Summary
Questo protocollo delinea i passaggi per indurre l'uveite micobatterica innescata (PMU) nei topi. Questo metodo delinea i passaggi per aiutare a produrre un'infiammazione oculare affidabile e robusta nel sistema modello murino. Utilizzando questo protocollo, abbiamo generato occhi uveitici e occhi non infiammati da singoli animali per ulteriori valutazioni con saggi immunologici, trascrittomici e proteomici.
Abstract
Il termine "uveite" descrive un insieme eterogeneo di condizioni che presentano tutte infiammazione intraoculare. In generale, l'uveite è definita dall'eziologia: infezione o autoimmunità. L'uveite infettiva richiede un trattamento con gli agenti antimicrobici appropriati, mentre l'uveite autoimmune richiede un trattamento con corticosteroidi o altri agenti immunosoppressori. L'uveite post-infettiva è una forma di uveite cronica che richiede corticosteroidi per controllare la sequela immunitaria dopo l'infezione iniziale. L'uveite associata all'infezione da Mycobacterium tuberculosis (Mtb) è una forma ben nota di uveite post-infettiva, ma i meccanismi della malattia non sono completamente compresi. Per comprendere il ruolo degli antigeni micobatterici e dei ligandi innati nello stimolare l'infiammazione oculare cronica a seguito di infezione da mTB, è stato sviluppato il modello Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) per l'uso nei topi. Questo manoscritto delinea i metodi per generare PMU e monitorare il decorso clinico dell'infiammazione utilizzando l'imaging per il fondo oculare colorato e la tomografia a coerenza ottica (OCT). La PMU è indotta dall'immunizzazione con estratto micobatterico ucciso dal calore seguito dall'iniezione intravitreale dello stesso estratto in un occhio sette giorni dopo. L'infiammazione oculare viene monitorata longitudinalmente utilizzando l'imaging in vivo e seguita dalla raccolta di campioni per un'ampia gamma di saggi, tra cui istologia, citometria a flusso, analisi delle citochine, qPCR o sequenziamento dell'mRNA. Il modello murino di PMU è un nuovo utile strumento per studiare le risposte oculari alla mTB, il meccanismo dell'uveite cronica, e per i test di efficacia preclinica di nuove terapie antinfiammatorie.
Introduction
Il termine "uveite" descrive un insieme eterogeneo di condizioni che presentano tutte infiammazione intraoculare1. I modelli animali di uveite sono importanti per comprendere i meccanismi della malattia e per la sperimentazione preclinica di nuove terapie. Un certo numero di modelli animali di uveite sono stati stabiliti2. I due che sono stati studiati più ampiamente sono l'uveite autoimmune sperimentale (o uveoretinite; EAU) e uveite indotta da endotossine (EIU). L'EAU è tipicamente generata dall'immunizzazione con antigeni oculari o può verificarsi spontaneamente quando la tolleranza centrale viene interrotta in assenza del gene AIRE 3,4. Altre varianti del modello sono state sviluppate 5,6,7 per includere diversi peptidi uveitogenici; Questi sono stati ampiamente esaminati 8,9,10. L'EAU è il modello primario per le forme di uveite autoimmune dipendente dalle cellule T, come la malattia di Vogt-Koyanagi-Harada e la corioretinite da uccelli nell'uomo. L'EIU è generata dall'iniezione sistemica o locale di lipopolisaccaride batterico (LPS)10,11. L'EIU è stata utilizzata come modello di uveite acuta generata dall'attivazione delle vie di segnalazione immunitaria innate12. Entrambi i modelli sono stati strumentali all'attuale comprensione dell'immunologia oculare, ma nessuno dei due è un modello efficace per l'uveite cronica post-infettiva. Recentemente stabilito nei topi, il modello di uveite micobatterica innescata (PMU) fornisce ora un approccio per interrogare e valutare gli aspetti clinici e cellulari di questa forma di uveite13.
C'è un'alta prevalenza di infezione micobatterica in tutto il mondo, con oltre 10 milioni di nuovi casi e più di 1,4 milioni di decessi segnalati dall'Organizzazione Mondiale della Sanità nel 201914. La manifestazione extrapolmonare dell'infezione tubercolare attiva (TB) comprende l'uveite ed è una causa ben nota di uveite infettiva15,16. Le manifestazioni dell'uveite associata alla tubercolosi sono proteiformi, il che probabilmente riflette molteplici meccanismi distinti della malattia per includere l'infezione oculare diretta e l'infiammazione immuno-mediata meno ben compresa17,18,19. I meccanismi proposti per queste sequele post-infettive includono una risposta infiammatoria cronica stimolata dalla persistenza di un'infezione pauci-bacillare nell'epitelio pigmentato retinico (RPE), una risposta infiammatoria cronica stimolata dalla presenza di pattern molecolari residui associati a patogeni (PAMP) da un'infezione oculare eliminata con successo e l'attivazione inappropriata della risposta immunitaria adattativa contro gli antigeni oculari attraverso un processo di mimetismo molecolare o antigene diffusione causata da infezione sistemica da tubercolosi20,21,22,23.
Al fine di ottenere una migliore comprensione meccanicistica dell'uveite cronica post-infettiva e studiare il ruolo degli antigeni micobatterici nell'inizio della malattia, è stato sviluppato il modello PMU per l'uso nei topi13,24. Di conseguenza, per provocare l'infiammazione, il topo riceve prima un'iniezione sottocutanea di antigene dal ceppo Mycobacterium tuberculosis H37Ra ucciso dal calore per imitare l'infezione sistemica, seguita sette giorni dopo dall'iniezione intravitreale dello stesso antigene somministrato all'occhio sinistro o destro per imitare l'infezione oculare locale. L'intensità e la durata dell'uveite conseguente sono monitorate mediante tomografia longitudinale a coerenza ottica in vivo (OCT) e imaging a imbuto dell'occhio25. La PMU è caratterizzata da una panuveite acuta mieloide-dominante che si sviluppa in un'uveite posteriore cronica dominata dalle cellule T con vitrite, infiammazione retinica perivascolare e aree focali di danno retinico esterno26. La presenza di infiammazione granulomatosa nel segmento posteriore dell'occhio suggerisce che il modello PMU può essere utilizzato per studiare alcune forme di uveite anteriore (granulomatosa e non granulomatosa) e intermedia, osservate in pazienti con evidenza immunologica di infezione da Mtb passata27. Inoltre, i componenti della Mtb uccisa termicamente utilizzati nel modello PMU sono stati suggeriti per innescare risposte immunitarie alla base degli aspetti dell'uveite ricorrente nei pazienti con tubercolosi oculare che rispondono alla terapia antitubercolare (ATT)28. A causa delle differenze nell'inizio della malattia e nel decorso infiammatorio rispetto all'EAU e all'EIU, la PMU rappresenta un nuovo modello animale di uveite che non dipende dall'immunizzazione con antigeni oculari e può aiutare a chiarire i meccanismi della malattia nei pazienti con uveite cronica. Questo protocollo delinea i metodi per generare PMU, monitorare il decorso clinico dell'infiammazione e raccogliere campioni oculari per l'analisi post-mortem con citometria a flusso.
Protocol
Tutte le procedure eseguite sono state approvate localmente dall'Animal Care and Use Committee dell'Università di Washington (protocollo di studio sugli animali # 4481-02) o in conformità con la licenza del Ministero degli Interni del Regno Unito (PPL 30/3281) e l'Università di Bristol Ethical Review Group. Gli esperimenti condotti presso entrambe le istituzioni erano concordi con la dichiarazione dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva. La PMU è stata generata in topi C57BL/6J di 6-10 settimane; tutti i topi pesavano almeno 18 g al momento dell'induzione dell'uveite e sono stati confermati negativi per la mutazione RD8 del gene Crb129. I topi sono stati mantenuti con chow standard e acqua medicata (paracetamolo 200-300 mg / kg / die) ad libitum in specifiche condizioni prive di agenti patogeni. L'eutanasia animale è stata eseguita utilizzando un metodo standard di inalazione di anidride carbonica30.
