सभी विषयों से लिखित सूचित सहमति प्राप्त की गई थी, जिन्होंने आईपीएससी पीढ़ी और एमएबी कटाई के लिए अपने नमूने प्रदान किए थे। प्रक्रिया को विश्वविद्यालय अस्पताल ल्यूवेन (एन ° S5732-ML11268) की चिकित्सा नैतिकता समिति और STEMBANCC परियोजना के हिस्से के रूप में यूके की मुख्य अनुसंधान नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी अभिकर्मकों और उपकरणों को सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध किया गया है और इसका उपयोग बाँझ किया जाना चाहिए। मीडिया को उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान (आरटी) पर गर्म किया जाना चाहिए जब तक कि अन्यथा निर्दिष्ट न हो। सह-संस्कृति प्रोटोकॉल के अवलोकन के लिए, कृपया चित्र1 देखें। 1. iPSCs से मोटर न्यूरॉन पूर्वजों का भेदभाव मोटर न्यूरॉन भेदभाव प्रोटोकॉल 15 का पालन करें, जो पिछले अध्ययन 16 से अनुकूलित है, जब तक कि दिन 10 तंत्रिका पूर्वज (एनपीसी) राज्य तक नहीं पहुंच जाता है। प्रोटोकॉल की समय सीमा के अनुसार, भेदभाव सोमवार (दिन 0) पर शुरू किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप गुरुवार को दिन 10 एनपीसी होते हैं। क्रायोप्रिजर्व डे 10 एनपीसी नॉक-आउट सीरम प्रतिस्थापन में 10% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के साथ 2 x 106- 4 x 106 कोशिकाओं प्रति शीशी के घनत्व पर।सावधानी: डीएमएसओ विषाक्त है: व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के साथ एक धुएं के हुड में संभालें।नोट: दिन 10 एनपीसी का लगभग 50% पिघलने पर महत्वपूर्ण होने की उम्मीद है। इस ‘दिन 10 एनपीसी’ राज्य में मोटर न्यूरॉन भेदभाव प्रोटोकॉल को रोकें और बड़ी संख्या में एनपीसी उत्पन्न करने के लिए एनपीसी को क्रायोप्रिजर्व करें, जिसे बाद में बैंक किया जा सकता है और उपयोग किया जा सकता है, सह-संस्कृति प्रोटोकॉल की समग्र समयरेखा की लंबाई को 28 दिनों से 19 दिनों तक कम कर देता है। 2. व्युत्पत्ति और मानव MABs के रखरखाव नोट: एमएबी पोत से जुड़े मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाएं हैं, जिन्हें इस मामले में 58 वर्षीय स्वस्थ दाता से प्राप्त बायोप्सी से काटा गया है। वैकल्पिक वाणिज्यिक स्रोत उपलब्ध हैं। MABs प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल संक्षेप में समझाया गया है। अधिक जानकारी के लिए, विस्तृत प्रोटोकॉल 17 देखें। सभी MAB मीडिया को उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाना चाहिए। बायोप्सी ऊतक कीमा बनाने और कोलेजन पर इनक्यूबेट (बछड़े की खाल से) 2 सप्ताह के लिए एक विकास माध्यम (तालिका 1) में 6 सेमी व्यंजन लेपित। माध्यम को हर 4 दिनों में बदलें। कोलेजन कोटिंग तैयार करने के लिए, 0.1 एम एसिटिक एसिड के 20 मिलीलीटर में 100 मिलीग्राम कोलेजन को भंग करें। कोलेजन को भंग करने में समय लगता है, इसलिए मिश्रण को आरटी पर रात भर एक रॉकिंग प्लेटफॉर्म पर रखें। अगले दिन, 100 एमएल की अंतिम मात्रा में डीडीएच 2 ओ के 80 एमएल के साथ टॉप अप करें।सावधानी: एसिटिक एसिड विषाक्त है; व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणके साथ एक धुएं हुड में संभाल.नोट: बछड़े की खाल कोटिंग से कोलेजन 5x तक पुन: उपयोग किया जा सकता है। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। कोलेजन के साथ पकवान या फ्लास्क की पूरी सतह को कोट करें, एक लैमिनर प्रवाह के अंदर आरटी पर 20 मिनट के लिए बंद और इनक्यूबेट करें। 20 मिनट के बाद, एक ताजा कंटेनर में कोलेजन को ठीक करें, खाली डिश / फ्लास्क को बंद करें और लैमिनर प्रवाह में आरटी पर 10 मिनट के लिए छोड़ दें। डिश / फ्लास्क को इनक्यूबेटर में रात भर (या कम से कम 6 घंटे) इनक्यूबेशन (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) के लिए स्थानांतरित करें। प्लेटिंग कोशिकाओं से पहले कैल्शियम या मैग्नीशियम (DPBS) के बिना Dulbecco के फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा के साथ 5x धोएं। 14 दिनों के बाद, FACS (फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल सॉर्टिंग) मानव क्षारीय फॉस्फेट 17 के लिए MABs को सॉर्ट करता है, जिसके बाद आगे का विस्तार होता है। विकास माध्यम में कोलेजन-लेपित T75 फ्लास्क पर MABs बनाए रखें और हर 2 दिनों में विकास माध्यम (10 mL प्रति फ्लास्क) बदलें। 70% संगम तक पहुंचने पर उपकरणों में क्रायोप्रिजर्व, मार्ग, या बीज एमएबी।