Vi præsenterer en eksperimentel protokol og dataanalyse workflow til at udføre levende celle dual-color fluorescens kryds korrelation spektroskopi (FCCS) kombineret med Förster Resonans Energioverførsel (FRET) til at studere membran receptor dynamik i levende celler ved hjælp af moderne fluorescens mærkning teknikker.
Vi præsenterer en protokol og arbejdsgang til at udføre levende celle dual-color fluorescens krydskorrelation spektroskopi (FCCS) kombineret med Förster Resonans Energioverførsel (FRET) til at studere membran receptor dynamik i levende celler ved hjælp af moderne fluorescens mærkning teknikker. I dual-color FCCS, hvor udsvingene i fluorescensintensiteten repræsenterer det dynamiske “fingeraftryk” af den respektive fluorescerende biomolekyle, kan vi sonde co-diffusion eller binding af receptorerne. FRET, med sin høje følsomhed over for molekylære afstande, tjener som en velkendt “nanoruler” til at overvåge intramolekylære ændringer. Samlet set bliver kropslige ændringer og nøgleparametre såsom lokale receptorkoncentrationer og mobilitetskonstanter tilgængelige i cellulære indstillinger.
Kvantitative fluorescens tilgange er udfordrende i celler på grund af høje støjniveauer og sårbarheden af prøven. Her viser vi, hvordan du udfører dette eksperiment, herunder kalibreringstrinene ved hjælp af dual-color mærket β2-adrenergic receptor (β2AR) mærket med eGFP og SNAP-tag-TAMRA. Der tilbydes en trinvis dataanalyseprocedure ved hjælp af open source-software og skabeloner, der er nemme at tilpasse.
Vores retningslinje gør det muligt for forskere at optrævle molekylære interaktioner af biomolekyler i levende celler in situ med høj pålidelighed på trods af de begrænsede signal-til-støj-niveauer i levende celleforsøg. FRET’s operationelle vindue og især FCCS ved lave koncentrationer muliggør kvantitativ analyse ved næsten fysiologiske forhold.
Fluorescensspektroskopi er en af de vigtigste metoder til at kvantificere proteindynamik og proteinproteininteraktioner med minimal forstyrrelser i en cellulær sammenhæng. Konfokal fluorescens korrelation spektroskopi (FCS) er en af de kraftfulde metoder til at analysere molekylær dynamik, da det er enkelt-molekyle følsomme, meget selektiv, og levende celle kompatibel1. Sammenlignet med andre dynamik-orienterede tilgange, FCS har en bredere målbar tidsinterval spænder fra ~ ns til ~ s, vigtigst dækker de hurtige tidsskalaer, der ofte er utilgængelige ved billedbehandling-baserede metoder. Desuden giver det også rumlig selektivitet, så membran, cytoplasmisk og kerne molekylær dynamik let kan skelnes 2. Molekylær blink, den gennemsnitlige lokale koncentration og diffusionskoefficienten kan således analyseres kvantitativt med FCS. Intermolekylær dynamik såsom binding bliver let tilgængelig, når sondering co-diffusion af to molekylære arter i fluorescens krydskorrelation spektroskopi (FCCS) analyse3,4,5 i en tofarvet tilgang.
Det vigtigste underliggende princip i korrelationsspektroskopi er den statistiske analyse af intensitetsudsving, der udsendes af fluorescerende mærkede biomolekyler, der spreder sig ind og ud af et laserfokus (Figur 1A). De resulterende auto- eller krydskorrelationsfunktioner kan derefter analyseres yderligere ved kurvemontering for i sidste ende at udlede rentekonstanter af interesse. Med andre ord giver de statistiske metoder FCS og FCCS ikke enkeltmolekylespor som i enkelt partikelsporing, men et dynamisk mønster eller “fingeraftryk” af en undersøgt prøve med høj tidsmæssig opløsning. Når det kombineres med Förster resonans energioverførsel (FRET), intramolekylær dynamik såsom kropsbygning ændringer kan overvåges på samme tid i en fælles confocal setup5,6. FRET sonder afstanden mellem to fluorophorer og kaldes ofte en molekylær “nanoruler”. Energioverførsel finder kun sted, når molekylerne er i nærheden (< 10 nm), donorens emissionsspektrum overlapper signifikant med acceptmolekylets absorptionsspektrum, og donorens og acceptorens dipoloris orientering er (tilstrækkeligt) parallel. Således giver kombinationen af FRET og FCCS en teknik med meget høj spatio-temporal opløsning. Når rumlig selektivitet, følsomhed samt levende celle kompatibilitet er påkrævet, FRET-FCCS har indlysende fordelagtige i forhold til andre metoder såsom Isoterm titrering Calorimetry (ITC)7, Surface Plasmon Resonans (SPR)8, eller Nuclear Magnetic Resonance (NMR)9,10 til måling af protein dynamik og interaktioner.
