Le poisson-zèbre est un modèle important pour comprendre le développement des reins. Ici, un protocole d’hybridation in situ est optimisé pour détecter l’expression des gènes chez les larves et les juvéniles de poisson zèbre pendant le développement du mésonéphros.
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Article de méthode
In situ Hybridation chez les larves et les juvéniles de poisson zèbre au cours du développement de Mesonephros
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le poisson-zèbre forme deux structures rénales au cours de sa vie. Le pronephros (rein embryonnaire) se forme au cours du développement embryonnaire et commence à fonctionner 2 jours après la fécondation. Composé de seulement deux néphrons, le pronephros sert de seul rein pendant la vie larvaire jusqu’à ce que plus de fonction rénale soit nécessaire en raison de l’augmentation de la masse corporelle. Pour faire face à cette demande plus élevée, le mésonéphros (rein adulte) commence à se former pendant la métamorphose. Les nouveaux néphrons primaires fusionnent avec les pronéphros et forment des lumens connectés. Ensuite, les néphrons secondaires fusionnent avec les néphrons primaires (et ainsi de suite) pour créer un réseau de branchement dans les mésonéphros. La grande majorité de la recherche est axée sur les pronéphros en raison de la facilité d’utilisation des embryons. Ainsi, il est nécessaire de développer des techniques pour étudier les larves et les poissons juvéniles plus âgés et plus gros afin de mieux comprendre le développement des mésonéphros. Ici, un protocole d’hybridation in situ pour l’analyse de l’expression génique est optimisé pour la pénétration de la sonde, le lavage des sondes et des anticorps, et le blanchiment des pigments pour mieux visualiser le mésonéphros. La lignée transgénique Tg(lhx1a-EGFP) est utilisée pour marquer les cellules progénitrices et les tubules distaux des néphrons naissants. Ce protocole comble une lacune dans la recherche sur les mésonéphros. Il s’agit d’un modèle crucial pour comprendre comment les nouveaux tissus rénaux se forment et s’intègrent aux néphrons existants et fournir des informations sur les thérapies régénératives.
Introduction
L’embryon de poisson-zèbre est un modèle important pour étudier le développement tissulaire en raison de sa petite taille, de sa transparence, des outils disponibles et de sa survie sans se nourrir jusqu’à cinq jours1,2. Il a grandement contribué à la compréhension du développement des reins et à la conservation entre le poisson-zèbre et les mammifères3,4,5. Le rein joue un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie des fluides, la filtration du sang et l’excrétion des déchets6. Le néphro....
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Protocole
L’utilisation de larves et de juvéniles de poisson zèbre est approuvée par l’IUP IACUC (protocole #02-1920, #08-1920). Les détails du contenu de la solution sont répertoriés dans la table des matériaux.
1. Élever des larves
REMARQUE: Il faudra jusqu’à 21 jours ou plus pour élever les larves et les juvéniles au stade d’intérêt.
- Installez le poisson-zèbre adulte pour qu’il s’accouple en ajoutant 1 poisson mâle et 1 poisson femelle dans un aquarium d’accouplement en fin d’après-midi après leur dernier repas.
REMARQUE: Tous les couples de poissons ne s’accouplent pas. Commencez par mettr....
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Résultats
En utilisant la lignée transgénique Tg(lhx1a-EGFP), il a été démontré que ce protocole d’hybridation in situ est efficace pour marquer les cellules progénitrices rénales et diverses structures néphroniques au cours du développement du mésonéphros. Comme prévu, le système nerveux central est également étiqueté dans cette lignée transgénique (non montré). Le néphron mésonéphrique initial se forme à environ 5,2 mm, dorsal au pronéphros (figure 2A), et le tubule distal de ce né.......
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Discussion
La méthode d’hybridation in situ décrite ici vise à étudier le développement du mésonéphros. Cependant, il peut être appliqué pour étudier le développement d’autres tissus et organes pendant la métamorphose, tels que l’intestin, le système nerveux, les écailles et la pigmentation14. Des sondes peuvent être générées pour des gènes endogènes ou des marqueurs fluorescents dans des lignées transgéniques.
Il est essentiel que les larves restent intactes afin d’obser.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Le financement a été fourni par la Pennsylvania Academy of Science, le Commonwealth of Pennsylvania Biologists et l’Indiana University of Pennsylvania (School of Graduate Studies and Research, Department of Biology et Cynthia Sushak Undergraduate Biology Fund for Excellence). La lignée transgénique Tg(lhx1a-EGFP) a été fournie par le Dr Neil Hukriede (Université de Pittsburgh).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Anticorps anti-fluorescéine | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
| Solution | 0,8 % KOH, 0,9 % H2O2 dans PBST | ||
| Réactif bloquant | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Utiliser pour la solution bloquante, préparer selon les instructions du fabricant |
| Passoire | Fisher Scientific | ; 22-363-549 | 100 &mu ; m |
| E3 moyen | 5 mM NaCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 0,17 mM KCl, 0,0001 % bleu de méthylène | ||
| Manipulateur de cils | Fisher Scientific | NC1083208 | Utilisation pour manipuler les larves |
| Solution de fixation | 4 % de paraformaldéhyde, 1 % de DMSO dans PBS ; chaleur à 65° ; C tout en agitant jusqu’à ce que la poudre se dissolve, puis ajoutez du DMSO après refroidissement | ||
| Synthèse de sonde de fluorescéine Roche | /Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Flacon en verre | Fisher Scientific | 03-338B | |
| Encapsulation Hatchfry | Argent | ||
| Hyb- solution | 50 % formamide, 5X SSC, 0,1 % Tween-20 | ||
| Hyb+ solution | HYB-, 5 mg/mL d’ARN de torula, 50 ug/mL d’héparine | ||
| MAB (10X) | 1 M d’acide maléique, 1,5 M de NaCl, pH de 7,5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0,1 % Tween-20 | ||
| Acide maléique | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldéhyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X) | 8 % NaCl, 0,2 % KCl, 1,44 % Na2HPO4, 0,24 % KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0,1 % Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0,2 % Tween-20 | ||
| Nourriture en | Mélanger 2 g de chacun de spiruline et d’alevinage encapsuler dans 50 mL d’eau du système de poisson et bien agiter | ||
| Protéinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | pour perméabiliser les larves |
| Protéinase K solution | 20 ; &mu ; g/mL, concentration finale de 1 % de DMSO dans la | ||
| poudre microfine de spiruline | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl, 0,3 M acétate de sodium anhydre, pH 7, autoclave | ||
| SSCT (0,2X) | Dilué à partir de 20X SSC, 0,1 % Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | Dilué à partir de 20X SSC, 0,1 % Tween-20 | ||
| Tampon | de coloration100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1 % Tween-20 | ||
| Solution de | 200 &mu ; g/mL de chlorure d’iodonitrotétrazolium, 200 &mu ; g/mL de phosphate disodique de 5-bromo-4-chloro-3-indolyle, dans un tampon de coloration | ||
| Solution d’arrêt | 1 mM EDTA, pH 5,5, dans | ||
| l’ARN PBST Torula (levure) | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2 %, pH 7 |
| Tampon | 50 % formamide, 2X SSC, 0,1 % Tween-20 |
Références
- Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. Mapping of zebrafish research: a global outlook. Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate. Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).<....
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Réimpressions et autorisations
