Multiplex in situ hybridization (ISH) användes för att samtidigt visualisera transkriptioner för två G protein-kopplade receptorer och en transkription faktor i hela vagal ganglionic komplex av den vuxna musen. Detta protokoll kan användas för att generera exakta kartor över transkriptionsprofilerna för vagal afferenta nervceller.
Denna studie beskriver ett protokoll för multiplex in situ hybridisering (ISH) av mus halspulsåder-snara ganglier, med särskild tonvikt på att upptäcka uttrycket av G protein-kopplade receptorer (GPCRs). Formalin-fasta halspulsåder-snara ganglier bearbetades med RNAscope teknik för att samtidigt upptäcka uttrycket av två representativa GPCRs (cholecystokinin och ghrelin receptorer) i kombination med en markör gen av antingen snara (parad-liknande homeobox 2b, Phox2b) eller jugular afferent nervceller (PR domän zink finger protein 12, Prdm12). Märkta ganglier avbildades med hjälp av konfokal mikroskopi för att bestämma distributions- och uttrycksmönstren för de ovannämnda transkriptionerna. Kortfattat, Phox2b afferent nervceller konstaterades rikligt uttrycka kolecystokinin receptorn (Cck1r) men inte ghrelin receptorn (Ghsr). En liten delmängd av Prdm12 afferent nervceller konstaterades också att uttrycka Ghsr och/eller Cck1r. Potentiella tekniska varningar i design, bearbetning och tolkning av multiplex ISH diskuteras. Tillvägagångssättet som beskrivs i denna artikel kan hjälpa forskare att generera exakta kartor över transkriptionsprofilerna för vagal afferenta nervceller.
Cellkropparna av vagala afferenter finns i halspulsåder, petrosal och snar ganglier1,2,3. Deras axoner reser tillsammans via flera grenar av vagusnerven till craniocervical, thorax och bukterritorier4,5,6,7. Från deras viscerala ändelser kan vagala afferenter svara på ett brett spektrum av fysiologiska och skadliga stimuli8,9,10. Distributionen av signalmolekyler och receptorer som är involverade i vagalavkänning är dock fortfarande dåligt karakteriserad. Detta beror delvis på att vagala ganglier, trots sin lilla storlek, uttrycker ett brett spektrum av receptorer, inklusive ett stort antal GPCRs8,11,12,13. Dessutom är vagal afferenta nervceller i sig heterogena och visar distinkta molekylära profiler14. För att komplicera saken är halspulsåder, petrosala och snar ganglier fästa i musen och bildar därmed en enda ganglionic massa. Slutligen, i en delmängd av djur, är snar ganglion fäst vid den sympatiska överlägsna livmoderhalsenganglion 15.
Tidigare har forskare vänt sig till immunohistokemi för att studera den neurokemiska maket av vagal afferenta nervceller16,17,18. Medan immunohistokemi med validerade antikroppar är användbart, måste resultaten av immunohistokemiska studier tolkas med försiktighet. Till exempel har många ansträngningar för att identifiera specifika antikroppar mot GPCR misslyckatsmed 19,20,21,22,23,24,25, vilket har lett till att utredarna drar slutsatsen att majoriteten av antikropparna mot GPCR är otillförlitliga. För att kringgå dessa problem har kvantitativ PCR (qPCR) använts i stor utsträckning för att bedöma genuttryck i gnagare vagal ganglionic massa26,27,28,29. Att undersöka genuttryck med hjälp av qPCR sker dock på bekostnad av en förlust av rumslig information. I synnerhet kan det inte förutsägas hur många celler eller vilken celltyp som uttrycker en viss gen av intresse (t.ex. snara kontra halsceller). Återkommande problem inkluderar också förorening med intilliggande vävnader och införandet av varierande längder av vagusnerven, överlägsen livmoderhalscancer och halspulsåder under dissekering15. Som ett resultat av ovanstående svårigheter omger kontroverser uttrycket och distributionen av flera GPCR i vagal afferenta nervceller. Ett särskilt förbryllande exempel gäller ghrelinreceptorn (Ghsr). Medan vissa studier har funnit utbredda uttryck för denna receptor i vagal afferenta nervceller30,31,32, andra har funnit Ghsr mRNA vara nästan oidentifierbar i snar ganglion11,14. Detaljerad kartläggning av Ghsr mRNA i vagal ganglionic massa är därför berättigad.
