原代小胶质细胞培养常用于评估新的抗炎分子。本方案描述了一种可重复且相关的方法，用于从新生幼鼠中通过磁珠分离小胶质细胞。
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本文内容
摘要
摘要
小胶质细胞作为脑内常驻的巨噬细胞，在多种生理功能中发挥关键作用，包括应对环境应激和维持脑内稳态。小胶质细胞可呈现出广泛的活化表型。此外，表现出促炎表型的小胶质细胞与神经发育障碍及神经退行性疾病均有关联。体外研究被广泛用于评估特定细胞类型中潜在治疗策略的有效性。在此背景下，相较于小胶质细胞系或干细胞来源的小胶质细胞，利用原代小胶质细胞培养进行体外小胶质细胞活化及神经炎症研究更具相关性。然而，某些原代培养方法可能存在可重复性不足的问题。本实验方案提出了一种可重复且有效的方法，即通过磁珠分选技术从新生幼鼠中分离小胶质细胞。本文展示了在刺激后4小时和24小时，通过mRNA表达定量及Cy3标记微球吞噬实验来评估小胶质细胞活化状态的方法。本研究旨在提供一种简便且可重复的技术，用于从幼年发育阶段动物中分离出具有生理相关性的小胶质细胞。
引言
小胶质细胞是中枢神经系统中定居的巨噬细胞样细胞，起源于卵黄囊的造血前体细胞，在胚胎早期发育过程中迁移至神经上皮1。除了免疫功能外，它们在神经发育过程中也发挥重要作用，特别是在突触形成、神经元稳态和髓鞘化过程中2。在成年期，小胶质细胞会延伸出长长的细胞突起，持续地扫描周围环境。当出现稳态破坏情况，如脑损伤或脑部疾病时，小胶质细胞可改变其形态，转变为阿米巴样形状，迁移至损伤区域，并增加释放多种细胞保护性或细胞毒性因子。小胶质细胞的活化状态具有异质性，取决于其发育阶段以及所受损伤的类型3,4,5。本研究中，这些活化状态被宽泛地分为三种不同表型：促炎/吞噬性、抗炎性和免疫调节性，但需注意实际情况可能更为复杂6。
研究 体内 由于（1）断奶前动物的脆弱性以及（2）小胶质细胞数量较少，脑发育早期阶段的小胶质细胞活化及神经保护策略筛选可能具有挑战性。因此 体外 小胶质细胞研究广泛用于毒性评估7,8,
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方案
本方案已获批准，所有动物操作均遵循法国国家健康与医学研究院（Inserm）的机构指南。实验从24只P8阶段的OF1小鼠幼崽（雌雄均有）脑组织中分离小胶质细胞，并将其接种于6孔、12孔或96孔板中。实验操作均在超净工作台内进行，以维持无菌条件。
1. 分离和细胞培养用无菌溶液的制备
- 使用市售的10倍浓度溶液（参见材料表），配制50 mL不含Ca2+和Mg2+的1×Hanks平衡盐溶液（HBSS-/-）。
- 使用市售组织解离试剂盒（参见材料表），按照表1中提供的组分配制解离混合液。
- 使用市售的10倍浓度溶液，配制200 mL含Ca2+和Mg2+的1×HBSS（HBSS+/+）。
- 配制200 mL含0.5% BSA的1×PBS（以下简称细胞分选缓冲液）。
- 按照表2配制CD11b-磁珠。
- 配制500 mL无血清巨噬细胞培养基（SFM）并加入1%青霉素-链霉素（P/S）。分装至50 mL离心管中，4 °C保存。后续文本中将此培养基称为小胶质细胞培养基。
注....
