 39.37” Metric: 2.3 cm x 100 cm Quantity: 4	LED World	AC-AR1-1M	Required as a heat sink
Bungee cords, small Quantity: 5	–	–	To secure bottles
Computer – desktop/laptop Quantity: 1	–	–	–
Data Logger, HOBO U30 USB Weather Station Quantity: 1	HOBO, Hoskin	U30-NRC-VIA-10-S100-000	Records light sensor information
Digital interface module, Rigamo, 4-channel Quantity: 1	Ritter	N/A	This is to transmit gas sensor data to the computer
DMX decoder, 12~24 VDC, DMX-CV-4X5A Quantity: 1	LITECH, LED World	LT-840-6A	Transmit messages which alter the light pattern
DMX lighting controller, SUSHI-RB-RJ Quantity: 1	Arcolis, Nicolaudie America Inc.	SUSHI-RB-RJ DMX	Encodes the lighting program
Gas sensor packing liquid (Silox) Quantity: 1 L	Ritter	https://www.ritter.de/en/data-sheets/silox
Gas sensor, volumetric Quantity: 3	Ritter	MGC-1 V3.4 PMMA (https://www.ritter.de/downloads/mgc-milligascounter-en)	Measures oxygen production
Glass bottles, round 1 L with GL45 neck Quantity: 3	Corning, Capitol Scientific	1395-1L	Culture vessels
Hardware – end caps for slotted steel Quantity: 10	Paulin, Home Depot	142-612	To cover sharp edges of slotted steel
Hardware – eye hooks Quantity: 6	–	–	To secure bottles
Hardware – metal corner braces (large) Imperial: 4" x 4" Metric: 10 cm x 10 cm Quantity: 8	–	–	Larger brackets to construct metal stand
Hardware – metal corner braces (small) Imperial: 2 1/2" x 2 1/2" Metric: 6.4 cm x 6.4 cm Quantity: 6	–	–	Small brackets to connect bottle platforms to PVC pipe
Hardware – metal corner gussets Imperial: 3" x 3" Metric: 7.6 cm x 7.6 cm Quantity: 6	Paulin, Home Depot	142-616	Flat brackets to construct metal stand
Hardware – piano hinge Imperial: 36" Metric: 91 cm Quantity: 1	–	–	Connects two halves of PVC pipe
Hardware – rivets Quantity: 40	–	–	To attach piano hinge to PVC tubing
Hardware – set of bolts, nuts, washers Quantity: 60	–	–	Long thin bolts are required to secure bottle platforms around magentic stirrers
Hardware – set of bolts, nuts, washers Quantity: 30	–	–	Larger shorter bolts are required to build the metal stand
LED driver, constant voltage, 96W 24VDC UL Listed IP65 Driver Class 2 regulated power supply Quantity: 1	Magnitude Lighting, LED World	CVN96L24DC	Regulates power to the lights
LED lights, Cinco Bright LED Flex Strip Quantity: 4 m roll	EvenBright, LED World	FA128M57-4M-24V-X	Roll is trimmed into 4 x 1 m lengths and secured inside the PVC tube
Light meter, handheld with submersible sperical probe Quantity: 1	LI-COR	LA-250A	Calibrate the reactors light intensity
Light sensors Photosynthetic Light (PAR) Smart Sensor Quantity: 2	HOBO, Hoskin	S-LIA-M003	Only one is required however two would be good practice in case one malfunctioned
Magnetic stirrers (MIXdrive 1 XS) with external control units and power supply (MIXcontrol eco) Quantity: 3	2Mag, 2MAG USA	MF 40300	Stirrers sit sandwiched in bottle platforms
Metal plate Imperial: 24" x 8" Metric: 61 cm x 20.3 cm Quantity: 1	–	–	This is a surface on which to secure electronics, it is attached to the back of the reactor
Pipe, white PVC Imperial: 6" diameter x 42" high Metric: 15.2 cm x 106.7 cm Quantity: 1	–	–	Cut lengthwise in two halves, used to house lights and bottles
Plastic (HDPE) sheets Imperial: 4" x 4" x 1/4" Metric: 10 cm x 10 cm x 1 cm Quantity: 6	Inventables	30291-01	For bottle platforms which house magentic stirrers
Rubber stoppers – GL45 size Quantity: 3	Duran, VWR	76289-760	Seals culture vessels
Screw caps – with aperture and GL45 neck Quantity: 3	Corning, Capitol Scientific	1395-45HTSC	Generates seal of culture vessels
Slotted angle steel lengths Imperial: 1-1/2" X 48" x 0.074" Metric: 3.8 cm x 122 cm x 0.19 cm Quantity: 6	Paulin, Home Depot	142-202	Makes up the body of the metal stand
Slotted flat steel lenghts Imperial: 1-3/8" x 48" x 0.074" Metric: 3.5 cm x 122 cm x 0.19 cm Quantity: 3	Paulin, Home Depot	142-222	Makes up the body of the metal stand
Software – Easy Stand Alone (ESA)		https://www.dmxsoft.com/#apps	AKA LED control software
Software – Rigamo v3.1			AKA data acquisition software
Software – Storage Upgrade Tools (SUT)		https://store.dmxsoft.com//
Stir bar Imperial: 1" x 5/16" Metric: 2.5 cm x 0.8 cm Quantity: 3	Fisherbrand	14-513-59	Stirs culture
Switch box Quantity: 1	–	–	Turns power on/off to reactor
Syringe, 10 mL Quantity: Multiple	–	–	Optional if you wish to extract culture
Tube adaptor fittings, plastic – Stopcock 1-way Quantity: 6	Masterflex, Cole Palmer	RK-12023-33	Close/open culture vessel line
Tube adaptor fittings, plastic – variety of male and female luer lock fittings Imperial: to fit 1/16" and 1/8" ID tubing Metric: to fit 1.59 mm and 3.18 mm tubing Quantity: Multiple packets	Masterflex, Cole Palmer	RK-30800-16; RK-30800-18; RK-45518-26; RK-45501-00; RK-45501-04	Many different combinations can achieve the same end result, best to order a variety of fittings
Tube adaptor fittings, plastic – variety of straight connectors Imperial: to fit 1/16" and 1/8" ID tubing Metric: to fit 1.59 mm and 3.18 mm tubing Quantity: Multiple packets	Masterflex, Cole Palmer	RK-40616-04	Many different combinations can achieve the same end result, best to order a variety of fittings
Tubing, flexible, transparent Imperial: ID=1/16", OD=1/8" Metric: ID = 1.59 mm, 0D = 3.18 mm Quantity: 4 m	Masterflex, Cole Palmer	RK-06422-02	Line from culture vessel to gas sensor
Tubing, flexible, transparent Imperial: ID=1/8", OD=1/4" Metric: ID = 3.18 mm, 0D = 6.35 mm Quantity: 2 m	Masterflex, Cole Palmer	RK-06422-05	Gas sensor standard tubing size
Tubing, rigid, transparent Imperial: ID=1/16", OD=1/8" Metric: ID = 1.59 mm, 0D = 3.18 mm Quantiy: 1 m	Masterflex, Cole Palmer	RK-06605-27	Spans rubber stopper allowing gas to exit
Tubing, rigid, transparent Imperial: ID=1/8", OD=1/4" Metric: ID = 3.18 mm, 0D = 6.35 mm Quantity: 1 m	Masterflex, Cole Palmer	RK-06605-30	Spans rubber stopper allowing gas to exit
Zip ties, small Quantity: 1 packet			Secure tube fittings