यह प्रोटोकॉल फॉर्मलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक नमूनों की प्रतिशत ट्यूमर सामग्री को बढ़ाने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है।
फॉर्मलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) ऊतकों में दूषित गैर-ट्यूमर ऊतकों की उपस्थिति जीनोमिक अध्ययनों को बहुत कमजोर कर सकती है। यहां हम मैक्रोडिसेक्शन का वर्णन करते हैं, एक विधि जिसे डाउनस्ट्रीम न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण करने से पहले अवांछित ऊतक को हटाकर और समाप्त करके ऊतक नमूने की प्रतिशत ट्यूमर सामग्री को बढ़ाने के लिए डिज़ाइन किया गया है। एफएफपीई ऊतक ब्लॉक 4-5 μm स्लाइड-घुड़सवार ऊतक वर्गों का उत्पादन करने के लिए विभाजित थे। हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला होने के लिए एक प्रतिनिधि अनुभाग प्रस्तुत किया गया था और बाद में एक बोर्ड-प्रमाणित रोगविज्ञानी द्वारा समीक्षा की गई थी। समीक्षा के दौरान, रोगविज्ञानी ने एच एंड ई में ट्यूमर ऊतक के क्षेत्रों की पहचान की और चिह्नित किया। एक बार पूरा होने के बाद, चिह्नित एच एंड ई का उपयोग एक ही ऊतक ब्लॉक से धारावाहिक के लकीर को निर्देशित करने के लिए किया गया था। मैक्रोडिसेक्शन के प्रभावों को प्रदर्शित करने के लिए, मिलान किए गए मैक्रोडिसेक्टेड और गैर-विच्छेदित फैलाना बड़े बी-सेल लिंफोमा (डीएलबीसीएल) से निकाले गए आरएनए को डीएलबीसीएल उपप्रकार और बीसीएल 2 अनुवाद स्थिति निर्धारित करने में सक्षम डिजिटल जीन अभिव्यक्ति परख पर चलाया गया था। परिणामों से पता चला है कि मैक्रोडिसेक्शन ने जांच किए गए नमूनों में से 60% में उपप्रकार या बीसीएल 2 अनुवाद स्थिति कॉल को बदल दिया। अंत में, न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण से पहले ट्यूमर संवर्धन करने के लिए मैक्रोडिसेक्शन एक सरल और प्रभावी तरीका है, जिसके उत्पाद को तब डाउनस्ट्रीम जीनोमिक अध्ययनों में आत्मविश्वास से उपयोग किया जा सकता है।
फॉर्मलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) ऊतक, सामान्य नैदानिक नैदानिक प्रक्रिया के हिस्से के रूप में एकत्र किए गए और नैदानिक ऊतक भंडारों में बनाए रखा गया, कैंसर अनुसंधान सहित मानव अनुसंधान के लिए एक विशाल संसाधन का प्रतिनिधित्व करते हैं1. जैसे-जैसे मानव रोग की हमारी समझ गहरी होती जा रही है, यह तेजी से स्पष्ट होता जा रहा है कि बीमारियां, जिन्हें पहले रूपात्मक और इम्यूनोफेनोटाइपिकल विशेषताओं के आधार पर एकल संस्थाएं माना जाता था, वास्तव में अलग-अलग आणविक उपप्रकारों में शामिल हैं जिनके लिए आणविक सबटाइपिंग परख की आवश्यकता होती है। नतीजतन, इन उपप्रकारों को समझने में सक्षम उच्च संवेदनशीलता जीनोमिक परख तेजी से महत्वपूर्ण हो गए हैं2. यद्यपि एफएफपीई ऊतक निर्धारण से संबंधित मुद्दों के कारण जीनोमिक तकनीकों के साथ खराब संगत होने के लिए प्रसिद्ध हैं, क्योंकि प्रौद्योगिकी और प्रोटोकॉल विकसित