På trods af evnerne og løftet om dual-color fluorescens krydskorrelation spektroskopi (dc-FCCS), udfører dc-FCCS i levende celler er teknisk udfordrende på grund af spektrale bleed-through eller krydstale mellem kanalerne3,4, forskellen i confocal mængder på grund af spektralt forskellige laser linjer3,4,11, baggrundssignal, og støj eller begrænset fotostabilitet af prøverne12, 13,14,15. Indførelsen af puls interleaved excitation (PIE) til FCCS var en vigtig tweak at tidsmæssigt afkoble de forskellige laser excitationer for at reducere den spektrale krydstale mellem kanalerne16. Andre korrektionsmetoder til imødegåelse af spektrale gennemblødning17,18,19 og baggrundskorrektioner er også blevet godt accepteret17,18,19. For detaljer og grundlæggende om FCS, PIE eller FRET læseren henvises til følgende referencer2,4,6,16,20,21,22,23,24.
Her præsenteres alle nødvendige kalibreringsforsøg og analyser sammen med de eksperimentelle resultater af en prototypisk G-protein koblet receptor, β 2-adrenergic receptor (β2AR), for tre forskellige scenarier: (1) enkeltmærkede molekyler, der bærer enten en “grøn” (eGFP) eller en “rød” (SNAP-tag-baseret mærkning)25 fluorophor; (2) en dobbeltmærket konstruktion, som bærer et N-terminal SNAP-tag og intracellulær eGFP (NT-SNAP) [i dette tilfælde er begge etiketter på samme protein. Der forventes således 100 % co-diffusion]; og (3) en dobbeltmærket prøve, hvor begge fluorheste er på samme side af cellemembranen (CT-SNAP). Det bærer en C-terminal SNAP-tag og en intracellulær eGFP. Her er begge etiketter igen på samme protein med igen 100% co-diffusion forventes. Da begge etiketter er meget tæt på hinanden, på samme side af cellemembranen, viser det potentialet til at observere FRET og antikorreleret adfærd. Alle konstruktioner blev transficeret i kinesiske Hamster Ovary (CHO) celler og senere mærket med en rød fluorescerende substrat, som er membran-uigennemtrængelig for NT-SNAP konstruktion og membran-permeable for CT-SNAP konstruktion. Endelig eksemplificerer simulerede data eksperimentelle parametres indflydelse på den FRET-inducerede antikorrelation og effekten af protein-proteininteraktioner på co-diffusions amplituden.
Således giver denne protokol en komplet guide til at udføre den kombinerede FRET-FCCS i levende celler for at forstå proteindynamik og protein-protein interaktioner, samtidig med at du gør opmærksom på tekniske / fysiske artefakter, udfordringer og mulige løsninger.
FCS-teknikker i GPCR gør det muligt at vurdere mobiliteten og samspillet mellem receptorer inde i levende celler41. Fordelen ved FRET-FCS-teknikken er, at sammen med mobilitet kan den kropslige dynamik i GPCR’er undersøges. Det er imidlertid en udfordring at udføre FRET-FCS i levende celler og kræver celler, der viser et lavt (eller maksimalt moderat) udtryk for det fluorescerende mærkede protein af interesse, en velkalibreret opsætning og en god pipeline til at analysere data. Her diskuteres først de kritiske punkter i prøveforberedelse og forsøgsprocedure vedrørende de biologiske, spektroskopiske og tekniske synspunkter.
