유방 상피 세포와 내피 세포 사이 교차 토크는 중요한 유방암 진행에 기여, 종양 성장, 및 전이. 이 연구에서는, 스페로이드는 혈관 및/또는 림프 성 내피 세포와 함께 유방암 세포에서 만들어졌으며 유방암 연구를위한 체외 시스템으로서 자신의 적용성을 입증했습니다.
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이 논문에서
요약
초록
유방암은 여성의 사망의 주요 원인입니다. 유방암 세포의 성장과 후속 전이의 성장은 진행을위한 핵심 요소입니다. 유방암 성장 촉진에 관여하는 기전은 MCF-7 세포와 같은 유방암 세포의 단일 배양을 사용하여 집중적으로 연구되었지만 종양 성장에 밀접하게 관여하는 혈관 및 림프 내피 세포와 같은 다른 세포 유형의 기여는 깊이 조사되지 않았습니다. 세포 세포 상호 작용은 종양 성장 및 진행에 있는 중요한 역할을 합니다. 신경전증, 또는 혈관의 발달은 종양 성장에 필수적이지만 림프 계는 암 세포 이동 및 후속 전이를위한 포털 역할을합니다. 최근 연구는 혈관 및 림프 내피 세포가 암세포 성장에 크게 영향을 미칠 수 있다는 증거를 제공합니다. 이러한 관측은 생체 내 유방암 성장 과정을 보다 현실적으로 반영하는 체외 모델 개발의 필요성을 암시한다. 또한, 동물 연구의 제한은 관련된 메커니즘을 더 잘 해명하기 위해 전 생체 모델의 개발을 필요로한다.
이 문서는 유방암 세포 (에스트로겐 수용체 양성 MCF-7 세포) 및 혈관 및 /또는 림프 내피 세포로 구성된 유방암 스페로이드의 발달을 설명합니다. 이 프로토콜은 두 가지 접근 법, 매달려 드롭 (금 본위제 및 저렴한) 및 96 웰 U-바닥 플레이트 (비싼)를 사용하여 듀얼 셀 스페로이드를 만드는 상세한 단계별 접근 방식을 설명합니다. 형성된 스페로이드를 섬세하게 집어 들고 미세한 크기 조정및 죽은 세포 염색을 사용하여 생존 가능성을 평가하는 방법에 대한 심층 지침이 제공됩니다. 더욱이, 스페로이드의 성장 패턴을 차별화하기 위해 성장특이적 항체로 단면화 및 염색을 위한 스페로이드를 고치는 절차가 묘사된다. 또한, 세포분석용 RNA를 추출하는 방법 및 전염된 세포와 함께 스페로이드를 준비하기 위한 세부 사항이 제공된다. 결론적으로, 이 문서는 유방암 연구를 위한 다세포 스페로이드를 준비하기 위한 심층적인 지침을 제공합니다.
서론
실험을 위해 동물을 사용하는 것은 한계가 있습니다. 동물 연구는 인간에 있는 질병 진행을 정확하게 모방할 수 없고, 동물과 인간은 병원체에 동일 반응이 없습니다. 또한, 동물의 고통과 윤리적 문제에 대한 우려로 인한 동물 실험 제한1,2 점점 더 제약 연구 프로그램. In vitro 동물의 사용을 우회하기 위해 널리 개발된 시스템; 더욱이, 인간 세포의 사용은 in vitro 병리학 및 치료 조사에 더 관련성이 있는 모델. 종래의 단층(2D) 세포 배양은 인간 조직을 어느 정도 모방하기 때문에 널리 사용된다. 그러나, 2D 단배양은 인간 장기를 모방하지 못하며, 2D 단배양은 원래 장기의 복잡한 미세 환경을 시뮬레이션할 수 없으며 in vivo 상황3,4,5,6. 추가적으로, 단층 세포 배양에서, 약 처리는 쉽게 파괴/모든 세포를 손상할 수 있었습니다. 중요한 것은, 다층 3차원(3D) 세포 배양으로 전환하여 이러....
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프로토콜
1. 세포 배양
참고: 멸균 조건에서 세포 처리를 수행합니다.
- 인간 배꼽 정맥 내피 세포 (HUVECs) 하위 배양
- 콜라겐(5 μg/cm2)으로75cm2 플라스크를 실내 온도(RT) 또는 37°C에서 2-3h로 하룻밤(ON)하고 물로 헹구고 플라스크가 건조하도록 허용합니다.
- 글루타민(1x = 2mM), 항생제 항진화 용액(AA; 100 μg/mL 의 연쇄상 구균, 페니실린 100 μg/mL 및 0.025 μg/mL 의 amphotericin B), LSGS (2% v/v FCS, 하이드로코르티손 1 μg/mL, 인간 표피 성장 인자 10 ng/mL, 3 ng/mL 의 인간 표피/mL 표준 조직 배양 조건(37°C, 5% CO2)하에서헤파린의 10 μg/mL 및 10% FCS(태아 송아지 혈청). 세포가 70%-80%에 도달할 때까지 매2일마다 배지를 변경합니다.
- HBSS (Ca2 + 및 Mg 2+제외) 5 mL로 하위 컨물 재배를 세척하고 트립신 3 mL (0.25 % HBSS에서 희석 (Ca2 + 및 Mg 2+제외)를 추가하십시오.<....
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결과
상피 및 내피 공동 배양을 사용하는 스페로이드 모델은 체외 실험을 위해 유방 종양의 생체 조건에서 밀접하게 모방하는 데 필요합니다. 도 1의 계획은 유방암 상피 세포 및 혈관 또는 림프 내피 세포를 가진 스페로이드를 형성하는 프로토콜을 묘사한다(도1). 각 세포 유형은 3.5cm 원형 접시에 별도로 시드되고 성장 자극기/억제제로 처리되거나 Lipofectamine을 사용하여 올리고뉴클레오티드로 감염됩니다. 상피 또는 내피 세포의 컨물수 단층은 트립시화, 세척 및 1:1 비율로 혼합된 다음 수확됩니다. 세포는 이후 96웰 U-bottom플레이트(도 1A)또는 10cm 직경의 둥근 배양 접시의 반전 뚜껑에 도금되어 매달려 있는 낙하 배양(도1B)을용이하게 한다. 곧 파종 후, 세포는 각 우.......
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토론
2D 세포 배양에 비해 혁신적인 3D 스페로이드 배양 기술은 기관의 미세 환경, 세포 세포 상호 작용 및 체외에서약물 반응을 재구성하는 더 강력하고 강력한 도구입니다. 이것은 유방암 연구를 위한 다세포 (상피 및 내피) 세포주에서 스페로이드의 대형을 기술하는 첫번째 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 최대 5일 동안 스페로이드의 스페로이드 3D 성장을 보장하고, 파라핀 포함, 단면 및 조직학적 얼룩 후 스페로이드를 검사할 수 있습니다. 흥미롭게도, 스페로이드 내의 세포 원소는 여전히 세포 성장을 촉진하고 증식 및 세포 자극에 반응하는 수용체를 표현합니다. 설명된 프로토콜은 단백질 또는 RNA/DNA 분석을 위한 충분한 생물학적 물질을 생성한다. 실험실 조건과 저렴한 비용으로 쉽게 달성된 위의 공동 배양 시스템은 특히 유방암 치료와 약물 감수성 검사에서 향후 적용에 유리할 수 있습니다. 또한, 이러한 프로토콜은 상피 및 내피 세포 유형에 적용될 수 있다.
생체 내에서 존.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 암 연구 재단 / 스위스 암 리그 보조금 KFS-4125-02-2017RKD 및 국립 보건 연구소에 의해 지원되었다 EKJ에.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 100 mm × 20 mm 조직 배양 처리된 배양 접시 | Corning | CLS430167 | |
| 149MULTI0C1 | |||
| 35 x 10 mm 조직 배양 접시 | Falcon | 353001 | |
| 5 mL 혈청학 피펫, 폴리스티렌, 개별 포장, 멸균 | 팔콘 | 357543 | |
| Adobe Photoshop | 버전: 13.0.1 (64- bit) | ||
| 항생제 항진균 용액 (100회;) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Calcein-AM | , Sigma-Aldrich | 17783 | |
| CD31 (클러스터 31) | Cell Marque | 131M-95 | monoclonal mouse ab clone JC70 |
| CellTracker Green, CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | Invitrogen | C7025 | |
| CK8/18 (cytokeratins 8 and 18) | DBS | Mob189-05 | monoclonal mouse ab, 클론 5D3 |
| CKX41 도립 현미경 | 올림푸스 생명 과학 | 올림푸스 DP27 디지털 카메라 | |
| 절단 Caspase 3 | 세포 신호 | 9661L | polyclonal rabbit ab |
| 콜라겐 (쥐 꼬리) | Roche | 11 179 179 001 | |
| Coulter ISOTON II 희석제 | Beckman Coulter | 844 80 11 | 희석제 II |
| Coulter Z1, 세포 계수기 | Coulter Electronics, Luton, UK | ||
| 탈수 배양 매체 : Noble Agar | BD Difco | BD 214220 | |
| Dermal Microvascular Endothelial Neonatal, Pooled Donors (HMVEC-DNeo) | Lonza | CC-2516 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco ' 의 변형된 독수리' s 매체/영양소 혼합물 F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D6434 | |
| EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 | Lonza | 190860 | |
| Ethidium homodimer | Sigma-Aldrich | 46043 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher Scientific | SH30070 | |
| Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf) | Thermo Fisher Scientific | SH3006803 | |
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참고문헌
- Sakamoto, K. The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection. Veterinary Pathology. 49 (3), 423-439 (2012).
- Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Developmental Cell.
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