नोट: MABs सेल-टू-सेल संपर्क पर सहज संलयन के कारण अपनी मायोजेनिक क्षमता खो देते हैं। सुनिश्चित करें कि MABs का विस्तार करते समय 70% संगम से अधिक न हो। एक 70% confluent T75 फ्लास्क में लगभग 600,000-800,000 कोशिकाएं होती हैं, जिन्हें प्रति शीशी 100,000 कोशिकाओं पर क्रायोप्रिज़र्व किया जा सकता है। प्रत्येक शीशी को बाद में विस्तार के लिए एक T75 फ्लास्क में पिघलाया और बीज दिया जा सकता है। एमएबी को पारित करने के लिए, धीरे से उन्हें 7 एमएल डीपीबीएस के साथ एक बार धोएं और फिर कोशिकाओं को अलग करने के लिए 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए एमएबी पृथक्करण समाधान के 7 मिलीलीटर में इनक्यूबेट करें। विकास माध्यम के 7 मिलीलीटर के साथ एमएबी पृथक्करण समाधान को बेअसर करें, धीरे से कोशिकाओं को स्क्रैप करें, और सेल निलंबन को 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। संभावित रूप से शेष एमएबी एकत्र करने के लिए विकास माध्यम के अतिरिक्त 5 मिलीलीटर के साथ फ्लास्क को धीरे से धोएं। 300 x g पर 3 मिनट के लिए सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें, फिर विस्तार के लिए सीधे एक नए कोलेजन-लेपित T75 फ्लास्क के लिए पारित करें, 10% डीएमएसओ के साथ नॉक-आउट सीरम प्रतिस्थापन में क्रायोप्रिजर्व करें या माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में बीज की गिनती करें।नोट:: मार्ग 1x-2x प्रति सप्ताह सेल विस्तार के लिए 13 की एक अधिकतम मार्ग संख्या तक किया जाता है। पृथक्करण पर, माइक्रोस्कोप के नीचे जांच किए जाने पर एमएबी गोलाकार और आकार में बड़े दिखाई देते हैं। 3. पूर्व इकट्ठे माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों की तैयारी – दिन 9 नोट:: प्रोटोकॉल microfluidic डिवाइस निर्माता के न्यूरॉन डिवाइस प्रोटोकॉल से अनुकूलित है और दोनों पूर्व इकट्ठे और सिलिकॉन उपकरणों के उपयोग के लिए समायोजित किया गया है। यहां, पूर्व-इकट्ठे उपकरणों का उपयोग इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री (आईसीसी) और लाइव-सेल कैल्शियम क्षणिक रिकॉर्डिंग के लिए किया जाता है, जबकि सिलिकॉन उपकरणों का उपयोग एसईएम के लिए किया जाता है। प्रोटोकॉल की समयरेखा मोटर न्यूरॉन भेदभाव प्रोटोकॉल के लिए समयरेखा का पालन करती है। कोशिकाओं को सीडिंग करने से एक दिन पहले माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को तैयार करें, क्योंकि कोटिंग को रात भर इनक्यूबेट करने की आवश्यकता होती है। मोटर न्यूरॉन प्रोटोकॉल के अनुसार, यह एक बुधवार होगा। एक 10 सेमी पेट्री पकवान के लिए 70% -100% इथेनॉल के ~ 10 मिलीलीटर जोड़ें। नसबंदी के लिए पेट्री डिश में शिपिंग कंटेनर से डिवाइस को स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करें। 10 s के लिए इथेनॉल में डिवाइस को डुबोएं और ~ 30 मिनट के लिए लैमिनर प्रवाह में हवा सूखने के लिए कागज के एक टुकड़े में संदंश के साथ डिवाइस को स्थानांतरित करें। दोनों पक्षों को सूखने की अनुमति देने के लिए डिवाइस को कुछ बार फ्लिप करें। जब डिवाइस सूखा होता है, तो प्रत्येक डिवाइस को आसान हैंडलिंग के लिए एक व्यक्तिगत 10 सेमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करेंसावधानी: इथेनॉल विषाक्त है; व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण के साथ एक धुएं हुड में संभाल DPBS में Poly-L-ornithine (PLO) (100 μg / mL) के साथ डिवाइस को कोट करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, 3 घंटे के लिए 5% CO2 । एक P200 पिपेट का उपयोग करें एक शीर्ष में DPBS में PLO के 100 μL जोड़ने के लिए के रूप में अच्छी तरह से संभव के रूप में चैनल खोलने के करीब और ऊपर से अच्छी तरह से नीचे के लिए चैनल के माध्यम से अच्छी तरह से पारित तरल पदार्थ का निरीक्षण अच्छी तरह से अच्छी तरह से. इसके बाद, नीचे अच्छी तरह से DPBS में PLO के 100 μL जोड़ें। माइक्रोग्रूव्स के दूसरी तरफ दोहराएं और डिवाइस के एक तरफ 100 μL जोड़कर समाप्त करें ताकि माइक्रोग्रूव्स को कोट करने के लिए डिवाइस के दो प्रतिबिंबित पक्षों के बीच वॉल्यूम ग्रेडिएंट बनाया जा सके (उदाहरण के लिए, दाईं ओर 200 μL, बाईं ओर 300 μL)। 3 घंटे के बाद, डिवाइस को DPBS के साथ 5 मिनट के लिए 3x धो लें। यदि आवश्यक हो तो एक सक्शन प्रणाली का उपयोग करें।