Kritiske eksperimentelle trin omfatter minimering af baggrund og autofluorescence (ved hjælp af omfattende renset coverslips og phenol-røde frie medier), optimering af transfection betingelser (f.eks mængden af plasmid DNA og tid efter transfection) for at opnå lave udtryksniveauer og effektiv mærkning. Det er naturligvis også vigtigt at sikre, at det mærkede proteins funktion ikke hæmmes. I livecelleeksperimenter træffes beslutningen om mærkningsstrategien og etiketpositionen således ofte til fordel for fluorescerende proteiner eller SNAP/CLIP-tag, der er fastgjort til det fleksible N- eller C-endestation42,43. Alternative mærkningsstrategier som indsættelse af en unaturlig aminosyre med en reaktiv sidekæde til mærkning med en organisk fluorophore er dukket op i de sidste år44.
For pie-FCS med to farver, hvor kun samspillet mellem to molekyler af interesse skal undersøges, kan fluorophorerne vælges blandt en lang række etablerede fluorescerende proteiner eller SNAP/CLIP substrater. Her bør spektroskopi-klog målet være at vælge et par sådan, at lidt krydstale eller direkte acceptor excitation forekomme. Derudover skal de valgte fluorophores være photostable og vise lidt eller ingen blegning under de valgte eksperimentelle forhold. Det anbefales at vælge fluorophorer i det røde spektralområde, da (1) autofluorescencebaggrunden fra cellen reduceres, og (2) excitationslyset er af længere bølgelængde, hvilket er mindre fototoksisk14. Photobleaching kan minimeres ved at gennemføre en såkaldt “power series” først, hvor lasereffekten øges trinvist, og den molekylære lysstyrke observeres. Den optimale excitation intensitetsområde ligger i den lineære rækkevidde af resultaterne45.
Hvis de to etiketter formodes at rapportere også om protein kropsbygning dynamik gennem FRET så valget af tilgængelige fluorophores er mere begrænset. Her skal den mulige minimale/maksimale afstand mellem de to fluorheste estimeres på forhånd, f.eks. baseret på tilgængelige strukturer eller molekylær størrelse, og et fluorophorepar udvalgt med en rimelig Förster radius R0, således at FRET faktisk kan forekomme20.
Her blev eGFP og et SNAP-tag valgt til mærkning, og SNAP-mærket blev mærket med enten et intracellulært eller et membran-uigennemtrængeligt overfladesubstrat. Spektret svarer til dem, der er vist i figur 2C-D. Denne kombination af fluorophorer viser høj krydstale af eGFP i de røde detektionskanaler og direkte acceptor excitation af SNAP-substratet ved den grønne excitation i prompt timevinduet og resulterer i et betydeligt “falsk” signal i de røde kanaler i prompttidsvinduet. Ideelt set bør begge værdier, krydssnak og direkte acceptor excitation ikke overstige 5%5,6,38. Med en Förster-radius på 57 Å er den dog ideel til at sondere afstanden mellem etiketterne i β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP konstruktion, som kan evalueres ud fra den slukkede eGFP-levetid (supplerende note 5).
Teknisk set bør enheden, hvad angår ethvert fluorescensspektroskopieksperiment, være godt justeret og have passende excitationskilder, emissionsfilter og følsomme detektorer. For at undgå artefakter fra detektor efterpulsing på μs tidsskala, mindst to detektorer af hver farve bør være til stede, som kan være krydskorreleret. I moderne tidskorreleret enkeltfotontællingselektronik spiller detekteringskortets døde tid i ns-tidsintervallet næppe en rolle på grund af de uafhængige routingkanaler, men det kan kontrolleres som foreslået af Müller et al. 16, forudsat at tidsintervallet ligger i sub-μs/ns-tidsintervallet. Derudover skal hver detektionskanal fordobles,dvs. Mens den gennemsnitlige fluorescenslevetid kan estimeres ved hjælp af ikke-polariseret fluorescensdetektering, skal emissionen opsamles polariseringafhængig til analyse af afstanden (~fordeling) mellem fluorophorerne. Dette skyldes, at effektiviteten af energioverførslen i FRET afhænger af orienteringen af de to fluorophorer. Mere detaljerede oplysninger kan findes her20,28,47. Endelig er afstanden mellem prompt- og forsinkelsespulsen i PIE-eksperimenter kritisk og bør vælges således, at fluorescensintensiteten af fluorophorerne stort set er blevet henfaldet (figur 1B). En fælles regel er at placere de to impulser 5x fluorescens levetid fra hinanden, dvs for eGFP med en fluorescens levetid på 2,5 ns afstanden skal være 12,5 ns på mindst22.