In situ hybridisering (ISH) har också använts för att bedöma genuttryck mönster i vagal ganglionic massa7,11,12,33,34,35. Eftersom RNA-baserade tekniker förblir mer tillförlitliga och specifika än antikroppsbaserade tekniker under de flesta omständigheter36,37, har ISH-studier visat sig värdefulla för bättre förståelse av den neurokemiska kodningen av vagala afferenta nervceller. Ändå är traditionella ISH-tekniker i sig inte utan varningar. Radioaktiv ISH är känslig men genererar bakgrund och förblir besvärlig38. Icke-radioaktiv ISH är mindre komplicerat men också mindre känsligt38. Däremot är den nyligen utvecklade RNAscope ISH-metoden mycket känslig och genererar minimal bakgrund39. Den aktuella studien tillämpade multiplex fluorescerande RNAscope till detektion av GPCRs i vagal afferent nervceller i musen. Vi fokuserade på att kartlägga fördelningen av Ghsr och jämförde dess fördelning med cholecystokininreceptorn (Cck1r), en annan GPCR välkänd för att uttryckas i snar ganglion34. Slutligen användes de två transkriptionsfaktorerna, parad-liknande homeobox 2b (Phox2b) och PR-domän zinkfingerprotein 12 (Prdm12), som selektiva markörer för snara och jugulära afferenta nervceller, respektive14. Utan att visualisera Phox2b eller Prdm12 skulle det vara utmanande att identifiera halspulsåder kontra snara afferenter med säkerhet. Potentiella tekniska fallgropar diskuteras också i hela artikeln.
Tekniken för ISH uppfanns i slutet av 1960-talet42. Det är dock inte förrän i mitten av 1980-talet som det tillämpades för detektion av mRNAs i centrala och perifera nervsystemet43,44. Med tanke på nervsystemets heterogenitet och återkommande problem med antikroppar, är lokalisering av en viss transkription på cellnivå fortfarande ett ovärderligt verktyg. Icke desto mindre har traditionella ISH-metoder förblivit mödosamma och…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Neuroanatomy / Histology / Brain Injection Core finansierat av NIH grant #5P01DK119130-02. Författarna vill erkänna hjälpen från UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (ledd av Dr. Phelps) och dess personal (Abhijit Bugde och Marcel Mettlen), delvis med stöd av NIH Grant #1S10OD021684-01, en delad resurs för Harold C. Simmons Cancer Center, delvis med stöd av ett NCI Cancer Center Support Grant, P30 CA142543.
10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
20x SSC | Invitrogen | AM9763 | |
-80°C freezer | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
Adobe Photoshop 2021 | Adobe | photo and design software | |
Baking oven | Thermo Scientific | Model:658 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
Cover glass | Brain Research Laboratories | 2460-1.5D | |
Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
Dumont #5 Forceps | F.S.T. | 11252-20 | |
Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | mounting medium |
HybEZ oven | hybridization oven | ||
Hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
ImageJ-Fiji | NIH | ||
Large scissors | Henry Schein | 100-7561 | |
Micro centrifuge tubes | VWR | 20170-333 | |
Minipump variable flow | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
Opal 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Fluorescent biomarker |
Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Fluorescent biomarker |
Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Fluorescent biomarker |
ProLong Gold Antifade Mountant | mounting medium for fluorescently labeled cells | ||
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | multiplex kit |
RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
RNAscope probe Mouse DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
RNAscope probe Mouse Ghsr | ACD /Bio-Techne | 426141 | |
RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
RnaseZap | Sigma | R2020 | Rnase decontaminating solution |
Small dissecting scissors | Millipore Sigma | Z265977 | |
Superfrost Plus slides | Fisherbrand | 1255015 | |
Tissue Tek OCT medium | Sakura | 4583 | |
User manual | ACD | 323100 USM | |
Vannas Spring Scissors | Roboz | RS 5620 | |
ZEN Imaging Software | Zeiss |