होते हैं, ये तकनीकें इस नैदानिक रूप से सर्वव्यापी ऊतक प्रारूप 3,4,5 के साथ तेजी से संगत हो रही हैं। हालांकि, एफएफपीई ऊतक अक्सर ट्यूमर और गैर-ट्यूमर ऊतक सामग्री के मिश्रण होते हैं, जहां गैर-ट्यूमर सामग्री की उपस्थिति अक्सर अवांछित होती है और यदि उच्च अनुपात में मौजूद होती है, तो जीनोमिक विश्लेषण6 के परिणामों को काफी कमजोर और प्रभावित कर सकती है। दरअसल, 60% की न्यूनतम ट्यूमर सामग्री का उपयोग अक्सर ऐसे विश्लेषणों के लिए किया जाता है, जहां इस सीमा से कम पड़ने वाले ऊतकों को बाहर रखा जा सकता है, अन्यथा अध्ययनमानदंडों को पूरा करने के बावजूद 7. यह दुर्लभ रोग सेटिंग्स में विशेष रूप से समस्याग्रस्त हो सकता है, जहां रोगी के ऊतक कीमती होते हैं और उच्च संख्या में इकट्ठा करना मुश्किल होता है।
मैक्रोडिसेक्शन एक ऐसी विधि है जो सामान्य ऊतक की मात्रा को कम करके कम ट्यूमर सामग्री के प्रभाव को कम करतीहै 3. न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण से पहले इस तरह की भ्रामक गैर-ट्यूमर सामग्री को हटाने से ट्यूमर प्रतिशत सामग्री में काफी वृद्धि हो सकती है और इस प्रकार निकाले गए न्यूक्लिक एसिड की ट्यूमर शुद्धता बढ़ सकती है। ऊतक लकीर गंभीर रूप से विशेषज्ञ रोग समीक्षा पर निर्भर करता है, जिसमें ट्यूमर क्षेत्र की पहचान की जाती है और बोर्ड-प्रमाणित रोगविज्ञानी8 द्वारा ताजा उत्पन्न हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) दाग ऊतक अनुभाग पर परिक्रमा की जाती है। सर्कल किए गए एच एंड ई का उपयोग क्रमशः अवांछित और लक्ष्य ऊतकों को हटाने और संग्रह का मार्गदर्शन करने के लिए किया जाता है। यह प्रोटोकॉल मेयो क्लिनिक में एड्स और कैंसर नमूना संसाधन (एसीएसआर) तकनीकी कोर प्रयोगशाला में किए गए ऊतक कटाई के माध्यम से पैथोलॉजिकल समीक्षा से मैक्रोडिसेक्शन के चरणों का वर्णन करता है।
एफएफपीई ऊतक अक्सर ट्यूमर और गैर-ट्यूमर ऊतकों के विषम मिश्रण होते हैं। उच्च संवेदनशीलता जीनोमिक परीक्षण नैदानिक और अनुसंधान दोनों सेटिंग्स में तेजी से प्रचलित हो रहे हैं, लेकिन दूषित गैर-ट्यूमर ऊतक की उपस्थिति से भ्रमित हो सकते हैं। दरअसल, जीनोमिक अध्ययन के लिए अक्सर 60% की न्यूनतम ट्यूमर सामग्री की सिफारिश की जाती है। प्रतिशत ट्यूमर ट्यूमर सामग्री द्वारा कब्जा कर लिया ऊतक के क्षेत्र या ऊतक के भीतर ट्यूमर कोशिकाओं के अनुपात से निर्धारित किया जा सकता है। यद्यपि क्षेत्र द्वारा ट्यूमर ट्यूमर शुद्धता के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला मीट्रिक है, यह हमेशा ऊतक के सटीक विवरण को चित्रित नहीं करता है। दो ऊतकों पर विचार करें, दोनों 1000 कोशिकाओं के साथ, जिनमें से 500 ट्यूमर कोशिकाएं हैं। ऊतक ए में, 500 गैर-ट्यूमर कोशिकाएं ट्यूमर कोशिका के समान मात्रा के साथ स्ट्रोमल कोशिकाएं होती हैं। इस ऊतक में, ट्यूमर का प्रतिशत कोशिकीयता और क्षेत्र दोनों द्वारा 50% माना जा सकता है। ऊतक बी में, 500 गैर-ट्यूमर कोशिकाएं वसा कोशिकाएं होती हैं जो ट्यूमर कोशिका के 4 गुना होती हैं। इस ऊतक में, प्रतिशत ट्यूमर अभी भी सेलुलरता द्वारा 50% है लेकिन क्षेत्र द्वारा 20% है। एक तीसरा ऊतक, ऊतक सी, 500 ट्यूमर कोशिकाओं और 400 वसा कोशिकाओं और 800 स्ट्रोमल कोशिकाओं से बना होता है जो क्रमशः ट्यूमर कोशिकाओं के 4x और 0.5x होते हैं। यह देखते हुए कि 100 वसा कोशिकाएं 800 स्ट्रोमल कोशिकाओं की मात्रा के बराबर होती हैं, ऊतक सी का प्रतिशत ट्यूमर सेलुलरिटी (500/1700) द्वारा 29% है लेकिन फिर भी क्षेत्र द्वारा 20% है। ऊतक डी में 1x, 4x और 0.1x की मात्रा अनुपात के साथ ट्यूमर, वसा और स्ट्रोमल कोशिकाएं भी शामिल हैं। हालांकि, कोशिकाओं की संख्या क्रमशः 400, 10 और 720 है। इस प्रकार, ऊतक डी का प्रतिशत ट्यूमर सेलुलरिटी (400/1130) द्वारा 35% है लेकिन क्षेत्र द्वारा 78% है। ये उदाहरण अत्यधिक सरलीकृत हैं और वास्तविक दुनिया के ऊतक रचनाओं को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं, लेकिन स्पष्ट रूप से ऊतक संरचना के महत्व और क्षेत्र और सेलुलरता द्वारा ट्यूमर सामग्री के बीच अंतर को व्यक्त करते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि जब डाउनस्ट्रीम न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के लिए ट्यूमर सामग्री को समृद्ध करने की बात आती है, तो ट्यूमर कोशिकाओं की तुलना में अधिक गैर-ट्यूमर कोशिकाओं से जीनोमिक सामग्री निकालने की बढ़ती भ्रामक क्षमता के कारण ट्यूमर सेलुलरिटी अधिक महत्वपूर्ण विशेषता है। यह न केवल प्रतिशत सेलुलरता के संदर्भ में ऊतकों की ट्यूमर सामग्री का आकलन करने की आवश्यकता को रेखांकित करता है, बल्कि गैर-ट्यूमर ऊतक के किसी भी संभावित नकारात्मक प्रभाव को कम करने के लिए अवांछित ऊतक को उत्पादित करने की आवश्यकता को भी रेखांकित करता है। ऊतक संवर्धन के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं, जिनमें मुख्य मैक्रोडिसेक्शन और माइक्रोडिसेक्शन हैं।
मैक्रोडिसेक्शन, इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि, अपेक्षाकृत त्वरित, सरल है, और महंगे या विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है। यद्यपि मैक्रोडिसेक्शन ट्यूमर सामग्री में काफी सुधार कर सकता है, यह समझना महत्वपूर्ण है कि यह गैर-ट्यूमर सामग्री को पूरी तरह से समाप्त नहीं करता है। मैक्रोडिसेक्शन का उद्देश्य अवांछित ऊतक से उपजी “शोर” को कम करने के लिए अवांछित ऊतक के बहिष्कार के माध्यम से ब्याज के ऊतक को पर्याप्त रूप से समृद्ध करना है, जो बदले में ब्याज के ऊतक से ब्याज के संकेत को बढ़ा सकता है। इस प्रकार, मैक्रोडिसेक्शन मध्यस्थता ट्यूमर संवर्धन ब्याज के मार्करों, विशेष रूप से कम बहुतायत या खराब अभिव्यक्ति के साथ ट्यूमर-विशिष्ट आणविक मार्करों का बेहतर पता लगाने के लिए सिग्नल-टू-शोर अनुपात को बढ़ाने का एक तरीका है। हालांकि, रेजर ब्लेड जैसे मोटे उपकरणों द्वारा दी जाने वाली सटीकता की कमी के कारण मैक्रोडिसेक्शन की सीमाएं हैं और पैथोलॉजिस्ट के मार्कर की लाइन मोटाई से उपजी सटीक मुद्दों के साथ-साथ पैथोलॉजिस्ट एच एंड ई सीमांकन का पता लगाते समय संभावित त्रुटियों के लिए अतिसंवेदनशील है। जैसा कि ऊपर बताया गया है, ट्यूमर के भीतर एम्बेडेड अंतर्निहित और ट्यूमर-उत्प्रेरण स्ट्रोमल तत्वों (यानी, संयोजी ऊतक, स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट, रक्त वाहिकाओं, सौम्य प्रतिक्रियाशील लिम्फोसाइट्स, मैक्रोफेज) की उपस्थिति के कारण 100% ट्यूमर शुद्धता प्राप्त करना संभव नहीं है। दरअसल, कई आक्रामक या फैलाने वाली घुसपैठ की दुर्दमताएं एक मजबूत डेस्मोप्लास्टिक स्ट्रोमल प्रतिक्रिया को प्रेरित करती हैं, जिसके परिणामस्वरूप ट्यूमर कोशिकाओं के समूह होते हैं जो स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट और अन्य गैर-नियोप्लास्टिक सेल प्रकारों के साथ घनिष्ठ रूप से मिश्रित होते हैं; जहां इस स्ट्रोमल प्रतिक्रिया पैटर्न से जुड़े ट्यूमर, जैसे कि अग्नाशयी कैंसर के ऊतक21, मैनुअल मैक्रोडिसेक्शन के बजाय डिजिटल रूप से निर्देशित माइक्रोडिसेक्शन से अधिक लाभ उठा सकते हैं।
मैनुअल माइक्रोडिसेक्शन एक माइक्रोस्कोप के तहत सुई या स्केलपेल का उपयोग करके ऊतकों विशिष्ट कोशिकाओं या आबादी की पहचान, विच्छेदन और अलगाव में सहायता के लिए किया जाता है और मैक्रोडिसेक्शन22 पर बढ़ी हुई सटीकता का लाभ होता है। हालांकि, मैनुअल माइक्रोडिसेक्शन एक श्रमसाध्य प्रक्रिया है जिसमें कम ट्यूमर सामग्री या जटिल विशेषताओं वाले जटिल ऊतकों के लिए आवश्यक चालाकी का अभाव होता है जो मैनुअल विच्छेदन के साथ असंगत होते हैं। लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन जैसे उच्च परिशुद्धता स्वचालित तरीकों का उपयोग करके ऐसे ऊतकों को विच्छेदित किया जा सकता है। दरअसल, डिजिटल रूप से निर्देशित माइक्रोडिसेक्शन को अग्नाशय के कैंसर के ऊतकों में मैनुअल मैक्रोडिसेक्शन की तुलना में उच्च प्रतिशत ट्यूमर सामग्री उत्पन्न करने के लिए दिखाया गयाहै 23. हालांकि, इन उच्च परिशुद्धता स्वचालित तरीकों की कमियों, जैसे कि विशेष, महंगे उपकरण और उच्च प्रशिक्षित व्यक्तियों की आवश्यकता ने वर्कफ़्लो में इसके समावेश में बाधा डाली है। जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग पर मैक्रोडिसेक्शन और लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम) के प्रभावों की तुलना में डी ब्रुइन एट अल के एक अध्ययन में पाया गया कि एलसीएम नमूनों में कुल आरएनए पैदावार (30 एनजी औसत) कम थी और सीडीएनए लाइब्रेरी प्रेप इनपुट थ्रेसहोल्ड24 को पूरा करने के लिए एमआरएनए प्रवर्धन के दो दौर की आवश्यकता थी। लेखकों ने पाया कि परिणामस्वरूप एलसीएम जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल एमआरएनए प्रवर्धन के दौर से प्रभावित थे, मैक्रोडिस्केक्टेड प्रोफाइल की तुलना में गैर-ट्यूमर स्ट्रोमल योगदान से प्रभावित थे और निष्कर्ष निकाला कि विश्वसनीय जीन अभिव्यक्ति डेटा24 उत्पन्न करने के लिए मैक्रोडिसेक्शन का पर्याप्त रूप से उपयोग किया जा सकता है।