Efter at have detaljeret beskrevet alle overvejelser for forsøgsproceduren diskuteres dataene og dens analyse mere detaljeret. Som nævnt i protokolafsnittet skal justeringen af opsætningen kontrolleres dagligt, herunder analysen af kalibreringsmålingerne. De data, der er vist i figur 2A-C, viser f.eks. en yderligere afslapningskomponent i 8-40 μs-området. Typisk triplet blinkende af den grønne kalibrering fluorophore er kendt for at forekomme i 2-10 μs rækkevidde13,15,48. Den langsomme afslapningskomponent, der kræves i alle kurver i DNA-prøven (Figur 3C), for langsom til faktisk triplet blinkende, kan stamme fra interaktioner mellem DNA med fluorophores39. Denne komponent forventes dog ikke i CCFPIE, og sandsynligvis stammer fra resterende krydstale. Det er således meget tilrådeligt at udføre analysen af kalibreringsprøverne umiddelbart før du fortsætter til celleeksperimenterne for at bedømme kvaliteten af dagens tilpasning.
Korrekt kalibrering af den konfokale overlapningsvolumen kræver en prøve med 100% co-diffusion af den grønne og røde etiket. Her anvendes fluorescerende mærket dobbeltstrenget DNA. Begge DNA-strenge kan skræddersys til at have de ønskede fluorophorer i den ønskede afstand fra hinanden. De designede tråde kan udglødes med højt udbytte. Good Laboratory Practice anbefaler imidlertid, at dna-strengenes integritet og mærkningsgrad kontrolleres ved hjælp af agarosegelelektroforese og måling af absorptionsspektret. Udbyttet af den dobbeltstrengede samling bør også kontrolleres, da denne kalibreringsmåling i kritisk grad afhænger af den antagelse, at der er en 100% co-diffusion af greenen med den røde etiket. Hvis antagelsen ikke er gyldig , skal korrektionsfaktorer muligvis anvendes16,22. I kalibreringsmålingerne i figur 2 og figur 3blev der opnået et detektionsvolumen på henholdsvis 1,4 fL og 1,9 fL i den grønne og røde kanal. Denne størrelsesforskel forventes for en opsætning med næsten diffraktionsbeskriberede excitationsvolumener (supplerende note 2). Under denne tilstand skaleres størrelsen af excitationsvolumenet med excitationsbølgelængden. Dette forklarer igen de forskellige korrelations amplituder , der er observeret i figur 3B. De afledte korrektionsfaktorer rGR = 0,56 og rRG = 0,72 korrekte for denne størrelse uoverensstemmelse og potentielle ikke-perfekte overlapning af de to excitation mængder3,4.
Figur 4, Figur 5, Figur 6og Figur 7 viser arbejdsgangen i en PIE-F(C)CS-baseret undersøgelse, der har til formål at forstå kropsbygningsproteindynamikken. For det første tjener de to enkeltmærkede konstruktioner β2AR-IL3-eGFP og NT-SNAP-β2AR som kontrolforanstaltninger til at karakterisere fluorophoreegenskaberne i celler i mangel af de respektive andre fluorophore (figur 4). Dernæst fungerer den dobbeltmærkede konstruktion NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP med et SNAP-tag mod cellens ydre og en eGFP på den cytoplasmatiske side som en “100% co-diffusion” control (Figur 5). Den sidste konstruktion, β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP, bærer både fluorophores på den cytoplasmatiske side og tæt nok sammen til at gennemgå FRET. Her, igen en 100% co-diffusion ville forventes i takt med anti-korreleret intensitet udsving i de grønne og røde kanaler signal i prompt time window, dvs efter donor excitation, på grund af protein dynamik påvirker FRET effektivitet31,32,33. Denne dynamik kan vise sig at være antikorrelation i CCFFRET (Figur 6-7).