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结果
小胶质细胞是中枢神经系统中的常驻巨噬细胞，在暴露于环境刺激（如创伤、毒性分子、炎症）时会被激活。4,5,6,34 (图3A). 体外 小胶质细胞研究常用于评估与这些环境刺激相关的细胞自主机制，并表征药物或遗传干预后的活化状态。本文介绍一种利用磁珠偶联法分离幼年阶段原代小胶质细胞的技术。
小胶质细胞活化的简易检测方法 体外 旨在定量检测多种与促炎表型相关的 小胶质细胞反应性标志物 的 mRNA 表达水平（Cd86、Nos2、Ptgs2、Tnf 或抗炎表型（Cd206、Igf1、Arg1、Lgasl35,
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讨论
本研究采用磁珠分选CD11b+细胞的方法建立了原代小胶质细胞培养体系。除了对小胶质细胞功能进行评估（RT-qPCR和吞噬功能检测）外，还测定了小胶质细胞培养的纯度。
经典的原代小胶质细胞培养通常来源于出生后第1至第2天（P1或P2）的啮齿类动物幼鼠脑组织，并与星形胶质细胞共培养至少10天。随后通过轨道摇床进行机械分离以获取小胶质细胞。小胶质细胞的分离与培养方法 体外 在20世纪90年代末首次从小鼠幼鼠的大脑中被描述40,41自那时起，该方法被广泛用于分析小胶质细胞表型，例如活化/静息状态的小胶质细胞或促炎性/抗炎性小胶质细胞。此外，该实验对于界定与神经元共培养时小胶质细胞的神经毒性作用具有基础性意义。然而，2014年，Biber 及其合作者描述了研究小胶质细胞存在的三个显著缺陷 体外 使用传统方法42.(1) 本实验使用大鼠/小鼠新生脑组织（P1/P2），这些细胞未经历所有可能的成熟.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
图示使用 BioRender 制作。本研究由法国国家健康与医学研究院（Inserm）、巴黎大学、欧盟“地平线2020”计划（PREMSTEM-874721）、法国基金会、ARSEP 基金会、大脑研究基金会、摩纳哥格蕾丝基金会，以及“未来投资计划”（Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS 和 Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.）的额外资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗小鼠 ACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| 抗小鼠 CD11b BV421 | 索尼生物技术 | 1106255 | |
| 抗小鼠 CD45 BV510 | 索尼生物技术 | 1115690 | |
| 抗小鼠 CX3CR1 PE Cy7 | 索尼生物技术 | 1345075 | |
| 抗小鼠 NeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
| 抗小鼠O4 Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-120-016 | |
| BD Cytofix/Cytoperm 透化试剂盒 | BD 生物科学 | 554655 | |
| 牛血清白蛋白 | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| CD11b（小胶质细胞）MicroBeads，人源，鼠源 | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| 共聚焦显微镜 | Leica TCS SP8 | ||
| D-PBS（10倍浓度） | 赛默飞世尔科技 | 14200067 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Falcon 细胞培养 12 孔板，平底 + 盖子 | Dutscher | 353043 | |
| Falcon 细胞培养 96 孔板，平底，带盖 | Dutscher | 353072 | |
| 50 mL Falcon管 | Dutscher | 352098 | |
| Fc阻断试剂（小鼠CD16/32） | BD 生物科学 | 553142 | |
| 荧光显微镜 | 尼康 ECLIPSE TE300 | ||
| gentleMACS C 管（4 × 25 支） | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo 组织解离器（带加热模块） | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS) +CaCl₂2 +MgCl2 10x | 赛默飞世尔科技 | 14065049 | |
| Hanks' 平衡盐溶液（HBSS）-CaCl₂2 -MgCl2 10x | 赛默飞世尔科技 | 14185045 | |
| iQ SYBR 绿色超级混合液 | Bio-rad | 1725006CUST | |
| Iscript cDNA 合成 | Bio-rad | 1708890 | |
| 荧光红色氨基修饰聚苯乙烯乳胶微球 | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
| 脂多糖（LPS）来自 大肠杆菌 O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
| Macrophage-SFM 无血清培养基 | 赛默飞世尔科技 | 12065074 | |
| MACS BSA 储存液 | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS SmartStrainer（70 μ米），4 × 25 件 | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| 小鼠 IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
| 小鼠 IgG2a PE Cy7 | 索尼生物技术 | 2601265 | |
| 小鼠 IL1β | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
| 多-24 柱块 | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
| MultiMACS Cell24 分离器 | Miltenyi Biotec | ||
| 神经组织解离试剂盒 - 木瓜蛋白酶 | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
| Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
| Nun EZFlip Top 锥形离心管 | 赛默飞世尔科技 | 362694 | |
| OPTILUX 培养皿 - 100 × 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| Pé青霉素-链霉素（10 000 U/mL） | 赛默飞世尔科技 | 15140122 | |
| 大鼠 IgG2b，k BV421 | BD 生物科学 | 562603 | |
| 大鼠 IgG2b，k BV510 | 索尼生物技术 | 2603230 | |
| REA对照（S）PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
| REA对照（S）Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
| 重组小鼠 IFN-γ 蛋白 | R&D系统 | 485-MI | |
| 重组小鼠 IL-10 蛋白 | R&D系统 | 417-ML | |
| 重组小鼠 IL-4 蛋白 | R&D系统 | 404-ML | |
| RIPA缓冲液 | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| 活力探针（FVS780） | BD 生物科学 | 565388 |
参考文献
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
- Wright-Jin, E. C., Gutmann, D. H. Microglia as dynamic cellular mediators of brain functio....
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