नैनोस्ट्रिंग डिजिटल जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग का एक महत्वपूर्ण लाभ, खासकर जब अत्यधिक अपमानित एफएफपीई व्युत्पन्न आरएनए के साथ काम करते हैं, तो यह है कि इसे आरएनए प्रवर्धन या सीडीएनए पुस्तकालयों की तैयारी जैसी एंजाइमी निर्भर प्रक्रियाओं की आवश्यकता नहीं होती है। हालांकि, परख आमतौर पर कुल आरएनए25,26 के 50-300 एनजी के बीच इनपुट के लिए अनुकूलित होते हैं, जो डी ब्रुइन एट अल 24 के निष्कर्षों के आधार पर, ऊतक इनपुट को बढ़ाए बिना माइक्रोडिसेक्टेड ऊतकों के साथ संगत नहीं हो सकता है; एक युग में एक प्रतिकूल मांग जहां ऊतक के नमूने सर्जिकल रिसेक्शन के बजाय छोटे बायोप्सी के रूप में तेजी से एकत्र किए जाते हैं। डीएलबीसीएल 90 परख के लिए उपयोग किए जाने वाले आरएनए इनपुट मैक्रोडिसेक्टेड और गैर-विच्छेदित ऊतकों दोनों के लिए 68.5-300 एनजी से लेकर थे। परिणाम बताते हैं कि मैक्रोडिसेक्शन के परिणामस्वरूप जांच किए गए 60% नमूनों में कॉल परिवर्तन हुए और मैक्रोडिसेक्टेड नमूनों के आरएनए इनपुट के बावजूद इन परिवर्तनों को देखा गया। हालांकि, कम आरएनए इनपुट के लिए सीओओ संभावना ने सीओओ जीसीबी / यूएनसी संभावना कॉल थ्रेसहोल्ड का अतिक्रमण किया, जहां थ्रेसहोल्ड जीसीबी के लिए 0 से <0.1, यूएनसी के लिए 0.1-0.9 और एबीसी कॉल20 के लिए >0.9 से 1.0 है। प्रमुख डीएलबीसीएल सीओओ उपप्रकार जीसीबी और एबीसी हैं, जो सभी डीएलबीसीएल मामलों का 41% और 44% बनाते हैं, यूएनसी दोनों के मध्यवर्ती समूह का प्रतिनिधित्व करता है और एबीसी सबसे आक्रामक 20,27 है। इस प्रकार, जबकि नमूना सी के मैक्रोडिसेक्शन पर सीओओ कॉल परिवर्तन ने जीसीबी से एबीसी तक सीओओ उपप्रकार में स्पष्ट परिवर्तन का कारण नहीं बना, जीसीबी से यूएनसी में परिवर्तन अधिक आक्रामक बीमारी की ओर बदलाव का सुझाव दे सकता है। इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से संकेत मिलता है कि यूएनसी उपप्रकार केवल एक मध्यवर्ती उपप्रकार नहीं है और इसमें संभावित रूप से उपप्रकार-विशिष्ट चिकित्सीय रूप से शोषण योग्य विशेषताएं हो सकती हैं28. इसी तरह, नमूनों ए और ई के मैक्रोडिसेक्शन ने डीएच नकारात्मक से डीएच पॉजिटिव, या इसके विपरीत डीएचआईटीएसआईजी कॉल में स्पष्ट परिवर्तन का कारण नहीं बना। तथापि, एनईजी से यूएनक्लास तक जीसीबी नमूना (नमूना ए) और मैक्रोडिसेक्शन पर यूएनक्लास से एनईजी तक एबीसी नमूना (नमूना ई) की गतिविधियां जैविक रूप से उपयुक्त हैं क्योंकि बीसीएल 2 से जुड़े डबल हिट ट्रांसलोकेशन को विशेष रूप से जीसीबी घटना19 बताया गया है। यद्यपि नैदानिक सेटिंग्स में फिश द्वारा पारंपरिक रूप से और सर्वव्यापी रूप से ट्रांसलोकेशन का पता लगाया जाता है, लेकिन उनके पता लगाने के लिए एक वैकल्पिक कम शामिल और समय लेने वाली विधि की पहचान करने के लिए एक बढ़ती गति है। डीएलबीसीएल 90 परख एक महत्वपूर्ण उपकरण है जो इस आवश्यकता को संबोधित करता है, जहां इसके उपयोग के लिए तर्क को इस खोज से मजबूत किया जाता है कि यह परख नैदानिक निदान29 में उपयोग की जाने वाली मछली जांच के लिए गुप्त अनुवाद का पता लगाने में सक्षम है।
ऊपर वर्णित मैक्रोडिसेक्शन प्रोटोकॉल एक सरल विधि की रूपरेखा तैयार करता है जो शोधकर्ताओं को ऊतक के नमूनों की ट्यूमर सामग्री को बढ़ाने में सक्षम बनाता है जो आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले अध्ययन समावेशन मानदंड थ्रेसहोल्ड से नीचे गिर जाएगा। एक अध्ययन वर्कफ़्लो में मैक्रोडिसेक्शन को शामिल करना शोधकर्ताओं को अपने ट्यूमर सामग्री को बढ़ाकर अध्ययन बहिष्करण से खराब ट्यूमर-घने ऊतकों को उबारने में सक्षम बनाता है। बदले में, यह बढ़े हुए आत्मविश्वास की अनुमति देता है कि परिणामस्वरूप आरएनए और डीएनए जीनोमिक जांच के तहत ट्यूमर का प्रतिनिधित्व करते हैं। यद्यपि ऊतक विच्छेदन के लिए अन्य अधिक सटीक तरीके मौजूद हैं, ट्यूमर के लिए जो अधिक विशाल, गैर-घुसपैठ, शीट-जैसे या ठोस फैशन में बढ़ते हैं, मैक्रोडिसेक्शन संभवतः पर्याप्त है। यहां प्रस्तुत परिणाम इसे प्राप्त करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण के रूप में जीनोमिक परख और मैक्रोडिसेक्शन में ट्यूमर शुद्धता के महत्व को उजागर करते हैं।
The authors have nothing to disclose.
यह काम एनआईएच द्वारा वित्त पोषित एड्स और कैंसर नमूना संसाधन (एसीएसआर, यूएम 1 सीए 181255-2) द्वारा अपने जैव-नमूने विज्ञान कार्यक्रम के तहत समर्थित है। वीडियो को फिल्माया गया था और मेयो क्लिनिक मीडिया सर्विसेज द्वारा पोस्ट-प्रोडक्शन संपादन किया गया था।
200-proof ethanol | Decon | 2701 | |
AllPrep DNA/RNA FFPE Kit | Qiagen | 80234 | DNA/RNA FFPE extraction kit |
Coplin pots | Various | x | |
DLBCL90 probes | NanoString | various | Digital gene expression profiling based DLBCL90 assay |
d-Limonene | VWR | 89376-092 | |
Forceps | Various | x | |
Glass micrscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
Glycerol | VWR | 0854-1L | |
Master kits | NanoString | various | |
Microtome | Leica | RM2265 | |
Microtubes | Ambion | AM12400 | |
NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONE-W | Spectrophotometer for DNA, RNA and protein qualitation |
nCounter | NanoString | x | Digital gene expression profiling platform used to run the DLBCL90 assay |
Permanent marker | Electrib Microscope Sciences | 72109-12 | |
Razor blade dispenser | Electrib Microscope Sciences | 71985-10 | |
Razor blades | Electrib Microscope Sciences | 71985-23 | |
Tissue digestion buffer | Qiagen | 80234 | |
Ultrapure water | VWR | SH30538.02 | |
Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |