ここでは、ホールマウント免疫染色、多光子顕微鏡、および3D可視化および分析を使用した定量的および定性的な分析のために、卵巣全体をイメージングするための最適化されたプロトコルを紹介します。このプロトコルは、毒物学、臨床診断、および卵巣機能のゲノムアッセイに適用可能な、高スループットで信頼性が高く、再現性のある処理に対応します。
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この記事について
サマリー
要約
女性の生殖能力と生殖寿命は、卵巣卵母細胞予備の質と量に依存します。減数分裂前期Iに入る雌生殖細胞の推定80%は、胎児卵母細胞消耗(FOA)および出生後生の最初の週に排除される。3つの主要なメカニズムは、発達中に生存し、思春期に入る女性の卵巣予備能を確立する卵母細胞の数を調節する。卵母細胞喪失の第1波では、卵母細胞の30〜50%が初期のFOA中に排除され、これは高い長い散在核元素-1(LINE-1)発現に起因する現象である。卵母細胞喪失の第2の波は、減数分裂品質チェックポイントによる減数分裂欠損を有する卵母細胞の排除である。卵母細胞喪失の第3波は、いくつかの卵母細胞が卵胞を形成できないときに、原始卵胞形成中に周産期に起こる。卵母細胞喪失のこれら3つの波のそれぞれを調節するものと、それらがマウスまたはヒトのいずれかの卵巣予備をどのように形成するかは不明のままである。
免疫蛍光と3Dビジュアライゼーションは、あまり情報量の少ない2Dセクションではなく、卵巣全体のコンテキストで卵母細胞の発生を画像化および分析するための新しい道を開きました。この記事では、全卵巣免疫染色および光学的クリアリングのための包括的なプロトコルを提供し、多光子顕微鏡を使用したイメージングおよび市販のソフトウェアを使用した3Dモデリングのための調製物を得る。C57BL/6Jマウスにおける卵巣発生中の卵母細胞消耗のダイナミクスを示し、卵母細胞排除の3つの波の間の卵母細胞喪失を定量化するために、この方法をどのように使用できるかを示す。このプロトコルは、卵母細胞の視覚化および定量化、ならびに他の定量的アプローチのために、出生前および出生後卵巣に適用することができる。重要なことに、このプロトコルは、毒物学、臨床診断、および卵巣機能のゲノムアッセイにおけるニーズを満たすことができる、高スループットで信頼性が高く、再現性のある処理に対応するために戦略的に開発されました。
概要
ほとんどの哺乳類の雌は、卵巣予備(OR)を構成する原始卵胞内に貯蔵された有限数の減数的に停止した卵母細胞で生まれます1,2。ORは、女性の全体的な生殖寿命と健康状態を決定します3.ORは通常、加齢とともにサイズが減少し、特定の遺伝毒性物質(放射線/化学療法)および環境ストレス(栄養失調)への曝露により早期に枯渇し、不妊症につながる可能性がある4,5,6。特発性女性不妊症は、ORから発達する卵の遺伝的および生理学的品質に起因することが多く、あまり理解されていない7,8。雌卵胞の授乳は出生によって大部分があらかじめ決められているため、ORの確立と維持に関与する調節メカニズムを理解することが不可欠です。
マウスにおいて、OR形成は、胚日(E)7.52の周りの始原生殖細胞(PGC)の仕様から始まる。PGCは生殖器の隆起に移動し、そこで約E10.59が常....
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プロトコル
使用した全てのマウスは、遺伝子株C57BL/6Jのものであった( 材料表参照)。この株は完全に配列決定されており、卵巣の構造と機能に関する多くの研究の標準です。マウスはNIHガイドラインに従って飼育され、実施された手順はジャクソン研究所の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認された。このプロトコールで使用される試薬および組成物は、それぞれ 材料 表および 表1に列挙されている。
1. 試薬の調製
- 固定液:1x PBS中に4%パラホルムアルデヒド(PFA)を調製する。例えば、24サンプル(0.5 mL/サンプル = 12 mL 全体)の場合、16% PFA 電子顕微鏡グレードの 3 mL を 1x PBS の 9 mL に加えます。
- 透過処理バッファー
- 透過処理バッファーが必要になる前日に、1x PBS を含む 250 mL のプラスチックビーカーにポリビニルアルコール (PVA) を測定します。PVAが完全に溶解するように溶液を一晩攪拌する。
- 溶解したPVAに水素化ホウ素ナトリウムを加え、混合物を約3〜5分間均質化させる。溶液が泡立つことを期待してください。
- 溶液にTriton X-100を加え、Triton X-100が溶解したらバッファーを使用します。
注:PVAは....
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結果
卵巣全体の免疫染色およびイメージングは、同じ技術およびマーカーを使用して、異なる発生段階における卵巣における卵母細胞またはタンパク質発現の可視化および定量を可能にする(図3)。このプロトコルは、複数の段階での卵巣の分析と複数のマウス系統からの卵巣の分析が必要な大規模プロジェクトのために開発されました。ここでは、遺伝子解析の標準株であるC57BL6/J株について収集したデータを紹介します。ここで提示された技術は単純であり、結果は14〜19日以内に得ることができ(図2D)、出生前、思春期前、および思春期の雌からの卵巣に使用することができる(図1および図2A、B)。
このアプローチは、卵巣卵母細胞予備の形成中に自然に起こる卵母細胞喪失のダイナミクスを研究するために使用された。マウスを含む多くの生物において、卵母細胞数は.......