Alle GPCR β2AR konstruktioner viser bimodal diffusion på cellemembranen (Figur 4A). Mens β2AR-IL3-eGFP kun viser den forventede triplet blinkende (Figur 5B)13,15, NT-SNAP-β2AR viser en ekstra langsom afslapningstid (Figur 5C-D). Det er sandsynligt, at tR2 kan stamme fra ubundet SNAP-substrat. Dette kunne belyses ved yderligere forsøg, f.eks. ved også at måle diffusionen og fotofysiske egenskaber ved det anvendte SNAP-substrat i en vandig opløsning. Bemærk, at et ligetil eksperiment for at skelne mellem diffusions- og afslapningstider er at ændre pinhole af den confocal setup, dvs. øge det effektive volumen: Mens diffusionstider øges med stigende effektive mængder, er afslapningsbetingelser uændrede13. Ved bestemmelse af koncentrationen af fluorescerende protein (FP) baseret på fit-resultaterne skal du være opmærksom på, at FPs generelt gennemgår en modningsproces, hvor kromophe endelig dannes12. Denne modningstid kan variere fra FP til FP ud over fotofysik, der afhænger af det lokale kemiske miljø13,15. Således undervurderes den faktiske proteinkoncentration, der er til stede i den prøve, der er rapporteret af FCS, normalt, hvilket kan korrigeres, hvis andelen af ikke-fluorescerende FPs kan bestemmes i forsøget. Endelig er det tilrådeligt at kontrollere fluorophorespektret i levende celler for at korrigere værdierne for α og δ, hvis det er nødvendigt, da de fleste fluorophorer reagerer følsomt over for deres miljø13,15,48. Baggrunden for at trække fra bestemmes af det signal, der indsamles i ikke-transfected celler. Derudover skal autokorrelationen mellem den respektive anden farvekanal og CCFPIE kontrolleres for at kunne identificere falske signaler (supplerende note 4 – figur 30).
De to målinger fra NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP (Figur 5D), hvor fluorophorerne er placeret på forskellige sider af membranen, blev erhvervet på forskellige dage og viser statistikkens betydning i tidsfornødmet enkeltmolekyle fluorescens. Her kan de forskellige resultater skyldes den forskellige grad af mærkning: I en celle resulterede den højere grad af mærkning og gennemsnit af målinger i relativt lav støj (Figur 5B), mens der fra den anden celle kun kunne indsamles to målinger (Figur 5A). Ud over at indsamle en tilstrækkelig mængde data er det afgørende at evaluere resultaterne rettidigt og måske optimere mærkningsstrategien. Når man designer forsøgene, er det vigtigt at huske, at FRET er følsom, men begrænset til afstande op til 10 nm og “blind” ellers. I vores tilfælde er denne “blindhed” angivet af den uændrede eGFP fluorescenslevetid (supplerende note 5). I β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP-konstruktion (figur 6A)kan FRET identificeres fra den slukkede eGFP-levetid (supplerende note 5). Der observeres dog ikke noget antikorrelationsudtryk (figur 6B), hvilket betyder, at FRET enten ikke svinger eller på en tidshorisont langsommere end diffusionstidspunktet. Der kræves op til tre yderligere afslapningsbetingelser i ACFgp, ACFrp, ACFrd og CCFFRET (Figur 6C). Den langsomme komponent i ACFrp, ACFrd og CCFFRET kan skyldes accepteller blegning og naturligvis påvirker den opnåede værdi af den langsomme diffusion findes i disse kurver (~ 350 ms sammenlignet med 117 ms i ACFgp). tD i den røde kanal formodes at være lidt større end i den grønne kanal på grund af de forskellige størrelser confocal mængder (Figur 2) – men kun med en faktor, der kan sammenlignes med størrelsesforskellen. Den meget hurtige afslapningstid på 3 μs afspejler triplet blinkende af fluorophores13,15,48, mens den langsommere afslapningstid på 37 μs kan skyldes FRET: Tilsvarende, som FRET fremkalder en antikorrelation i CCFFRET, positive korrelationer forventes i autocor relations31,32,33. Tilstedeværelsen af dette udtryk som “positiv” i CCFFRET og dets tilstedeværelse i ACFrd kan forklares med den høje krydstale og bør yderligere belyses. Bemærk, at CCFPIE er flad på korte korrelationstider som forventet.