नोट: कोटिंग या कोशिकाओं की खेती के दौरान किसी भी बिंदु पर चैनलों में किसी भी हवा के बुलबुले के गठन से बचने के लिए सुनिश्चित करें। यहां तक कि छोटे बुलबुले भी थोड़े समय में विस्तार करेंगे, जिससे चैनल में कोटिंग, सेल सीडिंग, या मीडिया प्रवाह को बाधित किया जा सकेगा। यदि कोटिंग के दौरान चैनल में तरल पदार्थ बंद हो जाता है, तो दोनों पक्षों से सीधे चैनल में पीएलओ समाधान को फिर से निलंबित करें। यदि बुलबुले अभी भी मौजूद हैं, तो चैनल को फ्लश करने के लिए DPBS के 200 μL का उपयोग करें और कोटिंग प्रक्रिया को दोहराएं जैसा कि ऊपर 3.3.1-3.3.2 चरणों में कहा गया है। यदि सेल सीडिंग के बाद बुलबुले दिखाई देते हैं, तो डिवाइस को पुनर्प्राप्त करना असंभव है, क्योंकि चैनल को फ्लश करने से कोशिकाओं को नुकसान होगा। एक Neurobasal माध्यम में लैमिनिन (20 μg / mL) के साथ डिवाइस कोट और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% CO2 पर रात भर इनक्यूबेट। चरण 3.3.1-3.3.2 से PLO कोटिंग के लिए एक ही निर्देशों का पालन करें। अगले दिन, एक P200 पिपेट का उपयोग करें और कुओं से लैमिनिन कोटिंग को हटाने के लिए चैनल खोलने के विपरीत अच्छी तरह से टिप को स्थिति दें। सभी कुओं के लिए DPBS जोड़ें और सेल सीडिंग के लिए आरटी पर लैमिनर प्रवाह में DPBS के साथ उपकरणों को छोड़ दें।नोट: इस बिंदु से, चैनलों से सीधे तरल (लैमिनिन कोटिंग, डीपीबीएस, मीडिया, फिक्सेशन समाधान, आदि) को हटाना महत्वपूर्ण नहीं है, क्योंकि यह हवा के बुलबुले के गठन का कारण बन सकता है। कोशिकाओं को सीडिंग करने से पहले हमेशा माइक्रोस्कोप के नीचे उपकरणों का निरीक्षण करें। 4. सिलिकॉन माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों की तैयारी – दिन 9 सीडिंग कोशिकाओं से एक दिन पहले सिलिकॉन माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को तैयार करें, क्योंकि कोटिंग को रात भर इनक्यूबेट करने की आवश्यकता होती है। मोटर न्यूरॉन प्रोटोकॉल के अनुसार, यह एक बुधवार होगा। एक 10 सेमी पेट्री पकवान के लिए 70% -100% इथेनॉल के ~ 10 मिलीलीटर जोड़ें। नसबंदी के लिए पेट्री डिश में शिपिंग कंटेनर से डिवाइस को स्थानांतरित करने के लिए एक संदंश का उपयोग करें। डिवाइस को 10 s के लिए इथेनॉल में डुबोएं और ~ 30 मिनट के लिए लैमिनर प्रवाह में हवा में सूखने के लिए 6-अच्छी तरह से प्लेट में एक अच्छी तरह से संदंश के साथ स्थानांतरित करें। सभी पक्षों को सूखने की अनुमति देने के लिए डिवाइस को अपनी तरफ रखें। डिवाइस के आकार के लिए SEM शीट को काटें (प्रत्येक पक्ष पर कुछ मिमी छोड़ दें)। चरण 4.1.1 में ऊपर बताए गए अनुसार नसबंदी को दोहराएं। फिर, सूखने के लिए 10 सेमी पेट्री डिश में संदंश के साथ स्थानांतरित करें। एक डिश में दो-तीन एसईएम शीट फिट होंगी। DPBS में PLO (100 μg / mL) के साथ उपकरणों और SEM शीट को कोट करें और 37 °C पर इनक्यूबेट करें, 3 घंटे के लिए 5% CO2 । 6-अच्छी तरह से प्लेट में प्रत्येक डिवाइस के लिए अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से DPBS में PLO के 1 mL जोड़ें। सुनिश्चित करें कि डिवाइस चैनल और माइक्रोग्रोव पक्ष के साथ पीएलओ समाधान के शीर्ष पर तैर रहा है जो तरल में नीचे का सामना कर रहा है। DPBS प्रति 10 सेमी पेट्री डिश में PLO के 10 mL जोड़ें और तरल में SEM शीट को नीचे धकेलने के लिए संदंश का उपयोग करें।नोट: SEM चादरें आमतौर पर कोटिंग समाधान के शीर्ष पर तैरती हैं। डिवाइस और शीट को असेंबल करने से पहले, SEM शीट को चारों ओर घुमाएं ताकि सतह, जो PLO के संपर्क में रही है, डिवाइस के चैनल और माइक्रोग्रोव सतह से संपर्क करे। 3 घंटे के बाद, डिवाइस और SEM शीट्स को DPBS के साथ 5 मिनट के लिए 2x धोएं, इसके बाद बाँझ पानी के साथ 5 मिनट के लिए एक और धोएं। यदि आवश्यक हो तो एक सक्शन प्रणाली का उपयोग करें। आसान हैंडलिंग के लिए एक व्यक्ति 10 सेमी पेट्री डिश के लिए प्रत्येक SEM शीट स्थानांतरित करें।नोट: दोनों उपकरणों और SEM पत्रकों को असेंबली से पहले पूरी तरह से सूखा होना चाहिए। बाँझ पानी के साथ अंतिम धोने से DPBS से संभावित नमक क्रिस्टल को हटा दिया जाता है, जो अन्यथा असेंबली को बाधित कर सकता है। एक लैमिनर प्रवाह में एक माइक्रोस्कोप के तहत काम करें। चैनल के साथ सिलिकॉन डिवाइस को माउंट करने के लिए संदंश का उपयोग करें और SEM शीट पर 90 ° कोण पर माइक्रोग्रोव पक्ष नीचे, यह सुनिश्चित करते हुए कि सभी पक्ष संरेखित हैं। न केवल बाहरी किनारों को सील करना सुनिश्चित करने के लिए डिवाइस पर हल्के से नीचे दबाएं, बल्कि कुओं, चैनलों और माइक्रोग्रूव्स के आसपास भी।नोट: बंधुआ क्षेत्र भूरे रंग के दिखाई देंगे, जबकि जो अभी तक घुड़सवार नहीं हैं, वे माइक्रोस्कोप के नीचे स्पष्ट दिखाई देंगे। सुनिश्चित करें कि सभी क्षेत्रों को अच्छी तरह से हवा के बुलबुले के बिना सील कर रहे हैं culturing के दौरान डिवाइस की टुकड़ी से बचने के लिए. बढ़ते को अवरुद्ध करने वाले मलबे या नमक क्रिस्टल के मामले में, बढ़ते प्रक्रिया को पुन: प्रयास करने से पहले बाँझ पानी में SEM शीट और डिवाइस दोनों को फिर से धोएं और सूखा दें। यदि microgrooves डिवाइस पर बहुत मुश्किल दबाने से विकृत दिखाई देते हैं, तो SEM शीट से डिवाइस को पूरी तरह से हटा दें और फिर से बढ़ते का प्रयास करें। डिवाइस माउंट होने के बाद मीडिया को कोटिंग और बदलते समय सावधान रहें। एक लैमिनर प्रवाह में एक माइक्रोस्कोप के तहत काम करें। एक Neurobasal माध्यम में लैमिनिन (20 μg / mL) के साथ डिवाइस कोट और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% CO2 पर रात भर इनक्यूबेट।