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ディスカッション
この記事では、生殖細胞定量とタンパク質局在化のためのハイスループットおよび比較研究のための出生前および出生後の卵巣の詳細な3D免疫染色およびイメージングプロトコルを紹介します。我々は、卵巣(N=6-12)の卵母細胞数を、2-4個の24ウェルプレートが通常一度に処理される10-16個の異なる株の6つの発生時点で分析するために開発した。この方法は、他の器官または細胞マーカーに適合させることができる。例えば、このプロトコルは、適切な抗体を使用して、卵巣内の顆粒膜細胞などの体細胞を標識および視覚化するために使用でき、体細胞間相互作用の研究または他の卵巣細胞タイプの開発を容易にする。
このプロトコールと抗体の組み合わせの1つの制限は、異なる濾胞段階の決定的な同定である。顆粒膜細胞核の層によって濾胞期を同定するために免疫蛍光および2Dイメージングに使用されるDNA染色は、3Dアプローチには不十分である。4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)またはヘキストは、大きな組織の中央で限られた光浸透および減衰信号のために、全臓器染色にはほとんど使用されない。ヨウ化プロピジウム(PI)は.......
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開示事項
著者らは、開示する利益相反はありません。
謝辞
この研究は、国立衛生研究所の助成金(R01 HD093778からE.B-FおよびT32 HD007065からR.B)によって支援されました。放射線実験に協力してくれたザカリー・ブーシェに感謝します。原稿を批判的に読んでくれたメアリー・アン・ヘンデルに感謝します。私たちは、この出版物に記載されている顕微鏡検査作業の専門家の支援に対するジャクソン研究所のSonia Erattupuzhaと顕微鏡コアサービス、および3Dプリントされたアダプタースライドの設計のためのジャクソン研究所の科学機器サービスのJarek Trapszoの貢献に感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 卓上インキュベーター | Benchmark Scientific | H2200-H | 37 °Cインキュベーター |
| ウシ血清アルブミン(BSA) | VWR | 97061-416 | |
| C57BL/6J | ジャクソン研究所 | 000664 | マウス近交系 |
| メチルスルホキシド(DMSO) | Sigma-Aldrich | D1435 | 危険物 |
| D-ソルビトール | Sigma-Aldrich | S6021 | |
| デュモン #5 鉗子 | FST | 91150-20 | |
| FastWells 試薬バリア | GraceBio | 664113 | 粘着性があり柔軟性のあるシリコーンガスケット(粘着性ウェル) |
| ファインハサミ | FST | 91460-11 | |
| グリセロール | Sigma-Aldrich | G2025 | |
| グリシン | サーモフィッシャーサイエンティフィック | BP381-500 | |
| ヤギ抗ウサギIgG(H+L)交差吸着二次抗体 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21246 | 希釈率 1:1000 |
| ヤギ抗ラット IgG (H+L) 交差吸着二次抗体 Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21434 | 希釈率 1:1000 |
| ヤギ血清 | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| IMARIS ソフトウェア | Oxford Instruments | バージョン 9.7.0 | 画像可視化および解析ソフトウェア |
| Insight X3 | Spectra-Physics | InSight X3 多 | 光子イメージング用 |
| LASXソフトウェア | ライカ | バージョン3.5.6 | 画像取得ソフトウェア |
| ライカ DIVE/4TUNE/FALCON | ライカ | ライカ Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406 | 多光子顕微鏡 |
| MaiTai HP | Spectra-Physics | Mai Tai DeepSee One Box 多 | 光子イメージング用 |
| マスターフレックスポンプコントローラー | SPW工業 | モデル:7553-50 | 灌流 |
| メイヨーはさみ | FST | 14010-17 | 5 "&ndashのための蠕動ポンプ;7インチ斬首用鈍い/鈍いはさみ |
| マイクロカバーグラス スクエア No. 1.5 25x25mm | VWR | 48366-249 | |
| ミニバイオミキサー | ベンチマーク 科学 | B3D1020 | シェーカー/ニューテーター 37 °Cインキュベーター |
| Nikon Ergonomic SMZ1270 | Leica | SMZ1270 | 実体顕微鏡 |
| パラホルムアルデヒド 16% (ホルムアルデヒド水溶液) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 危険物 |
| PBS 錠剤、リン酸緩衝生理食塩水 | ThermoFisher Scientific | BP2944100 | Milli-Q 水に溶解 |
| ペニシリン-ストレプトマイシン、200x、デュアル抗生物質溶液 | ThermoFisher Scientific | ICN1670249 | |
| ポリビニルアルコール (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine) | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Rabbit anti-DDX4/MVH | Abcam | ab27591 | 希釈率 1:500 |
| ウサギ抗LINE-1 ORF1p | Abcam | ab216324 | 希釈率 1:500 |
| ラット anti-TRA98/GCNA | Abcam | ab82527 | 希釈 1:500 |
| アジ化ナトリウム | Sigma-Aldrich | S2002 | 危険物 |
| 水素化ホウ素ナトリウム | Sigma-Aldrich | 452882 | 危険物 |
| ショ糖 | サーモフィッシャー サイエンティフィック | S0389 | |
| Tekmar オービタル シェーカー | Bimedis | VXR-S10 | 室温用 |
| シェーカー トリエタノールアミン | Sigma-Aldrich | 90279 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| UNOLOK 輸液セット | MYCO Medical | 7001-23 | 灌流 |
| 用針 尿素 | Amresco | 97061-920 | |
| X-Cite 120LED | Excelitas | S/N XT640-W-0147 | 低電力 LED 蛍光ランプ |
参考文献
- Pelosi, E., Forabosco, A., Schlessinger, D. Genetics of the ovarian reserve. Frontiers in Genetics. 6, 308(2015).
- Pepling, M. E. From primordial germ cell to primordial follicle: mammalian female germ cell development. Genesis. 44 (12), 622-632 (2006).
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