1. Preparazione dell'antigene per iniezione sottocutanea
- Eseguire tutte le procedure descritte in questa sezione all'interno di una cappa aspirante chimica per evitare l'inalazione o il contatto cutaneo con la polvere Mtb H37Ra. Gestisci secondo le tue politiche istituzionali per Complete Freund's Adjuvant (tipicamente BSL-1). Ciò include l'uso di guanti resistenti agli agenti chimici, occhiali di sicurezza e indumenti da lavoro protettivi (camice da laboratorio).
- Utilizzare una buona tecnica sterile per prevenire la contaminazione dei reagenti che verranno introdotti negli animali da esperimento.
- Produrre la sospensione di Mtb in PBS mescolando 5 mg di polvere di M. tuberculosis H37Ra liofilizzata e uccisa dal calore con 2,5 ml di PBS freddo in una provetta da microcentrifuga da 5 ml. Vortice una volta per 30 s e poi posizionare sul ghiaccio.
- Per generare una sospensione fine dell'H37Ra in PBS, sonicare la sospensione sul ghiaccio per 5 minuti.
- Sganciare il corpo dell'unità convertitore e pulire la sonda con un tampone imbevuto di alcool al 70% (v/v).
- Accendere il sonicatore, regolare l'impostazione di potenza su 4 ruotando la manopola di controllo della potenza e immergere la punta della sonda nella polvere micobatterica contenente PBS. Assicurarsi che la punta della sonda sia immersa ad almeno metà della profondità del campione e che la punta della sonda non tocchi la parete del tubo della microcentrifuga.
- Sonicare la miscela sul ghiaccio per 30 secondi, mettere in pausa 30 s e ripetere per un totale di 5 minuti per disperdere completamente la polvere in una sospensione uniforme senza riscaldare il liquido.
- Aggiungere 2,5 ml di Incomplete Adjuvant di Freund alla miscela e ripetere il processo di sonicazione sul ghiaccio fino a quando l'emulsione forma una consistenza simile al dentifricio.
- Impostare l'alimentazione su 0 utilizzando la manopola di controllo e spegnere l'unità per terminare la sonicazione. Rimuovere la punta dalla sospensione e pulire la sonda con un tampone imbevuto di alcool.
- Conservare l'emulsione antigenica a 4 °C. La produzione di lotti dell'emulsione contribuirà a garantire la coerenza tra gli esperimenti. L'emulsione può essere conservata a 4 °C per un massimo di 3 mesi.
2. Iniezione sottocutanea
- Eseguire l'iniezione sottocutanea una settimana prima dell'iniezione intravitreale (designata come giorno -7).
- Caricare una siringa da 1 mL (senza ago collegato) con l'emulsione micobatterica. A causa della viscosità e dell'opacità dell'emulsione, bolle d'aria difficili da vedere possono riempire la siringa.
- Per evitare la formazione di bolle d'aria nella siringa, dopo aver caricato 0,2-0,3 ml di emulsione, capovolgere la siringa (punta rivolta verso l'alto) e picchiettare delicatamente la siringa ripetutamente sul bordo di un contatore per portare le bolle in superficie.
- Espellere l'aria dalla siringa e continuare a riempirla. Capovolgere e picchiettare a intermittenza fino a riempimento.
- Posizionare un ago da 25 G sulla siringa e far avanzare l'emulsione per riempire l'ago. Conservare la siringa sul ghiaccio fino all'uso.
- Per eseguire l'iniezione sottocutanea in modo sicuro, anestetizzare il topo o utilizzare metodi di contenzione umana che consentano un facile accesso ai quarti posteriori dell'animale31.
- Per anestetizzare per iniezione sottocutanea, posizionare l'animale in una camera di induzione dell'isoflurano (3% -4% per l'induzione e 1% -3% per il mantenimento). Una volta anestetizzato, assicurarsi che il topo abbia una frequenza respiratoria lenta e non mostri segni di difficoltà respiratoria.
- Posizionare le iniezioni sottocutanee sulla superficie dorsale dei fianchi o sulla superficie ventrale delle gambe prossimali alla regione dei linfonodi inguinali.
- Inserire con cautela l'ago per evitare l'iniezione nel muscolo. Iniettare 0,05 mL di emulsione Mtb nello spazio sottocutaneo. Non rimuova immediatamente l'ago per consentire la completa iniezione dell'emulsione densa.
- Ripetere l'iniezione su entrambi i lati sinistro e destro per un totale di 0,1 mL per animale.
- Se anestetizzata, posizionare il mouse su una piastra riscaldante calda fino al completo recupero. Non lasciare il topo incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la reclinazione sternale.
- Riportare il topo nella sua gabbia al completo recupero ed etichettare la scheda della gabbia con la data dell'iniezione sottocutanea.
- Fornire analgesia con paracetamolo orale (200 mg / kg / die), ma non FANS come agenti anti-infiammatori possono influenzare l'induzione di uveite.
3. Preparazione dello stock di antigene per iniezione intravitreale
- Eseguire tutte le procedure descritte in questa sezione in condizioni sterili appropriate per prevenire la contaminazione della sospensione intravitreale di Mtb.
- Effettuare le sospensioni intravitreali.
- Per l'induzione di panuveite da lieve a moderata, effettuare la sospensione intravitreale ad una concentrazione di 5 mg / ml aggiungendo 5 mg di estratto di micobatteri a 1 ml di 1x PBS.
- Per l'induzione di panuveite da moderata a grave, effettuare la sospensione intravitreale ad una concentrazione di 10 mg / ml aggiungendo 10 mg di estratto di micobatteri a 1 ml di 1x PBS.
- Vortice una volta per 30 s e poi posizionare sul ghiaccio.
- Per generare una sospensione fine dell'H37Ra in PBS, sonicare la sospensione sul ghiaccio per 10 minuti come descritto nel passaggio 1.4. Aliquotare questa soluzione madre in volumi da 100 μL e conservare a -20 °C.
- Prima dell'uso, scongelare a temperatura ambiente e vortice in alto per 1 minuto. Conservare le aliquote sul ghiaccio durante il trasporto alla struttura per animali.
4. Procedura di iniezione intravitreale il giorno 0
- Preparazione degli animali
- Indossare guanti da visita aderenti, posizionare il mouse su una bilancia per ottenere il suo peso in grammi.
- Somministrare un'iniezione intraperitoneale di 0,02 ml/g di peso corporeo di una soluzione contenente 100 mg/ml di ketamina e 20 mg/ml di xilazina miscelati con acqua sterile per anestetizzare l'animale. Un approccio alternativo include l'induzione utilizzando ~ 1,5% di isoflurano (inalato).
- Attendere circa 2 minuti affinché il mouse si addormenti, quindi posizionare il mouse in una scatola di riscaldamento e coprire il coperchio. Eseguire test di riflesso del dolore come orecchio, punta e pizzico della coda per valutare la profondità dell'anestesia per la procedura32.
- Una volta addormentato, anestetizzare la cornea con 1 goccia di tetracaina allo 0,5% (v/v). Evitare di ottenere tetracaina vicino al naso o alla bocca del topo. Dopo 10 secondi, tamponare il liquido in eccesso.
NOTA: È stato osservato che la dilatazione dell'iride e la visualizzazione della camera anteriore (AC) sono migliorate quando viene somministrata l'anestesia topica, probabilmente a causa di una migliore soppressione del riflesso corneale con l'anestesia sistemica e topica combinata. Tuttavia, questo passaggio potrebbe essere omesso se lo si desidera. - Dilatare la pupilla con 1 goccia di fenilefrina al 2,5% (v/v). Prestare attenzione per evitare eventuali goccioline in eccesso che potrebbero entrare nel naso o nella bocca. Dopo 2-3 minuti, tamponare il liquido in eccesso.
- Per ridurre il rischio di endoftalmite, aggiungere 1 goccia di betadine al 5% sulla superficie dell'occhio e sui capelli circostanti. Lasciare agire per 2-3 min.