नोट: रात भर इनक्यूबेशन सिलिकॉन डिवाइस को सख्त कर देता है और आगे इसे SEM शीट पर सील करता है। एक P200 पिपेट का उपयोग करें एक शीर्ष में लैमिनिन समाधान के 100 μL जोड़ने के लिए अच्छी तरह से संभव के रूप में चैनल खोलने के करीब और ऊपर से अच्छी तरह से चैनल के माध्यम से नीचे अच्छी तरह से पारित तरल पदार्थ का निरीक्षण अच्छी तरह से. कुएं और चैनल के चारों ओर रिसाव के लिए जाँच करें। इसके बाद, नीचे अच्छी तरह से लैमिनिन समाधान के 100 μL जोड़ें और रिसाव के लिए जाँच करें। माइक्रोग्रूव्स के दूसरी तरफ दोहराएं और डिवाइस के एक तरफ एक अतिरिक्त 100 μL के साथ समाप्त करें ताकि माइक्रोग्रूव्स को कोट करने के लिए डिवाइस के दो प्रतिबिंबित पक्षों के बीच वॉल्यूम ग्रेडिएंट बनाया जा सके (उदाहरण के लिए, दाईं ओर 200 μL, बाईं ओर 300 μL)।नोट: रिसाव के मामले में, लैमिनिन कोटिंग को हटा दें, डिवाइस और एसईएम शीट को अलग करें और बाँझ पानी में दोनों को धो लें। उन्हें सूखने दें और चरण 4.3 के बाद से दोहराएं। अगले दिन, चैनल खोलने के विपरीत अच्छी तरह से टिप की स्थिति द्वारा एक P200 पिपेट के साथ कुओं से कोटिंग को हटा दें। सभी कुओं के लिए DPBS जोड़ें और सेल सीडिंग के लिए आरटी पर लैमिनर प्रवाह में DPBS के साथ उपकरणों को छोड़ दें।नोट: इस बिंदु से, चैनलों से सीधे तरल (लैमिनिन कोटिंग, DPBS, मीडिया, निर्धारण समाधान, आदि) को हटाने के लिए न करें, क्योंकि यह हवा के बुलबुले के गठन का कारण बन सकता है। कोशिकाओं को सीडिंग करने से पहले हमेशा माइक्रोस्कोप के नीचे उपकरणों का निरीक्षण करें। 5. माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में NPCs के चढ़ाना – दिन 10 नोट: मोटर न्यूरॉन भेदभाव प्रोटोकॉल 15 के अनुसार, दिन 10 NPCs की चढ़ाना एक गुरुवार को होता है। रॉक अवरोधक (10 μL / mL) समाधान के साथ दिन 10 मोटर न्यूरॉन माध्यम (तालिका 2 और तालिका 3) के प्रति 10 मिलीलीटर प्रति 10 मिलीलीटर बैंक वाले NPCs की 1-2 शीशियों को पिघलाएं, और 4 मिनट के लिए 100 x g पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। रॉक अवरोधक (10 μL / mL) समाधान के साथ दिन 10 मोटर न्यूरॉन माध्यम के 500-1000 μL में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और किसी भी पसंदीदा गिनती विधि का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं की गिनती करें।नोट: जैसा कि नीचे कहा गया है, एक इष्टतम सीडिंग वॉल्यूम को समायोजित करने के लिए मीडिया की सही मात्रा में NPCs को पुन: निलंबित करना सुनिश्चित करें। एक P200 पिपेट और बीज 250,000 NPCs प्रति डिवाइस 60-100 μL दिन 10 मोटर न्यूरॉन मीडिया के साथ डिवाइस में microgrooves के एक तरफ दो कुओं से DPBS निकालें। शीर्ष दाईं ओर अच्छी तरह से, सेल निलंबन (125,000 कोशिकाओं) के बीज 30-50 μL एक 45 ° कोण पर चैनल खोलने के करीब और पिपेट टिप के साथ कुएं के केंद्र की ओर अच्छी तरह से फर्श के साथ शेष तरल पदार्थ को धीरे से खींचें। सेल निलंबन को चैनल के माध्यम से प्रवाहित करने की अनुमति देने के लिए कुछ सेकंड के लिए रोकें, इसे कम अच्छी तरह से दोहराने से पहले (30-50 μL में 125,000 कोशिकाएं)। एक माइक्रोस्कोप के बिना डिवाइस के आसान अभिविन्यास के लिए seeded पक्ष “NPC” या समकक्ष चिह्नित करने के लिए एक पेन का उपयोग करें। डिवाइस को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, 5 मिनट के लिए 5% सीओ 2 एक अतिरिक्त दिन 10 मोटर न्यूरॉन माध्यम (कुल 200 μL / अच्छी तरह से) के साथ दो-बीज वाले कुओं को टॉप करने से पहले सेल अनुलग्नक की अनुमति दें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर फिर से इनक्यूबेट करें।नोट: प्रत्येक कुएं में 200 μL हो सकते हैं। दोनों कुओं और चैनलों में सीडिंग कोशिकाएं संस्कृति की एक मजबूत संरचना सुनिश्चित करती हैं, जिससे मीडिया परिवर्तनों के दौरान सेल टुकड़ी का खतरा कम हो जाता है। केवल चैनल में कम कोशिकाओं को बीज करना संभव है। हालांकि, यह प्रत्येक माध्यम परिवर्तन के दौरान चैनलों के माध्यम से वॉल्यूम वर्तमान के लिए संस्कृति को अधिक संवेदनशील बना देगा। ताजा बीजवाले एनपीसी के विपरीत माइक्रोग्रूव्स के दूसरी तरफ दो कुओं से DPBS को हटाने के लिए एक P200 पिपेट का उपयोग करें। 200 μL / दिन 10 मोटर न्यूरॉन मीडिया के कुएं जोड़ें और मीडिया को चैनल के माध्यम से प्रवाहित करने की अनुमति देने के लिए ऊपर और नीचे के बीच कुछ सेकंड प्रतीक्षा करें। फिर, इनक्यूबेशन के दौरान माध्यम के वाष्पीकरण को रोकने के लिए डिवाइस के चारों ओर प्रति 10 सेमी डिश प्रति 6 एमएल डीपीबीएस जोड़ें।नोट:: यदि आवश्यक हो तो संस्कृति अवधि के दौरान डिवाइस के आसपास अतिरिक्त DPBS जोड़ें। दिन 11 (शुक्रवार), दिन 14 (सोमवार), और दिन 16 (बुधवार) (तालिका 2 और तालिका 3) पर डिवाइस के दोनों डिब्बों में एक पूर्ण मोटर न्यूरॉन मध्यम परिवर्तन करें। मध्यम परिवर्तन के दिन ताजा मीडिया की खुराक जोड़ें।नोट:: पर इस बिंदु से, एक P200 पिपेट के साथ सभी मध्यम परिवर्तन निष्पादित करें। हमेशा पिपेट टिप को चैनल से दूर अच्छी तरह से किनारे पर रखें और सीधे चैनल से तरल को न हटाएं। सावधान रहें कि सिलिकॉन उपकरणों को अलग न करें। सेल टुकड़ी को रोकने के लिए माध्यम को हटाने और जोड़ने के लिए धीरे-धीरे किया जाना चाहिए। चैनल खोलने के विपरीत अच्छी तरह से दीवार के निचले किनारे पर P200 पिपेट टिप की स्थिति द्वारा NPCs के साथ दोनों कुओं में सभी मीडिया को सावधानीपूर्वक हटा दें। धीरे-धीरे चैनल खोलने के विपरीत अच्छी तरह से दीवार के शीर्ष किनारे पर P200 पिपेट टिप की स्थिति द्वारा शीर्ष पर ताजा मोटर न्यूरॉन माध्यम के 50-100 μL जोड़ें। कुछ सेकंड के लिए रोकें ताकि माध्यम को चैनल के माध्यम से प्रवाहित करने की अनुमति मिल सके, इससे पहले कि नीचे अच्छी तरह से मोटर न्यूरॉन माध्यम के 50-100 μL जोड़ें। इस प्रक्रिया को सावधानीपूर्वक दोहराएं जब तक कि दोनों कुओं में 200 μL / अच्छी तरह से न हो। कोशिकाओं के बिना पक्ष पर दोहराएँ। 6. माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में एमएबी का चढ़ाना – दिन 17 माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों (मोटर न्यूरॉन भेदभाव के दिन 10) में एमएबी को सीडिंग करने से लगभग 7 दिन पहले, एमएबी को पिघलाएं और उन्हें पर्याप्त सेल विस्तार की अनुमति देने के लिए कोलेजन के साथ लेपित टी 75 फ्लास्क में विकास माध्यम (तालिका 1) में बीज दें। अनुभाग 2 देखें। मोटर न्यूरॉन भेदभाव (गुरुवार) के 17 वें दिन, एमएबी को अलग करें जैसा कि चरण 2.4 में समझाया गया है, विकास माध्यम के ~ 500 μL में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें और किसी भी पसंदीदा गिनती विधि का उपयोग करके लाइव कोशिकाओं की गणना करें।नोट: जैसा कि नीचे कहा गया है, इष्टतम सीडिंग वॉल्यूम को समायोजित करने के लिए मीडिया की सही मात्रा में एमएबी को फिर से निलंबित करना सुनिश्चित करें। एक P200 पिपेट के साथ डिवाइस में microgrooves के गैर-वरीयता प्राप्त पक्ष पर मोटर न्यूरॉन माध्यम निकालें, DPBS के साथ धीरे से धोएं, और विकास माध्यम के 60-100 μL में प्रति डिवाइस 200,000 MABs बीज। शीर्ष दाईं ओर अच्छी तरह से, सेल निलंबन (100,000 कोशिकाओं) के बीज 30-50 μL एक 45 ° कोण पर चैनल खोलने के करीब और पिपेट टिप के साथ कुएं के केंद्र की ओर अच्छी तरह से फर्श के साथ शेष तरल पदार्थ को धीरे से खींचें। निचले कुएं (30-50 μL में 100,000 कोशिकाओं) में दोहराने से पहले चैनल के माध्यम से कोशिकाओं के प्रवाह की अनुमति देने के लिए कुछ सेकंड के लिए रोकें। अतिरिक्त विकास माध्यम (कुल 200 μL / अच्छी तरह से) के साथ दो ताजा एमएबी-बीज वाले कुओं को टॉप करने से पहले सेल अनुलग्नक की अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर डिवाइस को इनक्यूबेट करें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% CO2 पर फिर से इनक्यूबेट करें।नोट: डिवाइस के मोटर न्यूरॉन पक्ष पर 17 वें दिन कोई मध्यम परिवर्तन की आवश्यकता नहीं है। पहले प्रकाशित मोटर न्यूरॉन भेदभाव विधि 15 के अनुसार दिन 17 मध्यम परिवर्तन इसके बजाय 18 वें दिन (शुक्रवार) पर किया जाता है। 7. एमएबी डिब्बे की ओर मोटर न्यूरॉन न्यूराइट्स के विकास को बढ़ावा देने के लिए एक वॉल्यूमेट्रिक और कीमोटैक्टिक ग्रेडिएंट का कार्यान्वयन दिन 18 पर, दिन 18 मोटर न्यूरॉन माध्यम (200 μL / अच्छी तरह से) के साथ मोटर न्यूरॉन पक्ष पर एक पूर्ण मध्यम परिवर्तन करें। चरण 5.5.1-5.5.2 में उल्लिखित मध्यम परिवर्तनों के लिए निर्देशों का पालन करें। डिवाइस के MAB डिब्बे में MAB विभेदन प्रारंभ करें (तालिका 2 और तालिका 4). मानव एग्रिन (200 μL / अच्छी तरह से) के 0.01 μg / mL के साथ पूरक प्रीहीटेड एमएबी भेदभाव माध्यम (तालिका 4) जोड़ने से पहले डीपीबीएस के साथ एक बार एमएबी डिब्बों को सावधानीपूर्वक धोएं।नोट: MABs फ्यूज और एक सप्ताह के समय पाठ्यक्रम में multinucleated myotubes फार्म होगा. दिन 21 पर, मोटर न्यूरॉन भेदभाव प्रोटोकॉल (सोमवार) के अनुसार, कीमोटैक्टिक और वॉल्यूमेट्रिक ग्रेडिएंट (तालिका 2 और तालिका 3) शुरू करें। मस्तिष्क-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक (BDNF), ग्लियाल सेल लाइन-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक (GDNF) और सिलियरी न्यूरोट्रॉफिक कारक (CNTF), मानव एग्रिन (0.01 μg / mL), और लैमिनिन (20 μg / mL) के 30 ng / mL के साथ मोटर न्यूरॉन बेसल माध्यम के 200 μL / अच्छी तरह से जोड़ें मायोट्यूब डिब्बे (पहले एमएबी डिब्बे के रूप में परिभाषित)। मोटर न्यूरॉन डिब्बे के लिए विकास कारकों के बिना मोटर न्यूरॉन बेसल माध्यम (100 μL / अच्छी तरह से) जोड़ें। मोटर न्यूरॉन भेदभाव के दिन 28 तक हर दूसरे दिन चरण 7.2 को दोहराएं। सप्ताहांत के दौरान किसी भी मीडिया परिवर्तन की आवश्यकता नहीं होती है। चित्रा 1: माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में मोटर इकाई प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध अवलोकन। मोटर न्यूरॉन भेदभाव प्रोटोकॉल 22 की समयरेखा के अनुसार दिन 0 से दिन 28 तक भेदभाव समयरेखा और सह-संस्कृति अवलोकन। आईपीएससी से मोटर न्यूरॉन भेदभाव दिन 0 पर शुरू किया जाता है और जैसा कि पहले कहा गया है कि निम्नलिखित 10 दिनों के लिए किया जाता है। दिन 9 पर, डिवाइस को स्टरलाइज़ किया जाता है और पीएलओ-लैमिनिन के साथ लेपित किया जाता है। MABs T75 फ्लास्क में विस्तार के लिए thawed हैं। 10 वें दिन, मोटर न्यूरॉन-एनपीसी को दोनों कुओं और डिवाइस के एक डिब्बे (हल्के भूरे) के चैनल में चढ़ाया जाता है, जहां मोटर न्यूरॉन्स में उनका भेदभाव एक सप्ताह तक जारी रहता है। एमएबी को 17 वें दिन दोनों कुओं और विपरीत डिब्बे (गहरे भूरे) के चैनल में चढ़ाया जाता है। दिन 18 पर, मायोट्यूब में एमएबी भेदभाव शुरू हो जाता है। 21 वें दिन, डिवाइस के माइक्रोग्रूव्स के माध्यम से मोटर न्यूरॉन-न्यूराइट ध्रुवीकरण को बढ़ावा देने के लिए एक वॉल्यूमेट्रिक और केमोटैक्टिक ग्रेडिएंट स्थापित किया जाता है। मोटर न्यूरॉन डिब्बे को विकास कारकों (हल्के हरे रंग के डिब्बे) के बिना मोटर न्यूरॉन बेसल माध्यम का 100 μL / अच्छी तरह से प्राप्त हुआ, जबकि मायोट्यूब डिब्बे को 30 ng / mL विकास कारकों (गहरे हरे रंग के डिब्बे) (तालिका 2 और तालिका 3) के साथ मोटर न्यूरॉन बेसल माध्यम का 200 μL / अच्छी तरह से प्राप्त हुआ। संस्कृति को वॉल्यूमेट्रिक और केमोटैक्टिक ग्रेडिएंट के साथ अतिरिक्त 7 दिनों के लिए जारी रखा जाता है जब तक कि दिन 28 पर विश्लेषण नहीं किया जाता है। ब्राइट-फील्ड छवियां दिन 0, दिन 11, दिन 18, और दिन 28 पर सेल आकृति विज्ञान दिखाती हैं जो पूर्व-इकट्ठे माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में सुसंस्कृत होती हैं। स्केल बार, 100 μm. इस आंकड़े को Stoklund Dittlau, K. et al.18 से संशोधित किया गया है। कक्ष चित्र स्मार्ट सर्वर मेडिकल Art22 से संशोधित किए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 8. फिक्सेशन और आईसीसी नोट: न्यूरोनल संस्कृतियों की टुकड़ी को रोकने के लिए सभी चरणों को सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए। निम्न चरणों के दौरान चैनलों से तरल को न निकालें। एक धुएं हुड या लैमिनर प्रवाह में निर्धारण करें: फिक्सेशन से पहले डीपीबीएस के साथ डिवाइस में सभी कुओं को एक बार ध्यान से धोएं। डीपीबीएस में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) का उपयोग करके लैमिनर प्रवाह (100 μL / अच्छी तरह से) में आरटी पर 15-20 मिनट के लिए ठीक करें।सावधानी: पीएफए विषाक्त है: व्यक्तिगत सुरक्षा त्मक उपकरणों के साथ एक धुएं के हुड में संभालें। डिवाइस के शीर्ष कुएं में सावधानीपूर्वक 100 μL जोड़ें और नीचे अच्छी तरह से 100 μL जोड़ने से पहले फिक्सेशन समाधान को चैनल के माध्यम से प्रवाहित करने की अनुमति देने के लिए कुछ सेकंड प्रतीक्षा करें। दूसरी तरफ दोहराएं। इनक्यूबेशन बाद, पीएफए समाधान को हटा दें और धीरे से डीपीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए 3x धोएं। भंडारण के लिए 200 μL / अच्छी तरह से DPBS में छोड़ दें और आईसीसी प्रयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए पैराफिल्म के साथ 10 सेमी पेट्री डिश को सील करें।नोट:: सुनिश्चित करें कि डिवाइस संग्रहण के दौरान सूख नहीं है। आईसीसी प्रक्रिया के दिन 1 पर आरटी में 20 मिनट के लिए DPBS में 0.1% ट्राइटन एक्स -100 के एक permeabilization समाधान (100 μL / अच्छी तरह से) के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। Permeabilization समाधान निकालें, और आरटी पर 30 मिनट के लिए 0.1% Triton X-100 / DPBS समाधान (100 μL / अच्छी तरह से) में 5% सामान्य गधा सीरम जोड़ें। 5% सामान्य गधा सीरम समाधान निकालें, और 0.1% Triton X-100 / DPBS समाधान में 2% सामान्य गधा सीरम में प्राथमिक एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका) के साथ उपकरणों को इनक्यूबेट करें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। वॉल्यूम ग्रेडिएंट लागू करें. माइक्रोग्रूव्स के एक तरफ एंटीबॉडी समाधान के 100 μL / अच्छी तरह से जोड़ें और दूसरे पर 150 μL / अच्छी तरह से (प्रति डिवाइस 500 μL कुल)।नोट: माइक्रोग्रूव्स के दोनों ओर विभिन्न एंटीबॉडी का उपयोग करना संभव है। इस मामले में, डिब्बों के बीच तरल पदार्थ अलगाव को बनाए रखने के लिए माइक्रोग्रूव्स में प्राथमिक या माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ वॉल्यूम ग्रेडिएंट को लागू न करें। माइक्रोग्रूव्स में न्यूराइट्स ग्रेडिएंट के बिना दाग नहीं होंगे। अगले दिन (आईसीसी प्रक्रिया का दिन 2), प्राथमिक एंटीबॉडी को हटा दें और 0.1% ट्राइटन एक्स -100 / डीपीबीएस समाधान के साथ 5 मिनट के लिए डिवाइस को सावधानीपूर्वक 3x धोएं।नोट: आसानी से detachable संस्कृतियों में, 5 मिनट के लिए 3x धोने 30 मिनट के लिए 1x के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। अब से अंधेरे में काम करें, क्योंकि द्वितीयक एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका) प्रकाश संवेदनशील हैं। 0.1% ट्राइटन X-100/ DPBS समाधान में 0.1% सामान्य गधे के सीरम में द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को RT पर 1 h के लिए इनक्यूबेट करें। चरण 8.3.1 में बताए गए वॉल्यूम ग्रेडिएंट को लागू करें। इनक्यूबेशन बाद, द्वितीयक एंटीबॉडी को हटा दें और DPBS के साथ 5 मिनट के लिए 3x धोएं। DPBS (100 μL / अच्छी तरह से) में DAPI के साथ परमाणु डीएनए को RT पर 20 मिनट के लिए लेबल करें, इसके बाद 0.1% ट्राइटन X-100 / DPBS समाधान के साथ 5 मिनट धोने के 3x-4x के बाद। सभी कुओं से 0.1% ट्राइटन एक्स -100 / डीपीबीएस समाधान को हटा दें और सील करने के लिए प्रत्येक कुएं में फ्लोरोसेंट बढ़ते मीडिया की एक बूंद जोड़ने से पहले संस्कृति को कुछ सेकंड के लिए सूखने दें।नोट:: बढ़ते मीडिया को सेट करने की अनुमति देने के लिए कम से कम 24 ज के लिए डिवाइस क्षैतिज रखें। 24 घंटे के बाद, उपकरणों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड केस में संग्रहीत किया जा सकता है। एक उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ z-स्टैक में छवि। NMJs छवि करने के लिए, एक myotube एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका) के साथ चिह्नित myotubes का पता लगाने के लिए एक 40x उद्देश्य का उपयोग करें और न्यूरोनल और मायोट्यूब ऊतक इमेजिंग सुनिश्चित करने के लिए z-स्टैक रिकॉर्डिंग करें। मामले में कई छवियों ले लो myotube भी एक ही फ्रेम में फिट करने के लिए बड़ा है. NMJ परिमाणीकरण के लिए, मैन्युअल रूप से प्रत्येक z-स्टैक के माध्यम से एक न्यूरोनल प्रीसिनेप्टिक मार्कर और एक एसीएचआर मार्कर के बीच सह-स्थानीयकरण की संख्या की गणना करें। z-स्टैक में मौजूद मायोट्यूब की संख्या के लिए सह-स्थानीयकरणों की संख्या को सामान्य करें। 9. निर्धारण और SEM के लिए डिवाइस की तैयारी नोट: तरल पदार्थ बदलते समय, सेल पतन से बचने के लिए संस्कृति को कवर करने के लिए हमेशा एक छोटी राशि रखें। यह प्रोटोकॉल अत्यधिक विषाक्त पदार्थों का उपयोग करता है, और पूरी प्रक्रिया के दौरान व्यक्तिगत सुरक्षाउपकरणों के साथ और धुएं के हुड में काम करना आवश्यक है। फिक्सेशन और डिसअसेंबली: 0.1 एम सोडियम कैकोडिलेट बफर (पीएच 7.6) में ताजा 2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड (जीए) तैयार करें, 0.2 μm फिल्टर के साथ फ़िल्टर करें, और 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।सावधानी: GA और सोडियम cacodylate विषाक्त हैं: व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के साथ एक धुएं के हुड में संभाल। मीडिया और सेल मलबे को हटाने के लिए DPBS के साथ डिवाइस को सावधानीपूर्वक एक बार धोएं और फिर आरटी पर 15 मिनट के लिए जीए समाधान के साथ उपसर्ग करें। संदंश के साथ डिवाइस को स्थिर करते समय डिवाइस की परिधि में SEM शीट को सावधानीपूर्वक काटने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि काटने के दौरान डिवाइस को अलग न करें। एक 3 सेमी पेट्री डिश के लिए संदंश की मदद से डिवाइस और SEM शीट ले जाएँ और आसान हैंडलिंग के लिए एक 10 सेमी डिश में 3 सेमी डिश जगह। उपसर्ग के 15 मिनट के बाद, संदंश का उपयोग करके SEM शीट से डिवाइस को सावधानीपूर्वक हटा दें। डिवाइस को एक कोने में अलग करें और धीरे-धीरे इसे विपरीत कोने की ओर एक विकर्ण दिशा में हटा दें। डिवाइस से अलग कोशिकाओं का निरीक्षण करें। 3 सेमी डिश में पूरे SEM शीट को कवर करने के लिए अतिरिक्त GA समाधान जोड़ें और RT पर या 4 °C पर रात भर में कुल 2 h के लिए निर्धारण जारी रखें।नोट: धीरे किसी भी सेल-कवर सतहों से बचने के द्वारा संदंश के साथ GA समाधान के तहत SEM पत्रक धक्का। SEM के लिए एक मानक प्रोटोकॉल के साथ जारी रखें। संक्षेप में, ओस्मियम टेट्रोक्साइड में इनक्यूबेट करें, इसके बाद इथेनॉल की एक श्रेणीबद्ध श्रृंखला के साथ निर्जलीकरण होता है। महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने के लिए एक coverslip धारक में SEM शीट डालें और कार्बन स्टिकर और कोटिंग के लिए समर्थन स्टब्स पर माउंट करें। 5 kV के त्वरित वोल्टेज और 7 मिमी की एक कामकाजी दूरी पर छवि के लिए एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। 10. लाइव सेल कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग कर NMJ कार्यक्षमता का आकलन तैयार डिवाइस: 200 μL के साथ मायोट्यूब डिब्बे को ताज़ा करें / दिन 18 मोटर न्यूरॉन बेसल माध्यम के साथ 30 एनजी / एमएल बीडीएनएफ, जीडीएनएफ, और सीएनटीएफ के साथ और मोटर न्यूरॉन डिब्बे के साथ 200 μL / अच्छी तरह से मोटर न्यूरॉन बेसल माध्यम विकास कारकों के बिना (तालिका 2 और तालिका 3)। 5 μM की अंतिम एकाग्रता पर मायोट्यूब डिब्बे में Fluo-4 डाई विलायक में पतला Fluo-4 AM डाई जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में डिवाइस को इनक्यूबेट करें, 25 मिनट के लिए 5% CO2। जबकि डिवाइस इनक्यूबेशन के तहत है, 450 एमएम की अंतिम एकाग्रता पर विकास कारकों के बिना मोटर न्यूरॉन बेसल माध्यम में पोटेशियम क्लोराइड को पतला करें।नोट: Fluo-4 AM एक कैल्शियम संकेतक है, जो कैल्शियम बाइंडिंग पर प्रतिदीप्ति में वृद्धि को दर्शाता है। अब से अंधेरे में काम करें, क्योंकि डाई प्रकाश संवेदनशील है। 25 मिनट के बाद, 200 μL / दिन के अच्छी तरह से 18 मोटर न्यूरॉन बेसल माध्यम के साथ मायोट्यूब डिब्बे को ताज़ा करें BDNF, GDNF, और CNTF के 30 ng / mL के साथ और मोटर न्यूरॉन डिब्बे के साथ मोटर न्यूरॉन बेसल माध्यम के 100 μL / अच्छी तरह से विकास कारकों के बिना केमोटैक्टिक और वॉल्यूमेट्रिक ग्रेडिएंट को फिर से स्थापित करने के लिए। NMJs को अवरुद्ध करने के लिए, AChR प्रतिस्पर्धी विरोधी ट्यूबोक्यूरारिन हाइड्रोक्लोराइड पेंटाहाइड्रेट के 19 μM के साथ मायोट्यूब कम्पार्टमेंट माध्यम को पूरक करें।सावधानी: Tubocurarine हाइड्रोक्लोराइड pentahydrate विषाक्त है: व्यक्तिगत सुरक्षा त्मक उपकरणों के साथ एक धुएं हुड में संभाल। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% CO2 के लिए समायोजित एक इनक्यूबेटर के साथ सुसज्जित एक उल्टे confocal माइक्रोस्कोप के साथ रिकॉर्डिंग प्रदर्शन। एक 10x उद्देश्य के साथ, myotube डिब्बे में myotubes का पता लगाने के लिए उज्ज्वल क्षेत्र चैनल का उपयोग करें। लेजर शक्ति को समायोजित करें, लाभ और 488 चैनल के लिए ऑफसेट एक स्तर पर जहां Fluo-4 प्रतिदीप्ति व्यक्तिगत मायोट्यूब को चिह्नित करता है।नोट:: प्रतिनिधि परिणाम 5% की लेजर शक्ति, 60 (HV) का लाभ, और 0 का एक ऑफसेट करने के लिए सॉफ़्टवेयर की A1 सेटिंग्स में स्क्रॉल सलाखों को समायोजित करके प्राप्त किए गए थे। रिकॉर्डिंग समय को 1 s अंतराल के साथ 1 मिनट के लिए सेट करें। बेसलाइन होने के लिए 5-10 एस के लिए रिकॉर्ड करें, इसके बाद पोटेशियम क्लोराइड समाधान के साथ मोटर न्यूरॉन्स को तुरंत उत्तेजित करें। रिकॉर्डिंग में 5-10 सेकंड के बाद, धीरे-धीरे 50 एमएम की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए मोटर न्यूरॉन डिब्बे के एक कुएं में पोटेशियम क्लोराइड समाधान के 25 μL जोड़ें।नोट: पोटेशियम क्लोराइड समाधान को बहुत तेजी से जोड़ने से बचें क्योंकि यह चैनल के माध्यम से एक लहर बनाएगा, जिससे रिकॉर्डिंग पर कलाकृतियां पैदा होंगी। एक 2 मिनट के ठहराव के साथ दो बार मोटर न्यूरॉन उत्तेजना के साथ मायोट्यूब डिब्बे को रिकॉर्ड करें, इसके बाद मोटर न्यूरॉन विध्रुवीकरण से स्वतंत्र प्रत्यक्ष मायोट्यूब गतिविधि का आकलन करने के लिए मायोट्यूब डिब्बे के 25 μL पोटेशियम क्लोराइड समाधान के साथ प्रत्यक्ष उत्तेजना के बाद। परिमाणीकरण के लिए, रिकॉर्डिंग सॉफ़्टवेयर के साथ मैन्युअल रूप से प्रत्येक मायोट्यूब को सर्कल करें और 1-मिनट की समय अवधि में Fluo-4 फ्लोरोसेंट तीव्रता का विश्लेषण करें। कैल्शियम की आमद में वृद्धि को निर्धारित करने के लिए, पोटेशियम क्लोराइड के साथ उत्तेजना के बाद शिखर मूल्य से औसत आधारभूत मूल्य (यानी, पोटेशियम क्लोराइड उत्तेजना से पहले पहले पहले 10 एस से औसत) घटाएं। प्रतिनिधि परिणाम सॉफ़्टवेयर के समय मापन उपकरण का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे।