Plaquing de Vírus Herpes Simplex
Summary
Plaquing é um método de rotina usado para quantificar vírus vivos em uma população. Embora o plaquing seja frequentemente ensinado em vários currículos de microbiologia com bactérias e bacteriófagos, o plaquamento de vírus mamíferos é mais complexo e demorado. Este protocolo descreve os procedimentos que funcionam de forma confiável para o trabalho regular com vírus herpes simplex.
Abstract
Existem inúmeros protocolos publicados para plaquamento de vírus, incluindo referências dentro da literatura primária para metodologia. No entanto, plaquing vírus pode ser difícil de executar, exigindo foco em suas especificações e refinamento. É um método incrivelmente desafiador para novos alunos dominarem, principalmente porque requer uma atenção meticulosa aos detalhes mais minuciosos. Essa demonstração de plaquamento de vírus herpes simplex deve ajudar aqueles que têm lutado para visualizar o método, especialmente suas nuances, ao longo dos anos. Embora este manuscrito se baseie nos mesmos princípios da metodologia de plaquing padrão, ele difere na sua descrição detalhada de (1) a melhor forma de lidar com células hospedeiras para evitar interrupções durante o processo, (2) um meio viscoso mais útil do que surgiu para limitar a difusão de virions, e (3) um simples procedimento de fixação e coloração que produz resultados relisivelmente reprodutíveis. Além disso, o vídeo que acompanha ajuda a demonstrar as distinções mais finas no processo, que são frequentemente perdidas ao instruir outros sobre a realização de ensaios de placa.
Introduction
Os primórdios dos ensaios da placa do vírus remontam às primeiras descobertas de vírus na década de 18901. O vírus do mosaico do tabaco foi primeiro isolado e transmitido sobre as folhas de tabaco, onde as manchas individuais de infecção poderiam ser reconhecidas e quantificadas como originárias de uma única entidade de vírus vivo2, posteriormente identificada como virion2. Estudos seminais posteriores com bactérias e bacteriófagos aperfeiçoaram as técnicas usadas para aplacar esses vírus, incluindo bactérias na fase de crescimento de tronco médio, diluição serial de amostras de bacteriófago, e ágar superior com visualização subsequente de buracos literais (placas nomeadas) no gramado bacteriano3.
O plaquamento de vírus animais atrasou a emocionante pesquisa que está sendo conduzida com bacteriófagos, principalmente porque os métodos necessários para o cultivo de células de mamíferos na cultura não foram desenvolvidos até a década de 19404. No entanto, o advento do crescimento das células murinas na ausência de todo o organismo hospedeiro4 gerou uma nova era na capacidade de cultura e contagem de vírus. Tal trabalho foi estendido para a propagação e quantitação do vírus da Encefalomielite Equina Ocidental em células de frango e poliovírus em células humanas5,6. À medida que o reino das células mamíferas culturable se expandiu, o bando de diferentes células hospedeiras para várias infecções virais deu ao mundo uma cornucópia de possibilidades de estudar todos os tipos de vírus7. Isso incluiu a propagação e quantificação de herpesvírus humanos, particularmente herpes simplex vírus-1 (HSV-1) e -2 (HSV-2), que causam lesões mucocutâneas8. É importante ressaltar que todos os ensaios de placa dependem da existência de virions vivos, que podem entrar em células hospedeiras de forma mediada por receptores em uma amostra9. Independentemente da onipresença e da multiplicidade de publicações sobre a execução de ensaios de placa5,10,11,12,13,14,15,16, esses métodos para O HSV-1/2 são uma mistura de arte e ciência; não se pode conduzir o ensaio sem a devida atenção a cada detalhe no protocolo, nem se pode executar um ensaio bem sucedido sem um olhar crticial para a sutileza no processo. Este manuscrito retrata um dos métodos mais consistentemente reprodutíveis para ensaios de placas HSV-1/2, com detalhes precisos para a arte do ensaio que raramente são discutidos.
Este protocolo atual obtém as contagens de unidades de formação de placas vivas (PFU) para HSV-1 e -2 de forma confiável. Os melhores resultados são obtidos utilizando células Vero (células epiteliais de macaco verde africano transformado) em baixa passagem (abaixo da passagem número 155) e cultivados rotineiramente em alfa-MEM17 suplementados com soro de bezerro fetal 10% (FCS), L-alanyl-L-glutamina, e uma mistura antibiótico/antimíctico18. As células vero são padronizadas neste meio de duas a três vezes por semana a uma diluição de 1/5 cada vez.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora os ensaios de placa sejam quase tão antigos quanto a própria cultura celular de mamíferos, parece que cada laboratório tem seu próprio conjunto de protocolos para executar este ensaio básico5,6,10,11,12,13,14,15,16,20 <sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a inúmeros alunos de nossos laboratórios (PJD e BJM) que trabalharam conosco ao longo dos anos refinando esses métodos. Um agradecimento especial a Stan Person, sob cuja tutela esta metodologia foi desenvolvida pela primeira vez. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo fundo de apoio à pesquisa da Towson University Fisher College of Science and Math E nigms Bridges para a bolsa baccalaureate 5R25GM058264. Este conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde.
Materials
| 12-well plates | Corning | 3512 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
| Antibiotic/antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| Crystal violet | Alfa Aesar | B2193214 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++) | Gibco | 14190144 | |
| Fetal calf serum | Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Gibco | GS07F161BA | |
| Hemacytometer | Thermo Fisher | 02-671-54 | |
| Methylcellulose | Millipore-Sigma | 27-441-0 | |
| Quaternary agent (Lysol I.C.) | Thermo Fisher | NC9645698 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 |
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