Bestämning av mitokondriell andning och glykolys i ex vivo retinal vävnadsprover

Summary

Beskrivs här är ett detaljerat protokoll för att utföra mitokondriell stress analys och glykolytisk hastighet analys i ex vivo retinal vävnad prover med hjälp av en kommersiell bioanalyzer.

Abstract

Mitokondriell andning är en kritisk energigenererande väg i alla celler, särskilt retinala fotoreceptorer som har en mycket aktiv ämnesomsättning. Dessutom uppvisar fotoreceptorer också hög aerob glykolys som cancerceller. Exakta mätningar av dessa metaboliska aktiviteter kan ge värdefulla insikter om cellulär homeostas under fysiologiska förhållanden och i sjukdomstillstånd. Mikroplatebaserade analyser med hög genomströmning har utvecklats för att mäta mitokondriell andning och olika metaboliska aktiviteter i levande celler. En stor majoritet av dessa är dock utvecklade för odlade celler och har inte optimerats för intakta vävnadsprover och för applikation ex vivo. Beskrivs här är ett detaljerat steg-för-steg-protokoll, med hjälp av mikroplatebaserad fluorescensteknik, för att direkt mäta syreförbrukningshastigheten (OCR) som en indikator på mitokondriell andning, liksom extracellulär försurningsgrad (ECAR) som en indikator på glykolys, i intakt ex vivo retinal vävnad. Denna metod har använts för att framgångsrikt bedöma metaboliska aktiviteter i vuxna mus näthinnan och visa dess tillämpning i att undersöka cellulära mekanismer för åldrande och sjukdom.

Introduction

Mitokondrier är viktiga organeller som reglerar cellulär metabolism, signalering, homeostas och apoptos genom att samordna flera avgörande fysiologiska ^processer1. Mitokondrier fungerar som kraftverk i cellen för att generera adenosintrifosfat (ATP) genom oxidativ fosforylering (OXPHOS) och ge energi som stöder nästan alla cellulära händelser. Majoriteten av cellulärt syre metaboliseras i mitokondrier, där det fungerar som den slutliga elektron acceptor i elektrontransportkedjan (ETC) under aerob andning. Låga mängder ATP kan också produceras från glykolys i cytosolen, där glukos omvandlas till pyruvat, som kan omvandlas ytterligare till laktat eller transporteras till mitokondrier och oxideras till acetyl-CoA, ett substrat i trikarboxylsyracykeln (TCA-cykeln).

Näthinnan är en av de mest metaboliskt aktiva vävnaderna hos ^däggdjur2, som uppvisar höga nivåer av mitokondriell andning och extremt hög ^{syreförbrukning3}. Stången och kon fotoreceptorerna innehåller en hög densitet av mitokondrier4, och OXPHOS genererar de flesta ATP i näthinnan5. Dessutom förlitar sig näthinnan också starkt på aerob glykolys6,7 genom att omvandla glukos till laktat5. Mitokondriella defekter är associerade med olika neurodegenerativa ^sjukdomar8,9; och med sina unika höga energikrav är näthinnan särskilt sårbar för metaboliska defekter, inklusive de som påverkar mitokondriella ^OXPHOS4 och glykolys10. Mitokondriell dysfunktion och defekter i glykolys är inblandade i ^retinal11,12 och ^macular13 degenerativa sjukdomar, åldersrelaterade makuladegeneration10,14,15,16 och diabetiker retinopati17,18. Därför kan noggranna mätningar av mitokondriell andning och glykolys ge viktiga parametrar för att bedöma näthinnans integritet och hälsa.

Mitokondriell andning kan mätas genom bestämning av syreförbrukningshastighet (OCR). Med tanke på att omvandlingen av glukos till pyruvat och därefter till laktat resulterar i extrudering av protoner till och försurning av den extracellulära miljön, ger mätningar av den extracellulära försurningshastigheten (ECAR) en indikation på glykolysflöde. Eftersom näthinnan består av flera celltyper med intima relationer och aktiv synergi, inklusive utbyte av ^substrat6, är det absolut nödvändigt att analysera mitokondriell funktion och metabolism i samband med hela retinal vävnad med intakt laminering och kretsar. Under de senaste decennierna har Clark typ _O2 elektroder och andra syremikroelektroder använts för att mäta syreförbrukning i näthinnan19,20,21. Dessa syreelektroder har stora begränsningar i känslighet, krav på en stor provvolym och behovet av kontinuerlig omrörning av suspenderingsprov, vilket vanligtvis leder till störningar i cellulära och vävnadssammanhang. Protokollet som beskrivs här utvecklades med hjälp av en microplate-baserade, fluorescence teknik för att mäta mitokondriell energi metabolism i nyligen dissekerade ex vivo mus näthinnan vävnad. Det möjliggör mätningar i realtid av både OCR och ECAR samtidigt med hjälp av ett litet prov (1 mm stans) av ex vivo retinal vävnad samtidigt som behovet av suspension och kontinuerlig omrörning undviks.

Visat här är det experimentella förfarandet för mitokondriell stress analys och glykolytisk hastighet analys på nyligen dissekerade retinal stans diskar. Detta protokoll tillåter mätning av mitokondrier-relaterade metaboliska aktiviteter i en ex vivo vävnad sammanhang. Till skillnad från de analyser som utförs med hjälp av odlade celler återspeglar avläsningarna här kombinerad energimetabolism på vävnadsnivå och påverkas av interaktioner mellan de olika celltyperna i vävnaden. Protokollet är modifierat från en tidigare publicerad ^version22,23 för att anpassa sig till den nya generationen av Agilent Seahorse extracellulära flöde 24-brunnar (XFe24) analysator med Islet Capture plate. Analysmediet, koncentrationerna av injektionsföreningar och antalet/varaktigheten av analyscyklerna har också optimerats för näthinnevävnad. Ett detaljerat steg-för-steg-protokoll ges för beredning av näthinnestansskivor. Mer information om programinställningar och dataanalys kan erhållas från tillverkarens användarhandbok24,25,26.

Protocol

Alla musprotokoll godkändes av Animal Care and Use Committee vid National Eye Institute (NEI ASP# 650). Möss inrymdes i 12 timmar ljusmörka förhållanden och vårdades genom att följa rekommendationerna från Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Institute of Laboratory Animal Resources och Folkhälsopolicyn för human vård och användning av laboratoriedjur. 1. Hydrerande sensorpatron och beredning av analysmediet Dagen före experimentet, tillsätt 1 ml kalibrerin…

Representative Results

De data som rapporteras här är representativ mitokondriell stressanalys som visar OCR-spår (figur 1) och glykolytisk hastighetsanalys som visar OCR-spår och ECAR-spår (figur 2), som utfördes med ny dissekerade 1 mm retinal punch-skivor från 4 månader gamla transgena Nrl-L-EGFP-möss36 (C57B/L6 bakgrund). Dessa möss uttrycker GFP specifikt i stångfotoreceptorer utan att ändra normal retinal utveckling, histologi och fys…

Discussion

Här finns detaljerade instruktioner för att utföra mikroplate-baserade analyser av mitokondriell andning och glykolysaktivitet med hjälp av ex vivo, ny dissekerade näthinnestansskivor. Protokollet har optimerats för att: 1) säkerställa användningen av ett lämpligt analysmedium för ex vivo retinal vävnad; 2) använda rätt storlek på näthinnestansskivor för att erhålla OCR- och ECAR-avläsningar som faller inom maskinens optimala detekteringsområde; 3) beläggning av nätinsatser för at…

Materials

1X PBS	Thermo Fisher	14190-144
2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution	Sigma	D6134	Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time
30-gauge needle	BD Precision Glide	305106
Antimycin A, 10 mM stock solution	Sigma	A8674	Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Bam15, 10 mM stock solution	TimTec	ST056388	Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Biopsy puncher, 1 mm	Integra Miltex	33-31AA
Cell-Tak	Corning Life Sciences	CB40240
CO2 asphyxiation chamber
Dissection forceps-Dumont #5	Fine Science Tools	11251-10	Stright tip
Dissection forceps-Dumont #7	Fine Science Tools	11274-20	Curved tip
Dissection microscope
DMSO	Sigma	D2438
Graefe forceps	Fine Science Tools	11051-10	Curved, Serrated tip
Microscissors	Fine Science Tools	15004-08	Curved tip
NaOH solution, 1 M	Sigma-Aldrich	S8263	Aqueous solution, prepare ahead of time
Rotenone, 10 mM stock solution	Sigma	R8875	Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Seahorse calibration medium	Agilent	100840-000
Seahorse XF 1.0 M glucose	Agilent	103577-100
Seahorse XF 100 mM pyruvate	Agilent	103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine	Agilent	103579-100
Seahorse XF DMEM medium	Agilent	103575-100	pH 7.4, with 5 mM HEPES
Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak	Agilent	103518-100	Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate
Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer	Agilent
Sodium bicarbonate solution, 0.1 M	Sigma-Aldrich	S5761	Aqueous solution, prepare ahead of time
Superfine eyelash brush	Ted Pella	113