NOTA: eseguire tutte le procedure descritte in questa sezione in condizioni sterili appropriate per prevenire l'endoftalmite. - Rimuovere il betadine e coprire l'occhio con ipromellosa (0,3%) o carbomer eye gel 0,2% p/p) per prevenire la secchezza sotto anestesia. Questo aiuterà anche a prevenire la formazione di cataratta.
- Configurazione del sistema di microiniezione
- Eseguire l'iniezione intravitreale utilizzando una micropompa collegata a un controller della pompa della microsiringa e una siringa per iniezione (Figura 1A-C). In alternativa, iniettare con un ago da 33 G collegato a una siringa di Hamilton come descritto nel paragrafo 4.4.
- Collegare un ago da 34 G al supporto per iniezione per assemblare l'iniettore. Allentare il tappo a vite argentato all'estremità anteriore del supporto per iniezione e far scorrere l'ago nel corpo del supporto circa a metà strada. Stringere saldamente il dito del tappo a vite d'argento.
- Collegare il tubo al supporto dell'iniezione come indicato nei punti 4.2.4-4.2.5.
- Per inserire il tubo sul supporto dell'iniezione, allentare la vite di plastica sull'estremità posteriore del supporto, far scorrere il tubo attraverso la guarnizione all'interno e serrare la vite.
- Mantenere un leggero spazio con l'estremità del tubo per evitare danni al tubo durante l'iniezione. Fare riferimento alla Figura 1C.
- Scongelare un'aliquota di 100 μL della sospensione madre di micobatterio.
- Aggiungere 3 μL di una soluzione di fluoresceina sodica (AK-Fluor) all'1% e vortice bene.
- Caricare una siringa da 10 μL con la miscela di antigene e fluoresceina senza includere bolle d'aria.
- Rimuovere l'ago di carico dalla siringa e far scorrere il tubo attraverso la guarnizione del tappo a vite argentato fino a quando la punta raggiunge il segno zero nel corpo della siringa.
- Una volta che la punta del tubo è correttamente allineata alla posizione desiderata, stringere saldamente il dito del tappo a vite.
- Lavare la soluzione nella siringa attraverso il tubo di iniezione per caricare completamente il sistema. Quindi ripetere i passaggi 4.2.8-4.2.11 per ricaricare la siringa per l'iniezione.
- Per installare la siringa caricata sulla micropompa, premere il pulsante di rilascio del morsetto all'estremità della micropompa per aprire i morsetti della siringa.
- Posizionare il tappo dello stantuffo nel supporto del tappo dello stantuffo all'estremità posteriore della micropompa.
- Quindi far scorrere il collare della siringa sul collare e il corpo della siringa nel morsetto della siringa.
- Rilasciare il pulsante del morsetto e serrare la vite di fissaggio dello stantuffo. Fare riferimento alla Figura 1D.
- Far scorrere il supporto per iniezione e l'ago attraverso l'o-clamp sull'apparecchio di iniezione stereotassico. Questa è una piattaforma personalizzata; In alternativa, la siringa può essere tenuta e posizionata manualmente.
- Impostare il volume di infusione e la velocità del volume di infusione sul controller della pompa della microsiringa per iniettare 500 nL per ciclo ad una velocità di 40 nL/s, rispettivamente.
NOTA: È possibile utilizzare velocità di iniezione più elevate, tuttavia, è possibile che si verifichi un maggiore reflusso prima di ottenere il riposizionamento dell'ago. - Testare il sistema per garantire il corretto funzionamento prima di eseguire un'iniezione intravitreale.
NOTA: Quando il sistema di iniezione funziona correttamente, l'attivazione di un ciclo di iniezione utilizzando il pedale o il pad di controllo produrrà un movimento visibile del supporto del tappo dello stantuffo e una piccola goccia di liquido verdastro sarà visibile sulla punta dell'ago. Nel caso in cui non venga prodotto liquido, attivare cicli aggiuntivi o lavare e ricaricare la siringa. - Prima di iniettare l'occhio, pulire delicatamente l'ago con un tampone di etanolo al 95%.
- Procedura di iniezione intravitreale
- Il mouse viene posizionato su un apparecchio stereotassico per eseguire la procedura di iniezione.
- Mantenere caldo il palco/pedana su cui poggia il mouse attaccando 2-3 tovaglioli di carta sulla sua superficie.
- Posizionare il mouse in posizione prona sulla piattaforma. Usa le barre auricolari destra e sinistra per fissare delicatamente la testa dell'animale. Fare riferimento alla Figura 1E.
- Posizionare il mouse e orientarlo sotto l'oscilloscopio in modo che sia visibile l'aspetto nasale superiore dell'occhio destro.
- Utilizzare un ago da 30 G per spostare le ciglia ed esporre la sclera. Visualizza il limbus e il vaso sanguigno radiale.
- Utilizzare un ago sterile da 30 G per praticare un foro guida nella sclera posteriore di 1-2 mm al limbus.
- Inserire l'ago da 34 G attaccato al supporto per iniezione nell'occhio attraverso il foro guida con un angolo che eviti la lente, ma posizionare la punta dell'ago nella cavità vitreale.
- Utilizzando il controller della pompa a microsiringa, iniettare con cautela 1 μL di estratto di Mtb nella cavità vitreale. In caso di reflusso costante, aumentare il volume di iniezione a 1,5 μL per garantire un'adeguata erogazione della dose.
NOTA: Per controlli fittizi, iniettare 1 μL di PBS nell'occhio dell'animale. - Verificare il posizionamento intravitreale mediante la visualizzazione di un riflesso verdastro nell'occhio. Fare riferimento alla Figura 1F.
- Dopo 10 secondi, ritirare l'ago dall'occhio. Notare qualsiasi reflusso.
- Rimuovere il mouse dalla piattaforma, posizionare lo 0,3% di ipromellosa o lo 0,2% con carbomer unguento per gli occhi su entrambi gli occhi per la protezione corneale e passare alla scatola di riscaldamento di recupero.
- Non lasciare il topo incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la reclinazione sternale. Non tornare in compagnia di altri animali fino a quando non si sono completamente ripresi.
- Quando il topo è completamente sveglio, tornare nella gabbia e aggiungere la bottiglia d'acqua medicata con paracetamolo (200-300 mg / kg / die). Etichettare la scheda della gabbia con la data dell'iniezione IVT.
- Le iniezioni intravitreali sono generalmente ben tollerate. I segni clinici che possono indicare dolore e la necessità di rimozione dallo studio includono alopecia perioculare (indicativa di autotrauma), ulcerazione corneale, perdita di peso e postura curva.
- Metodo alternativo per l'iniezione intravitreale
NOTA: Questa procedura viene eseguita utilizzando un microscopio operatorio e un ago da 33 G su una microsiringa.- Proptose l'occhio e tienilo in posizione con un paio di pinze.
- Quindi applicare carbomer eye gel 0,2% p/p o 0,3% ipromellosa gel occhi e posizionare un coprislip circolare (7 mm di diametro) sopra l'occhio.
- Montare un ago ipodermico da 33 G su una siringa di Hamilton da 5 μL e inserirlo a circa 2 mm di circonferenza al limbus corneale con un angolo di iniezione di ~45°.
- Guidare la smussatura dell'ago nel vitreo, fermandosi tra la lente e il disco ottico (dal punto di vista relativo del chirurgo, questo è sopra / copre il disco ottico - circa 1,5 mm dal sito di inserimento) e iniettare lentamente 2 μL di Mtb (a 2,5 ug / μL in PBS).
- Tenere brevemente l'ago in posizione (per ridurre la quantità di reflusso dell'iniettazione) e quindi rimuoverlo.
- Dopo l'iniezione, riposizionare il globo rilasciando la pinza. Una goccia dell'1% p/p di unguento cloramfenicolo può essere somministrata all'occhio in questo momento per fornire ulteriore protezione dall'endoftalmite post-iniezione.
- Dopo l'iniezione, passare alla scatola di riscaldamento di recupero come indicato nei passaggi 4.3.11-4.3.13.
5. Imaging OCT per rilevare e quantificare l'uveite
- Preparazione degli animali
- Anestetizzare il mouse come descritto nei passaggi 4.1.2-4.1.4
- Dilatare la pupilla con 1 goccia di fenilefrina al 2,5%. Prestare attenzione per evitare eventuali goccioline in eccesso che potrebbero entrare nel naso o nella bocca. Dopo 2-3 minuti, tamponare il liquido in eccesso.
- Posizionare lo 0,3% di ipromellosa o lo 0,2% p/p di gel carbomer sull'occhio per prevenire la secchezza durante l'anestesia. Ciò contribuirà anche a prevenire la formazione di cataratta.
- Avvolgere il mouse in uno strato di garza chirurgica per mantenere il calore del corpo e posizionarlo sulla cassetta animale. Posiziona la testa con la barra del morso.
- Acquisire le immagini OCT delle camere anteriore e posteriore.
NOTA: se si ottengono immagini della camera anteriore e posteriore, ottenere prima le immagini della camera posteriore (PC) per prevenire la degradazione dell'immagine dopo la formazione della cataratta. La formazione di cataratta può essere prevenuta con una lubrificazione frequente e applicando lo 0,3% di ipromellosa o lo 0,2% p/p di gel per gli occhi carbomer. Per immagini estese (>10 min), aiuta anche mantenere il mouse caldo (attraverso l'uso di un termoforo).- Dopo aver acceso il sistema di imaging OCT, fissare l'obiettivo di imaging corretto e regolare la posizione del braccio di riferimento in base alle esigenze.
- Aprire il software di creazione di immagini, creare l'ID univoco del mouse e iniziare a creare immagini in base al protocollo del produttore dello Strumento di personalizzazione di Office.
- Utilizzando l'opzione Free Run con il protocollo di scansione rapida, posizionare l'occhio con il nervo ottico centrato sulle immagini della camera posteriore o l'apice della cornea sulle immagini della camera anteriore.
NOTA: la tabella 1 contiene i parametri del protocollo di imaging per due sistemi di imaging di piccoli animali disponibili in commercio. Fare riferimento alla tabella dei materiali per le specifiche del prodotto. - Per l'imaging della camera posteriore, avvicinare l'OCT alla superficie dell'occhio. Prestare attenzione per evitare di portare la superficie della lente a contatto con l'occhio.
- Una volta posizionato correttamente l'occhio, interrompere la scansione veloce e selezionare il protocollo di scansione del volume e attivare la scansione con l'opzione Mira.
- Per le immagini del segmento posteriore, regolare fino a quando il nervo ottico non è centrato nell'immagine di allineamento orizzontale B-Scan e la retina è allineata con l'asse di allineamento verticale
- Per le immagini del segmento anteriore, regolare la posizione per centrare l'apice della cornea sia nell'immagine di allineamento orizzontale B-Scan che nell'immagine di allineamento B-Scan di allineamento verticale. La presenza di un artefatto di riflessione in entrambe le immagini confermerà il corretto allineamento. Quindi spostate l'immagine orizzontale abbastanza da rimuovere l'artefatto riflesso. Fare riferimento alla Figura 2.
- Fare clic su Snapshot per acquisire l'immagine di scansione del volume, quindi fare clic su Salva.
- Quindi, ottenere la scansione della linea centrale media. Aprire il protocollo di scansione e fare clic su Aim seguito da Snapshot. Fare clic con il pulsante destro del mouse sullo stesso pannello e quindi fare clic su Media.
- Ripetere i passaggi 5.2.1-5.2.9 per ciascun occhio con entrambe le lenti.
- Dopo aver raccolto tutte le immagini, rimuovere il mouse dalla cassetta e fornire protezione corneale durante il recupero come elencato nei passaggi 4.3.11-4.3.13.
6. Punteggio dell'infiammazione da parte dell'OCT
- Segna le immagini OCT con l'aiuto di selezionatori mascherati per la condizione di trattamento.
NOTA: per le PMU nel modello murino, si consiglia il sistema di punteggio fornito nella Tabella 2 . - Se sono state ottenute sia immagini della camera anteriore (AC) che della camera posteriore (PC), combinare questi punteggi per ottenere il punteggio finale per ciascun occhio.
NOTA: L'infiammazione della camera anteriore si risolve prima dell'infiammazione della camera posteriore.
7. Segnare l'infiammazione mediante istologia post-mortem
- Alla fine dell'esperimento, raccogliere i singoli occhi mediante enucleazione, fissare formaldeide al 4% durante la notte e procedere per l'incorporazione di paraffina, il sezionamento e la colorazione H & E33.
NOTA: Si raccomandano sezioni multiple di 4-8 μm lungo l'asse del nervo ottico pupillare.
NOTA: Tre sezioni per occhio sono valutate da un selezionatore mascherato utilizzando il sistema di punteggio fornito nella Tabella 3 e il punteggio medio delle tre sezioni è riportato come punteggio finale di infiammazione istologica.
Representative Results
Questo protocollo dimostra l'induzione dell'uveite nei topi utilizzando il modello di uveite micobatterica innescato (PMU). Garantire la coerenza nell'iniezione sottocutanea e l'accuratezza dell'iniezione intravitreale sono passaggi chiave nello sviluppo del modello di uveite micobatterica innescata (PMU). La Figura 1 mostra la procedura di iniezione intravitreale del topo utilizzando un apparato stereotassico. Le barre auricolari aiutano a posizionare delicatamente la testa nella stessa posizione al microscopio (Figura 1E). Mantengono anche la testa stabile durante la procedura di iniezione intravitreale, che riduce il rischio di trauma da iniezione. Dopo un'iniezione riuscita, la fluoresceina nella soluzione iniettabile produce un riflesso verdastro dall'interno dell'occhio che può essere visto al microscopio o da una vista laterale come illustrato nella Figura 1F.
Se eseguito come delineato, il protocollo genera una robusta uveite acuta che può essere rilevata utilizzando l'imaging OCT e del fondo oculare già 10 ore dopo l'iniezione intravitreale. La figura 2 illustra il corretto allineamento dell'occhio per l'imaging dello Strumento di personalizzazione dei PC. Nella tabella 1A sono elencati i parametri utilizzati nel protocollo dello Strumento di personalizzazione di Office. Un approccio sistematico per ottenere immagini fornirà immagini di alta qualità che possono essere confrontate nel tempo. Le immagini della camera anteriore sono centrate sull'apice della cornea utilizzando l'immagine SLO en face (Figura 2A) con l'iride allineata in parallelo ai piani orizzontale e verticale (Figura 2B,C). Le scansioni di volume e linee vengono acquisite con un allineamento verticale tale che le regioni inferiori e superiori possano essere visualizzate contemporaneamente. Le immagini del segmento posteriore sono centrate sul nervo ottico utilizzando l'immagine SLO en face (Figura 2D) e la banda luminosa dell'RPE viene utilizzata per allineare la retina in parallelo ai piani orizzontale e verticale (Figura 2E, F).
La Figura 3 mostra i risultati tipici dell'infiammazione oculare PMU utilizzando l'imaging OCT. Ventiquattro ore dopo l'iniezione intravitreale, le cellule infiammatorie sono osservate nell'acquoso e nel vitreo (Figura 3B). In presenza di infiammazione moderata o grave, un ipopione sarà visto nell'angolo inferiore nell'AC. Il grado di infiammazione oculare può essere valutato su queste immagini OCT utilizzando i criteri elencati nella Tabella 2. Esempi rappresentativi di immagini che dimostrano le caratteristiche infiammatorie tipiche di ciascun punteggio sono mostrati nella Figura 4. I punteggi delle camere AC e PC possono essere sommati per generare il punteggio OCT combinato. I punteggi combinati >0 ma ≤2,5 rappresentano una lieve infiammazione. L'infiammazione moderata è determinata dai punteggi >2,5 ma ≤4,5. I punteggi >4,5 identificano l'infiammazione grave. L'infiammazione raggiunge tipicamente il picco 48 ore dopo l'iniezione intravitreale con punteggi OCT nell'AC e nella PC tra 1 e 3 (punteggi combinati tra 2 e 6). I punteggi AC e PC di 0,5 o 4 sono meno comuni. Nel caso in cui si incontrino frequentemente punteggi al di fuori dell'intervallo tipico, potrebbe essere necessaria la risoluzione dei problemi per identificare i fattori che contribuiscono ai punteggi anomali (vedere la sezione di discussione). I punteggi di infiammazione nella camera anteriore tendono a tornare a zero entro una settimana dopo l'iniezione intravitreale. Al contrario, i punteggi posteriori non tornano a zero; Invece, l'infiammazione cronica di basso livello persiste sotto forma di vitrite e i linfociti perivascolari si infiltrano nella retina per 1-2 mesi dopo l'iniezione intravitreale.
Il punteggio di infiammazione nella PMU può anche essere determinato utilizzando l'istologia. La figura 5 mostra sezioni rappresentative di H&E da utilizzare per valutare la gravità della PMU mediante istologia. Il numero di cellule infiammatorie nell'acqua e nel vitreo viene conteggiato e utilizzato per determinare la gravità utilizzando i criteri di punteggio elencati nella Tabella 3. L'infiltrazione di cellule infiammatorie del corpo ciliare è comunemente vista su un lato della sezione istologica (coinvolgimento unilaterale) nell'infiammazione lieve o moderata. Quando l'infiammazione è grave, ciò si riflette nella presenza di un infiltrato di cellule infiammatorie nel corpo ciliare su entrambi i lati della lente (definito coinvolgimento bilaterale). Durante i punti temporali successivi all'iniezione intravitreale, possono anche essere identificate manifestazioni infiammatorie croniche, tra cui la presenza di leucociti perivascolari e intraretinici e pieghe retiniche esterne. L'istologia può anche essere utile per identificare gli occhi colpiti da tecniche di iniezione scadenti. Il trauma al cristallino durante l'iniezione intravitreale può essere identificato dalla presenza di proteine della lente amorfa colorate con eosina (rosa) al di fuori della capsula del cristallino adiacente all'area del trauma. Il reflusso della mTB intravitreale nello spazio subcongiuntivale genererà infiammazione al di fuori dell'occhio che può essere identificata da un'attenta revisione delle strutture perioculari presenti sulle sezioni. A causa della mancata conservazione dell'estratto di mTB all'interno degli occhi, questi occhi avranno in genere bassi punteggi OCT di infiammazione.
L'imaging del fondo oculare in campo luminoso può anche essere utilizzato per identificare aspetti clinicamente rilevanti della PMU, tra cui lo sviluppo di un ipopioni, la vitrite e l'infiltrazione di cellule infiammatorie retiniche o perivascolari. La figura 6 mostra due esempi in cui l'infiammazione retinica e perivascolare può essere vista sulle immagini del fondo oculare. Questi due occhi mostrano anche la gamma di infiammazione che è comune nel modello PMU. La tabella 1B elenca i parametri utilizzati nel sistema di imaging OCT del fondo oculare/retinico. Si noti l'impatto che l'infiammazione grave ha sulla qualità dell'immagine (Figura 6, giorno 2, immagini OCT e fondo oculare nella riga superiore) e l'estensione della malattia presente al giorno 21. L'edema corneale può anche ridurre la qualità dell'immagine durante l'infiammazione acuta; Tuttavia, è raro che l'edema corneale sia grave da sola infiammazione. Più comunemente, la qualità dell'immagine sarà degradata da danni epiteliali derivanti da una protezione superficiale incompleta durante gli eventi di imaging e anestesia.
Il modello PMU può essere utilizzato per indurre uveite in qualsiasi razza di topo o genotipo. Negli occhi albini, l'OCT può ancora essere utilizzato per valutare l'infiammazione, ma l'assenza di pigmento del fondo oculare rende difficile la visualizzazione dell'infiammazione mediante imaging in campo chiaro13,34. Gli studi post mortem possono essere eseguiti sui tessuti oculari, sui linfonodi regionali o sulla milza. Alcuni esempi includono saggi per la presenza di cellule immunitarie come citometria a flusso e immunoistochimica e misurazione delle citochine infiammatorie. In tutti i punti temporali testati dopo l'inizio dell'infiammazione con PMU (dal giorno 1 al giorno 56), ci sono sufficienti cellule infiammatorie CD45+ presenti nei singoli occhi per rilevare molte delle principali popolazioni di leucociti nell'occhio mediante analisi del flusso multiparametrico12,35. Gli umori acquosi (2-5 μL) e vitreali (5-10 μL) possono essere raccolti da occhi infiammati per la determinazione della concentrazione proteica, studi proteomici o determinazione della concentrazione di citochine36.
Figura 1: Impostazione dell'iniezione intravitreale nel topo. L'iniezione intravitreale viene eseguita sull'occhio del topo utilizzando (A) un controller della pompa microsiringa collegato alla (B) micropompa e (C) una siringa per iniezione. La siringa viene caricata e montata sulla micropompa (D). La testa del mouse viene posizionata utilizzando barre auricolari (E) per garantire stabilità e coerenza durante la procedura di iniezione intravitreale. (F) La fluoresceina nella soluzione iniettabile produce un riflesso verdastro dall'interno dell'occhio dopo una procedura riuscita. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Corretto allineamento dell'occhio per l'imaging OCT. (A) Utilizzando l'immagine dell'oftalmoscopio laser a scansione frontale (SLO), l'occhio è centrato per l'imaging della camera anteriore. La linea verde indica la posizione della scansione a linee orizzontali mostrata nel pannello (B). Si noti che la cornea centrale viene evitata per diminuire l'artefatto di riflessione. (C) B-Scan verticale attraverso la camera anteriore paracentrale. Questa scansione è ottenuta a 90° dalla scansione orizzontale. Si noti che l'allineamento delle sezioni del diaframma su ciascun lato dell'obiettivo è livellato nella scansione orizzontale (pannello B) e disposto uno sopra l'altro nella scansione verticale (pannello C). (D) Utilizzando l'immagine SLO, l'immagine della camera posteriore è centrata sul nervo ottico. (e) allineamento orizzontale B-scan, (f) allineamento verticale B-scan. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: L'induzione della PMU genera panuveite che può essere monitorata mediante imaging OCT longitudinale. La riga superiore mostra la camera anteriore (AC); la riga inferiore mostra le immagini OCT della camera posteriore (PC) per evidenziare i cambiamenti patologici nel decorso della malattia. (A) Immagine OCT basale dell'AC (in alto) e del PC (in basso) prima dell'induzione dell'uveite, entrambi con punteggio 0. (B) Giorno 1 dopo iniezione intravitreale che mostra la presenza di edema corneale (freccia nera), un ipopione (*) cellule infiammatorie multiple fluttuanti nell'AC (frecce bianche) e vitrite (punte di freccia bianca) nel PC. (C) Giorno 7 dopo iniezione intravitreale con poche cellule AC sulla capsula anteriore del cristallino (freccia bianca) e diminuzione della vitrite (punta di freccia bianca). (D) Giorno 28 dopo iniezione intravitreale nella camera anteriore con infiammazione AC risolta e lieve vitrite. Abbreviazioni: C- cornea, L - lente, I - iride, Aq - acquoso, V vitreo, RGC - cellule gangliari retiniche, PR - fotorecettori, Ch- coroide. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Esempi di punteggio dello Strumento di personalizzazione di Office. Un punteggio dello Strumento di personalizzazione di Office compreso tra 0 e 4 viene assegnato a ciascuna immagine AC e immagine PC utilizzando il sistema categoriale illustrato nella tabella 2. I punteggi AC e PC vengono combinati per il punteggio OCT finale per l'occhio. (A,D) Esempi di punteggio pari a zero. (B,E) Esempi di un punteggio di 0,5. (C,F) Esempi di un punteggio di 1. (G,J) Esempi di un punteggio di 2. (H,K) Esempi di un punteggio di 3. (I,L) Esempi di un punteggio di 4 sono mostrati nei pannelli I e L. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Esempi di punteggio istologico. Il punteggio istologico è determinato in base a cinque caratteristiche visibili nelle sezioni H & E: densità proteica della camera anteriore, numero di cellule della camera anteriore, infiltrazione delle cellule immunitarie del corpo ciliare, densità delle cellule vitreali, infiammazione vascolare retinica e cambiamenti strutturali della retina. Per ogni caratteristica viene assegnato un punteggio di 0-2. La descrizione di ciascun punteggio si trova nella tabella 3. In questa figura è mostrato un punteggio di esempio rappresentativo di 0-2 per ciascuna caratteristica. La colonna di sinistra mostra il punteggio pari a zero. La colonna centrale mostra esempi di punteggio 1. La colonna di destra mostra esempi di punteggio 2. Un punteggio di 2 per il punteggio del corpo ciliare viene assegnato se il corpo ciliare su entrambi i lati della lente nella stessa sezione dimostra infiammazione cellulare. Il punteggio istologico finale è la somma del punteggio per ciascuno dei cinque criteri (punteggio massimo 10). La freccia nel pannello in basso a destra indica i leucociti perivascolari associati a un vaso retinico superficiale. La barra della scala nera indica 500 μm. Le barre della scala ciliare indicano 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: L'imaging longitudinale del fondo oculare nella PMU ha identificato una serie di gravità della malattia . (A) Gli occhi gravemente infiammati mostrano molteplici infiltrati bianchi nella retina e tortuosità vascolare sull'imaging del fondo oculare a colori (fila superiore), nonché vitrite densa ed edema retinico su OCT (fila inferiore) il giorno 2. La progressione del numero di lesioni retiniche può essere osservata nel tempo mentre la vitrite migliora. La linea verde indica la posizione dell'immagine dello Strumento di personalizzazione di Office. (B) Gli occhi lievemente infiammati mostrano un minor numero di lesioni lineari più discrete nel fondo oculare e un numero di cellule infiltranti nello spazio vitreo. Barra di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Un | |||
| Camera anteriore del mouse | Scansione rapida | Scansione del volume | Scansione lineare |
| Lunghezza x Larghezza | 4,0 mm x 4,0 mm | 3,6 mm x 3,6 mm | 3,6 mm |
| Angolo | 0 | 90 | 90 |
| A-scan/B-Scan | 800 | 1000 | 1000 |
| # B-scansioni | 50 | 400 | 1 |
| Fotogrammi/ B-scan | 1 | 3 | 20 |
| Camera posteriore del mouse | Scansione rapida | Scansione del volume | Scansione lineare |
| Lunghezza x Larghezza | 1,6 mm x 1,6 mm | 1,6 mm x 1,6 mm | 1,6 mm |
| Angolo | 0 | 0 | 0 |
| A-scan/B-Scan | 800 | 1000 | 1000 |
| # B-scansioni | 50 | 200 | 1 |
| Fotogrammi/ B-scan | 1 | 3 | 20 |
| B | |||
| Camera posteriore del mouse | Scansione del volume | Scansione lineare | |
| Lunghezza x Larghezza | 0,9 mm x 0,9 mm | 1,8 mm | |
| Angolo | 0 | Qualsiasi (in genere 0 o 90) | |
| A-scan/B-Scan | 1024 | 1024 | |
| # B-scansioni | 512 | 1 | |
| Fotogrammi/ B-scan | 1 | 30 |
Tabella 1: Parametri di scansione. (A) Parametri di scansione dello Strumento di personalizzazione di Office. (B) Parametri di scansione OCT del fondo oculare/retinico
| Descrizioni dei punteggi dello Strumento di personalizzazione di Office | ||||||
| Punteggio | Camera anteriore | Camera posteriore | ||||
| NA | Nessuna vista oltre la cornea anteriore | Nessuna vista del segmento posteriore | ||||
| 0 | Nessuna infiammazione | Nessuna infiammazione | ||||
| 0.5 | 1-5 cellule nell'acquosità | Poche cellule occupano meno del 10% dell'area vitreale | ||||
| O edema corneale | Nessun infiltrato sottoretinico o intraretinico o interruzione dell'architettura retinica | |||||
| 1 | 6-20 cellule nell'acquosità | Cellule diffuse (senza grumi densi) che occupano tra il 10 e il 50% dell'area vitreale. | ||||
| O un singolo strato di cellule sulla capsula anteriore del cristallino | Nessun infiltrato sottoretinico o intraretinico o interruzione dell'architettura retinica | |||||
| 2 | 20-100 cellule nell'acquosità | Cellule diffuse (senza grumi densi) che occupano > 50% dell'area vitreale | ||||
| O meno di 20 cellule e un ipopione presente | Nessun infiltrato sottoretinico o intraretinico o interruzione dell'architettura retinica | |||||
| 3 | 20-100 cellule nell'acquosità | Cellule diffuse pari ai gradi 2 e 1 | ||||
| E un ipopione O una membrana pupillare | E almeno un'opacità vitreale densa che occupi il 10%-20% dell'area vitreale O la presenza di cellule vitreali pari al grado 2 e rare (≤ 2) opacità sottoretiniche o ntraretiniche | |||||
| 4 | Qualsiasi numero di celle acquose | Opacità vitreale densa che occupa > il 20% dell'area vitreale. | ||||
| E un grande ipopione e membrana pupillare O perdita della struttura anteriore a causa di grave infiammazione | OPPURE cellule vitreali diffuse con grandi opacità sottoretiniche o intraretiniche | |||||
Tabella 2: Criteri di punteggio dei PTOM PMU: Le immagini dello Strumento di personalizzazione di Office vengono valutate in base ai criteri elencati nella tabella. I punteggi AC e PC vengono aggiunti per ottenere il punteggio finale dell'occhio. Nei casi in cui non è stata acquisita una visione chiara dell'occhio, è stato assegnato un punteggio di NA alle immagini e queste sono state escluse dallo studio.
| Descrizione del punteggio istologico | |||
| Caratteristico | 0 | 1 | 2 |
| Proteina della camera anteriore (AC) | Scarse particelle acellulari che si colorano con eosina nell'AC | Colorazione extracellulare moderata, ma non confluente, dell'eosina ovunque nell'AC | Colorazione extracellulare confluente o quasi confluente dell'eosina in tutto l'AC |
| Cella della camera anteriore (AC) | Nessuna cella | 1-100 cellule, ma nessuna aggregazione densa di cellule | >100 cellule, o dense aggregazioni di cellule |
| Infiammazione del corpo ciliare | Nessuna infiltrazione leucocitaria del corpo ciliare o del vitreo circostante | Presenza unilaterale di leucociti infiltranti il corpo ciliare e/o il vitreo circostante. | Presenza bilaterale di leucociti infiltranti il corpo ciliare e/o il vitreo circostante. |
| Infiammazione vascolare retinica | Nessun vaso retinico con leucociti perivascolari | Un vaso per sezione con leucociti perivascolari | >1 vaso per sezione con leucociti perivascolari |
| Piega o danno retinico | Nessun danno alla retina | 1-3 pieghe retiniche per sezione | >3 pieghe retiniche per sezione, o qualsiasi altra distruzione dello strato retinico o emorragia intraretinica |
Tabella 3: Criteri di punteggio istologico PMU: Le sezioni H & E dell'occhio sono state valutate in base ai criteri elencati nella tabella. Tre sezioni dello stesso occhio sono state valutate e mediate per ottenere il punteggio istologico finale dell'occhio.
Discussion
I modelli animali di uveite sono stati determinanti nella comprensione dei meccanismi dell'infiammazione oculare e dell'omeostasi, oltre a consentire la valutazione preclinica delle terapie mediche e chirurgiche per i pazienti con uveite37. Entrambe le varianti di coniglio e ratto del modello PMU hanno dimostrato il loro valore nella terapia preclinica attraverso studi proof of concept38,39,40. A causa della disponibilità di una vasta gamma di ceppi transgenici nei topi, la creazione del sistema modello di PMU murino consente ora studi meccanicistici più dettagliati per identificare specifici tipi di cellule, percorsi e geni che contribuiscono alla patologia di questa malattia.
Modelli animali di uveite possono dimostrare variabilità da animale a animale nell'incidenza e nell'intensità dell'infiammazione41. Nel ceppo di mouse C57BL/6, la PMU viene generata in modo affidabile utilizzando il protocollo descritto qui. Variazioni specifiche del ceppo nel decorso e nell'intensità dell'uveite sono state riportate sia per EAU che per EIU42,43. Mentre gli impatti specifici del ceppo sulla gravità e sul decorso della PMU non sono stati misurati sperimentalmente, questo modello è stato utilizzato in C57BL / 6J wild-type e in topi albini (B6 (Cg) -Tyrc-2J / J) e ha prodotto risposte infiammatorie simili. Nel generare il modello PMU, il controllo delle considerazioni elencate di seguito può aiutare i nuovi ricercatori a limitare la variabilità e produrre l'uveite più coerente e riproducibile.
Garantire la coerenza nelle iniezioni sottocutanee:
Per fornire un'iniezione sottocutanea coerente, assicurarsi che tutte le bolle d'aria vengano rimosse dall'emulsione. Le considerazioni includono una breve centrifuga (30 s a 400 x g) dell'emulsione prefabbricata prima di caricare la siringa. Questo rimuoverà l'aria intrappolata nell'emulsione. Inoltre, quando si carica la siringa, invertire periodicamente (tip-up) e picchiettare la siringa per rimuovere eventuali bolle d'aria. Durante l'iniezione, non posizionare la siringa troppo in profondità per evitare l'iniezione intramuscolare. Al contrario, un'iniezione superficiale (intradermale) può provocare l'erosione dell'emulsione attraverso la pelle. Ricordarsi di fare una breve pausa prima di rimuovere la siringa dal sito di iniezione per garantire l'iniezione completa della densa emulsione viscosa e per prevenire il reflusso dalla pelle.
Sette giorni dopo aver effettuato l'iniezione sottocutanea, confermare la presenza di noduli palpabili su entrambi i lati delle zampe posteriori. Se non è possibile identificare noduli, è possibile che sia stata iniettata aria piuttosto che emulsione. In questo caso, l'infiammazione acuta potrebbe non essere così robusta e l'infiammazione cronica potrebbe non svilupparsi.
Prevenire lo sviluppo di endoftalmite infettiva:
L'endoftalmite batterica o fungina genererà una variabile confondente se non viene prevenuta44. Al fine di prevenire l'endoftalmite batterica, praticare sempre una buona tecnica asettica quando si effettua la sospensione intravitreale, la manipolazione e la pulizia di tutti gli strumenti riutilizzabili che verranno a contatto con l'occhio. L'uso di articoli sterili monouso, l'autoclave o la pulizia con lavaggi o salviette alcoliche al 95% è importante. L'uso appropriato di betadine applicato alla superficie oculare, alle palpebre e alla pelliccia perioculare aiuterà anche a prevenire l'endoftalmite45. È semplice riconoscere un occhio con infezione poiché le strutture oculari saranno cancellate da un'infiammazione estrema durante il ciclo post-iniezione. Questo non è tipico per PMU. La presenza di sanguinamento intraoculare può anche suggerire endoftalmite o trauma dall'iniezione. In questi casi, escludere questi animali dallo studio.
Garantire la coerenza nell'iniezione intravitreale:
L'iniezione intravitreale è un passo fondamentale nell'induzione di un'infiammazione affidabile e riproducibile nella PMU. Fornire una quantità consistente di sospensione di Mtb ad ogni iniezione, evitare traumi e prevenire il reflusso della sospensione sono tutti fattori che dovrebbero essere considerati quando si eseguono le iniezioni. Per garantire una sospensione uniforme, vortice accuratamente la sospensione di calcio dopo lo scongelamento e prima di caricarla nella siringa. Poiché questo estratto di Mtb utilizzato non costituisce una soluzione, la sospensione può subire sedimentazione nel tempo. Per garantire una concentrazione uniforme dell'estratto di Mtb in ogni iniezione, utilizzare o espellere e ricaricare la siringa entro 15 minuti dal caricamento. La fenilefrina viene utilizzata per la dilatazione per fornire un campo visivo più ampio all'occhio posteriore e ridurre il rischio di traumi all'occhio durante l'iniezione. Questa goccia genera una naturale retrazione palpebrale e una leggera proptosi del globo, consentendo una buona visualizzazione dell'area posteriore di 1-2 mm al limbus senza la necessità di afferrare l'occhio con una pinza. L'uso di una pinza per trattenere l'occhio potrebbe causare potenziali traumi e aumentare transitoriamente la pressione intraoculare e il rischio di reflusso della sospensione di Mtb. Il trauma può anche essere causato dal tentativo di iniettare troppo volume nell'occhio. Il volume di iniezione è limitato a 2 μL per prevenire un aumento significativo e prolungato della pressione intraoculare e traumi all'occhio. Inoltre, gli animali più giovani avranno occhi più piccoli dei topi adulti. Tipicamente topi di 6-8 settimane (20-25 g) forniscono una dimensione oculare uniforme e garantiscono una maggiore consistenza nell'infiammazione dopo l'iniezione di Mtb. Una maggiore frequenza di reflusso post-iniezione della sospensione micobatterica è stata osservata nei topi più piccoli. Questo, a sua volta, porta a un'infiammazione acuta inferiore al previsto. Una soluzione diluita di fluoresceina viene utilizzata per fornire all'iniettore principiante un feedback visivo sul successo della loro tecnica di iniezione. La dilatazione al momento dell'iniezione consentirà la visualizzazione diretta del materiale iniettato nella cavità vitreale e l'opportunità di notare eventuali segni di trauma del cristallino. In caso di trauma della lente, può causare un cambiamento nella chiarezza della lente che causerà una cataratta che può essere visualizzata su OCT. In caso di trauma oculare, gli occhi devono essere esclusi dallo studio a causa della possibilità di uveite46 indotta dal cristallino. Si consiglia di fare una pausa di 10 secondi prima di rimuovere la siringa dall'occhio per consentire la dispersione della sospensione Mtb all'interno dell'occhio e diminuire il reflusso.
Il modello PMU può essere modificato per modificare l'intensità dell'infiammazione acuta variando la concentrazione della Mtb nell'iniezione intravitreale. Diversi dosaggi che vanno da 2,5 μg / μL a 15 μg / μL sono stati testati in precedenza nel nostro laboratorio. Tuttavia, dosi superiori a 10 μg / μL sono state trovate per causare gravi danni agli occhi, tra cui rottura spontanea del cristallino, grave edema corneale e cicatrici, e ifema. Questo grado di gravità non è tipico nei pazienti umani con uveite post-infettiva e, pertanto, queste concentrazioni non sono raccomandate. Una dose di 5 μg/μL è risultata produrre in modo affidabile un'infiammazione acuta da lieve a moderata e un'uveite cronica lieve; la dose di 10 μg/μL produce una malattia acuta da moderata a grave in modo affidabile e una malattia cronica più notevole. Pertanto, la variazione della concentrazione intravitreale può fornire gravità della malattia alternativa da utilizzare secondo necessità in base alla domanda sperimentale. I controlli devono essere selezionati per garantire che i risultati siano dovuti alla risposta alla mTB e non al trauma associato alle iniezioni sottocutanee o intravitreali. Nei controlli di iniezione fittizia, il PBS può essere utilizzato al posto dell'estratto di mTB. Per i confronti con animali non esposti, i veri campioni ingenui dovrebbero essere considerati poiché gli occhi dei compagni non sono sempre equivalenti.
A causa delle piccole dimensioni dell'occhio del topo, l'OCT può essere un test più sensibile per rilevare l'infiammazione nella camera anteriore rispetto alla visualizzazione diretta o alla microscopica fotografia a campo luminoso. Il lavoro precedente con PMU nei ratti25 ha determinato che più cellule possono essere rilevate dall'istologia che dall'OCT, ma che esiste una buona correlazione tra le due modalità. L'OCT ha l'ulteriore vantaggio di poter essere utilizzato per monitorare longitudinalmente l'infiammazione nello stesso animale. Anche altri importanti modelli murini di uveite, come EAU e EIU, hanno impiegato l'OCT per l'analisi quantitativa 12,47,48. Nel modello PMU dei topi, le cellule della camera anteriore sono visibili solo sull'OCT e non possono essere viste negli esami clinici a meno che non sia presente un grande ipopione. L'infiammazione vitreale (vitrite) può essere osservata con l'imaging del fondo oculare colorato, ma rilevare il cambiamento quantitativo è possibile solo con l'imaging OCT. Altri aspetti del modello, come l'infiammazione vascolare retinica e il danno alla retina, possono essere facilmente identificati con l'OCT e la fotografia microscopica del fondo oculare a campo chiaro.
Quando si utilizza l'OCT, è importante considerare come l'imaging localizzato può essere influenzato dalle differenze regionali nel grado di infiammazione. Rapporti precedenti hanno identificato una distribuzione irregolare delle cellule nella camera anteriore degli esseri umani, con più cellule situate inferiormente49. Nei topi, una predisposizione simile è comune. Pertanto, le scansioni verticali o radiali attraverso l'AC contribuiranno a garantire immagini che catturino la gamma di infiammazione. Inoltre, l'esecuzione dell'imaging nello stesso luogo fornirà anche coerenza alle immagini raccolte longitudinalmente nello stesso occhio. Per ottenere immagini nella stessa parte dell'occhio, utilizzare punti di riferimento stabili e un approccio sistematico. Per le immagini della camera anteriore, l'immagine è centrata immediatamente adiacente all'apice della cornea e orientata verticalmente in modo che la presenza di un ipopione possa essere rilevata nell'angolo inferiore. Per le immagini del segmento posteriore, l'immagine è centrata sul nervo ottico. Si consiglia di prendere in considerazione l'utilizzo di almeno 3 scansioni di linea per il punteggio per garantire l'acquisizione della variabilità regionale. Nei casi in cui l'infiammazione è limitata a posizioni periferiche, l'acquisizione di scansioni del volume può essere utile. La raccolta di scansioni del volume può anche aiutare a catturare le variazioni regionali, ma aumenterà i requisiti di archiviazione dei dati.
Altri test in vivo che possono essere utilizzati per caratterizzare l'infiammazione nel modello murino PMU includono l'imaging a bioluminescenza13,35. I saggi post-mortem come l'analisi citometrica a flusso multiparametrico possono essere eseguiti per identificare e quantificare le popolazioni di cellule immunitarie infiltranti nella camera acquosa e posteriore dell'occhio12,26. Nel modello PMU, l'infiammazione acuta è caratterizzata da una risposta innata con un infiltrato di neutrofili predominante, seguita da una risposta dominante adattativa delle cellule T cronica e persistente che persiste per oltre un mese35. Altri test della funzione immunitaria che possono essere eseguiti sui tessuti post-mortem includono l'analisi delle citochine del fluido oculare. Inoltre, altri saggi a valle come il sequenziamento dell'mRNA e l'imaging immunofluorescenza possono essere utilizzati per valutare i modelli di espressione genica e proteica delle popolazioni di cellule immunitarie retiniche nell'uveite50,51.
Il modello PMU può essere replicato in altri sistemi di roditori utilizzando adattamenti appropriati per le diverse specie. Il modello PMU è stato precedentemente utilizzato in ratti e conigli38,39,40. Nei ratti, la panuveite acuta si sviluppa dopo iniezione intravitreale che si risolve spontaneamente nell'arco di 14 giorni senza sviluppare segni di infiammazione cronica mediante istologia24. Nei conigli, l'induzione dell'uveite utilizza due cicli di iniezione sottocutanea prima dell'iniezione intravitreale, ma genera anche una robusta panuveite. Uno dei vantaggi dell'utilizzo del modello murino è la pronta disponibilità di numerosi ceppi transgenici e knockout che possono aiutare a comprendere il meccanismo di base dell'uveite52. Tutti i modelli di roditori possono essere utilizzati per i test di terapia preclinica se l'agente viene somministrato per via sistemica o come goccia topica. Tuttavia, a causa delle loro dimensioni maggiori, gli occhi di ratto e coniglio sono modelli migliori per l'uso in studi preclinici di opzioni di trattamento iniettabile impiantabile o locale per l'uveite.
In sintesi, questo protocollo fornisce ai ricercatori interessati a studiare i meccanismi dell'infiammazione oculare cronica un nuovo strumento che non dipende dalla precedente immunizzazione con antigeni oculari.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti finanziari da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato dal finanziamento del National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, Stati Uniti (KP) K08EY0123998, (KP) R01EY030431, (KP) R21 EY02939, UW vision research core grant (NEI P30EY01730), donazioni dal Mark Daily, MD Research Fund e dal fondo di ricerca Christopher e Alida Latham, una sovvenzione dipartimentale illimitata da Research to Prevent Blindness e premio per lo sviluppo della carriera da Research to Prevent Blindness (KP). Il lavoro condotto a Bristol è stato supportato da ulteriori finanziamenti da Sight Research UK e The Underwood Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-FLUOR | Akorn Pharmaceuticals, IL, USA | 10% Fluorescein sodium 100 mg/mL in 5 mL vial | |
| AnaSed | Akorn Animal Health, IL, USA | NDC 59399-110-20 | Xylazine 20 mg/mL |
| Betadine 5% Sterile Ophthalmic Prep Solution | Alcon, TX, USA | 8007-1 | |
| B-D Precision Glide Needles -25 G | Becton, Dickinson and Company, NJ, USA | 305122 | |
| B-D Precision Glide needle -30-G | Becton, Dickinson and Company, NJ, USA | 305106 | |
| Bond MAX, Bond Rx | Leica Biosystems, IL,USA | Automated IHC staining system | |
| Chloramphenicol ointment | Martindale Pharma, Romford, UK | 1% w/w Chloramphenicol | |
| EG1150H | Leica Biosystems, IL,USA | Tissue Embedding | |
| Envisu R2300 | Bioptigen/Leica | OCT Machine | |
| Freund's Incomplete Adjuvant | BD Difco, NJ, USA | 263910 | |
| GenTeal lubricant eye ointment | Alcon, TX, USA | --- | |
| GenTeal lubricant eye gel | Alcon, TX, USA | --- | |
| H37Ra lyophilized Mycobacteria extract | BD Difco, NJ, USA | 231141 | |
| Hamilton RN Needle (33/12/2)S | Hamilton, Reno, NV | 7803-05(33/12/2) | 33 G |
| Hamilton syringe | Hamilton, Reno, NV | CAL7633-01 | 5 µL |
| Insulin needle | Exel International, USA | 26029 | 1 mL |
| Isoflurane | |||
| Ketaset | Zoetis, USA | 377341 | Ketamine HCL 100 mg/mL |
| Microinjection Syringe Pump and Micro4Controller | World Precision Instruments, FL, USA | UMP3 | |
| Micron IV | Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA | Alternative Imaging/OCT Machine | |
| Nanofil 10 µL syringe | World Precision Instruments, FL, USA | NANOFIL | |
| Nanofil Intraocular Injection Kit | World Precision Instruments, FL, USA | IO-KIT | |
| Olympus SZX10 | Olympus | Dissection scope | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| Phenylephrine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP 2.5% Sterile 15 mL | Akorn Pharmaceuticals, IL, USA | 17478020115 | |
| RM2255 | Leica Biosystems, IL,USA | Tissue Sectioning | |
| TB Syringe | Becton, Dickinson and Company, NJ, USA | 309602 | 1 mL |
| Tetracaine 0.5% | Alcon, TX, USA | 1041544 | |
| Tissue Tek VIP series | Sakura Finetek USA, Inc.,CA. | Histology Tissue Processing | |
| Tropicamide 1% | Chauvin Pharmaceuticals, Romford, UK | Minims | |
| Tylenol | Johnson & Johnson Consumer Inc, PA, USA | NDC 50580-614-01 | Acetaminophen |
| Viscotears | Novartis Pharmaceuticals, Camberley, UK | Carbomer eye gel 0.2% w/w |
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