På den anden side skal det bemærkes, at forekomsten af FRET i et interessesystem fører til ikke-lineære virkninger på korrelationskurverne6. Den molekylære lysstyrke fx af et molekyle skaleres ind i korrelation amplituden kvadreret og hver FRET-tilstand (og de altid nuværende molekyler uden en aktiv receptor) viser forskellige molekylære lysstyrke. Faktisk, FRET nedsætter den tilsyneladende koncentration af grønne molekyler opdaget (dvs. øger ACFgp amplitud) og antallet af røde molekyler (bestemt fra rød-prompt) er overvurderet5. Begge virkninger påvirker mængden af interaktion, der stammer fra både CCFFRET og CCFPIE. Men global analyse som vist f.eks. for den intramolekyliske dynamik i Calmodulin 31,32 eller Syntaxin33 kan afsløre proteindynamikken. Når den er omhyggeligt kalibreret, kan den gennemsnitlige FRET-effektivitet udvindes fra den relative CCFPIE- og ACF-amplitud22, mens de begrænsende tilstande kan bestemmes ud fra analysen af donorfluescensenslevfordelingen33.
I betragtning af, at FRET-kontrasten i levende celleeksperimenter med store fluorheste som eGFP sandsynligvis vil være endnu lavere end antaget for simuleringerne i figur 6, og at acceptorens direkte excitation ikke blev tilføjet i simuleringen, kan det forklare, hvorfor identifikationen af antikorrelationen i levende celleforsøg er meget udfordrende. Et lovende analysealternativ er baseret på høst af de oplysninger, der er kodet i foton ankomsttid histogrammer (Figur 1B) tilgængelig på grund af den tidskorrelerede enkeltfotontælling af dataindsamling29,30. Hvis fluorescenslevighedslevetiden (~mønstre) for de to (eller flere) arter (FRET) inde i prøven kendes (Figur 7A), kan der vælges “filter” eller vægte, som anvendes under korrelationsprocessen (Figur 7B)17,18,19. De således opnåede korrelationskurver repræsenterer ikke længere korrelationen mellem detektionskanaler, men snarere auto- eller krydskorrelationerne mellem to forskellige (FRET) arter, der således omdøbes til arter-ACF (sACF) eller art-CCF (sCCF). Hvis du anvender denne tilgang på de simulerede data med moderat FRET-kontrast, genoprettes antikorrelationsudtryktet (Figur 7C-D). Det skal dog bemærkes, at afslapningstider kan opnås, men forholdet til amplitud er tabt18. Denne fremgangsmåde er tidligere blevet anvendt i levende celleforsøg, f.eks. for at studere samspillet mellem EGFR og dets antagonist49 eller for at adskille fluorescensen fra proteiner, der er knyttet til eGFP-varianter med usædvanligt korte og lange fluorescenslevetid50.
Mens PIE-baserede FRET målinger i rensede proteiner i vid udstrækning bruges til at studere protein dynamik3622, i levende celler det fokuserer på at forstå protein-protein interaktioner. Denne fremgangsmåde er blevet anvendt til at studere reguleringen af MAP kinase aktivitet i gær51 eller for at løse samspillet mellem membranproteiner med deres cytosolic bindende partner som opsummeret i denne seneste artikel52. Her kan der opstå komplikationer, når der stadig er betydelig krydstale af grønne fluorheste i forsinkelsestidsvinduet for de røde kanaler eller rødt signal i de grønne kanaler i prompttidsvinduet. Førstnævnte kan skyldes en utilstrækkelig forsinkelse af den røde puls med hensyn til den grønne puls, mens begge effekter skyldes for stærkt overlappende excitation og emission spektre af de valgte fluorophores. Det anbefales at kontrollere de respektive enkeltmærkede konstruktioner omhyggeligt og korrekt for falsk-positive CCFPIE amplituder, især i celler, hvor autofluorescence med meget kort fluorescens levetid kan være en anden komplicerende faktor22.
Afslutningsvis har FRET-FCS-tilgangen, der er beskrevet her, et stort potentiale til at forstå proteinproteininteraktioner og proteindynamikker i levende celler i nær fysiologiske koncentrationer. I denne protokol blev der fokuseret på de nødvendige kalibreringsmålinger og den nødvendige kvantitative analyse, der skal udføres under levende cellemålinger. Til dette formål blev forskellige levende cellemålinger vist suppleret med simuleringer. Simuleringerne giver den generelle forståelse her, da parameter kunne varieres systematisk med skræddersyede fit-modeller, der beskriver de respektive datas specifikke mobilitet og fotofysiske egenskaber. Analysen blev udført med open source-softwareværktøjer med en omfattende trinvis protokol og skabeloner, der er nemme at tilpasse. Endelig vil de tekniske fremskridt og dermed tilgængeligheden af ready-to-buy stabile PIE-FCS-systemer sammen med udbredelsen af open source-software til dataanalyse gøre denne teknik mere og mere tilgængelig for et større forskningssamfund til sidst at optrævle proteininteraktion og dynamik i levende celler med højeste følsomhed.
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB/TR 240, projektnummer 374031971, Project INF) til J.B. og K.G.H.
Vi takker Rudolf Virchow Center for økonomisk støtte og Core Unit Fluorescens Imaging for teknisk support. Derudover takker vi Ashwin Balakrishnan for grundig korrekturlæsning.
1x Telescope in 4f configuration with five lenses | Qioptiq, Rhyl, UK | G063126000 | Optics |
2x Band pass filters Brightline | AHF, Tübingen, Germany | HC 525/50 and HC 600/52 | Filter |
2x Dichroic beam splitter | AHF, Tübingen, Germany | HC BS F38-573 | Filter |
6-well culture plate Nunc | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 140675 | Reagent |
Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard) | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A20000 | Reagent |
Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard) | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A20003 | Reagent |
ASI stage PZ-2000 XYZ | Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany | WK-XYB-PZ-IX71 | Microscope Parts |
Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for 25 mm round coverslips | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A7816 | Glass coverslip holder |
Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14) | Laser Components GmbH, Olching, Germany | SPCM-AQR-14 | Single photon counting detector |
Beamsplitter | Newport, Darmstadt, Germany | 10FC16PB.3 | Filter |
Biorender (Software) | Science Suite Inc – o/a BioRender (Toronto, Canada) | — | Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/ |
Chinese hamster ovary (CHO) cell line | ATCC | CCL-61 | Cell lines |
ChiSurf (Data analysis Software) | Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA | — | tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&t=2s Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017) |
Chloroform | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 472476-2.5L | Reagent |
DMSO | AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany) | A3672,0250 | Reagent |
DNA strand (40 bp fluorophore distance) | IBA Lifesciences GmbH (Göttingen, Germany) | — | Reagent, 5’ CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3’, 3’ GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5’ |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | P04-41250, P04-41650 | Reagent |
Ethanol (absolute) | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 34852-1L-M | Reagent |
Erythrosin B,Dye content >=95 % | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 200964-5G | Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S 0615 | Reagent |
Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q | Excelitas Technologies, Ontario, Canada | XI120-Q-5060 | Microscope Parts |
Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR | New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) | S9105S | Reagent |
Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549 | New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) | S9112S | Reagent |
Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 – 0.16 mm) | Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) | 111640 | Reagent |
Laser Controller | Picoquant, Berlin, Germany | 910020 (PDL 828-S "SEPIA II") | Optics |
Laser lines (480 nm and 560 nm) | Picoquant, Berlin, Germany | 912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560) | Optics |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 11668-019 | Reagent |
MFD suite (Software) | AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany | — | Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis |
Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm | Thorlabs, Bergkirchen, Germany | AC254-150-A-ML | Second part of Beam expander |
Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm) | Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) | 640110 | Reagent |
Olympus IX 71 stand | Olympus, Hamburg, Germany | IX2-ILL100 | Microscope Parts |
Opti-MEM (Reduced-Serum Medium) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 31985-047 | Reagent |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 049M4857V | Reagent |
Phosphate-buffered Saline (PBS) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 14190144 | Reagent |
Pinhole (50 µM) | Newport, Darmstadt, Germany | PNH-50 | Pinhole |
PMT Hybrid-40 | Picoquant, Berlin, Germany | 932200 (PMA Hybrid 40) | Single photon counting detector |
Python scripts (Software) | Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany | — | Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS |
Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1) | AHF, Tübingen, Germany | F73-421PH | Filter |
Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator | Picoquant, Berlin, Germany | 02126 | Optics |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 6771.1 | Reagent |
SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software) | Picoquant, Berlin, Germany | 931073 (SPT64-1+2 single user ) | Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export |
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400 | Picoquant, Berlin, Germany | 930010 (Hydraharp 400) | Optics |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | T4299-100ml | Reagent |
Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 – 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm | Thorlabs, Bergkirchen, Germany | ACN127-020-A | First part of Beam expander |
Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W) | Olympus, Hamburg, Germany | UPLSAPO60XW | Objective |